Name: Aniônico polimerização de um copolímero anfifílicas para Preparação de copolímero em bloco As micelas estabilizada por interacções de empilhamento π-¸ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a polimerização aniônica por abertura de anel para sintetizar copolímeros em bloco anfifílicos e preparar micelas carregadas com doxorrubicina, demonstrando liberação sustentada do fármaco por quatro dias em condições fisiológicas.

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CA reconhece uma bolsa de Descoberta do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá. A CA reconhece uma cadeira em Farmacêutica e Entrega de Medicamentos da GSK. Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

<img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54422/54422fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático mostrando os nove passos fundamentais na preparação do copolímero b -PPheGE MPEG. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54422/54422fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 1. Preparação dos reagentes sob condições secas <ol><li> Preparação dos reagentes. <ol><li> Pesar 15 g de mPEG-5K (Mn = 5400 g / mol, 1,03 PDI) e colocar a 50 ° C num forno sob vácuo durante 48 horas antes da utilização. </li><li> Secas 200 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) sobre hidreto de cálcio (CaH2) (~ 1 g), coloca-se sob vácuo durante 30 min, purga de árgon e sob agitação durante 48 h antes da utilização. </li><li> Colocar 50 ml do monómero PheGE num balão limpo e seco (100 ml), adicionar 1 g de CaH 2, selo sob vácuo durante 15 minutos em gelo, sob atmosfera de árgon purgae deixar a agitar durante 24 hr sob árgon antes do uso. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do naftaleno de potássio <ol><li> Cuidadosamente, cortou pequenos pedaços de sódio (~ 1,5 g) secou-se com hexano para remover o óleo mineral e o excesso de adicionar ao balão de fundo redondo contendo o tetra-hidrofurano (THF) (V = 500 ml). NOTA: Os pedaços de sódio não deve ser exposto ao ar por muito tempo devido ao risco de incêndio. </li><li> Adicionar benzofenona (~ 5 g), purga com árgon e selar o frasco redondo (2 pescoços) de rolhas de vidro. </li><li> Após agitação sob árgon durante 24 h, ligar o balão de fundo redondo com um aparelho de destilação (Figura 2), destilar a solução escura ao refluxo, sob árgon, enquanto (por exemplo, refluxo durante cerca de um período de 2 horas após a solução torna-se azul). Comece a recolher o volume pretendido ~ 150 ml de THF, fechando a válvula esquerda (encontrada no meio do aparelho de destilação). NOTA: Se esta solução não ficar azul, parar a destilarlação, arrefecer à temperatura ambiente (RT) e adicionar mais benzofenona ou sódio e reiniciar a destilação. Esta é uma indicação de que THF ainda contém água. </li><li> Em um Erlenmeyer seco, adicionar THF destilado (V = 100 ml) e dissolvem-se 3,9 g de naftaleno. NOTA: Pare a destilação, arrefecer à temperatura ambiente e abra a válvula direito de transferir o volume de THF. </li><li> Conforme descrito no ponto 2.1, cortar pequenos pedaços de potássio (1,1 g) e adicionar à solução contendo o naftaleno (concentração final ~ 0,3 mol / L). Selar o Erlenmeyer com um adaptador de flushing (T) (on / off) com um septo no topo e purgar com árgon. </li><li> Após agitação sob árgon durante 24 h, observar a solução resultante da base de naftaleno de potássio como uma cor verde escura homogénea. </li><li> Sob condições inertes, remover uma alíquota de 5 ml da solução de base a partir do frasco com uma seringa e adicionar 10 ml de água destilada. Subsequentemente adicionar 1-2 gotas de indicador fenolftaleína, a esta solução,que transforma a solução uma cor fúcsia. </li><li> Use uma bureta para titular a solução de naftaleno de potássio com uma solução padrão de ácido clorídrico (0,1 N) até que a solução se torne incolor. </li></ol> 3. Materiais e precauções necessárias para a efetiva estar Aniônicos Polimerização <ol><li> Sistema de árgon / colector de vácuo. NOTA: Como descrito na Figura 2, um colector de vidro duplo com torneiras de vidro oco é usado para alternar entre as condições de entrega de argônio e de vácuo no vidro. <ol><li> Conecte o tanque de árgon (com manómetro) a uma coluna dessecante seco e para a linha de colector utilizando tubos de borracha inerte. Na outra extremidade da tubagem de árgon, ligar um borbulhador (contendo óleo mineral). </li><li> Para as torneiras de vidro, conecte tubos inertes flexíveis e agulhas. Para a outra linha do colector, ligar uma armadilha de vidro imerso num frasco de Dewar frio (cheio com gelo / água ou azoto líquido) a uma bomba de alto vácuo. </li&gt; </ol></li><li> Aparelho de destilação de monómero e DMSO. NOTA: Um conveniente (isto é, todos em um) aparelho para destilação sob vácuo elevado é empregue (Figura 2). O material de vidro seco é feita com válvulas de alto vácuo e condensadores built-in com uma cabeça refrigerado interior. <ol><li> Ligue o fluxo de água através da entrada (A) e de saída (B) da unidade de arrefecimento (carta). Ligue a outra entrada / saída (C) para o colector de dupla por árgon / vácuo. Adicionar e selar um septo (fios de metal) no orifício de distribuição / extracção e conectar de uma cânula de aço inoxidável para a transferência de líquidos sensíveis ao ar (D) (no topo / ciclo). </li><li> Antes da polimerização, destilar PheGE e DMSO em mantos de aquecimento hemisféricas a 100 ° C e 70 ° C, respectivamente, durante 2 horas sob vácuo com agitação. O ponto de ebulição do monómero PheGE é 254 ° C, enquanto que o ponto de ebulição de DMSO é de 189 ° C a (1 atm). </li></ol></li><li> Copos para polymerizat aniônicaíon. <ol><li> Em adição ao sistema de destilação, utilizar apenas alta artigos de vidro resistente ao vácuo incluindo rodada balões de fundo (autenticadas pelo fabricante), formou-se cilindros (para a transferência de volumes de solvente, de base e de monómeros), cânulas, septos e fios de metal para selar a septos. NOTA: Para a polimerização, o calor de estar cuidadosamente (sob vácuo) e arrefecer o material de vidro sob fluxo de árgon antes de ser utilizado. Manter a pistola de ar quente a uma distância de 10 cm ~ a partir do material de vidro. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54422/54422fig2.jpg" /> Figura 2. Montagem e principais etapas de destilação / transferência. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54422/54422fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 4. Descrição das principais etapas de estar Aniônicos Polimerização: Destilação e Transferência <ol><li> Pesar-mPEG 5K (2 mmol, 10 g) em um F secolask / Schlenk (forno), contendo uma barra de agitação e selar o adaptador de flushing (T) (on / off) com um septo no topo. </li><li> Ligar o balão ao colector e purgar o balão durante 2-3 min com ondas de argônio. Girar a válvula para a posição de vácuo para purgar o balão. </li><li> Rodar o balão manualmente e secar o recipiente de reacção de forma homogénea com um secador de sopro (pistola de calor) até mPEG 5K-derrete. NOTA: Manter a pistola de ar quente a uma distância ~ 10 cm do balão. </li><li> Após 1 min, quebrar o vácuo, rodando a válvula do distribuidor na direcção da posição de árgon com vários fechos rápidos. NOTA: Um fluxo de árgon contínua tem de ser observado no borbulhador. Quando o fluxo é contínuo, a válvula fica na posição de árgon. aquecimento e refrigeração Repita os passos duas vezes para remover todos os vestígios de humidade. </li><li> Manter o macroiniciador polimérico sob vácuo durante ~ 2 horas e sob atmosfera de árgon antes da reacção começar. </li><li> Mount dois aparelhos de destilação de alto vácuo sob o capô (Figure 2); uma para a destilação de DMSO e um para a destilação do monómero (PheGE). </li><li> Ligar os frascos separados contendo o DMSO e o monómero para os dois aparelhos e instalar cada um em uma manta de aquecimento hemisférica (ou em um banho de óleo). Ligação de água fria à parte superior do aparelho (entrada / saída) e ao colector (árgon / vácuo). </li><li> Certifique-se de que cada aparelho é seguro e bem selada. Envolver o vácuo através da válvula. NOTA:. Conforme descrito na etapa 3.3, repita os passos de aquecimento e arrefecimento duas vezes para remover todos os vestígios de humidade. </li><li> Definir o aquecimento por meio de um controlador de temperatura e iniciar agitação as soluções. Após 2 horas de circulação / destilação de DMSO, fecha a válvula de vácuo elevado (que se encontra no meio do aparelho de destilação) para recolher cerca de 20 ml de solução (para lavar o interior do aparelho). Em seguida, libertar a fracção para o balão e repetir a operação mais uma vez para assegurar a pureza da fracção desejada que é collected mais tarde. </li><li> Aquecer o balão contendo o mPEG-5K (sob vácuo) com a pistola de calor até que o polímero (mPEG-5K) derrete. Purga-se com árgon novamente. Nota: O procedimento irá ajudar a a dissolução, após a transferência do DMSO. </li><li> Após 2 h, fechar a válvula de alto vácuo e recolher o volume de solvente (DMSO V = ~ 100 ml). Parar o aquecimento e quebrar o vácuo do colector. Libertar árgon (por encaixe) para dentro da câmara, como descrito acima. </li><li> Sob uma pressão positiva de árgon, ligar um lado da cânula (preensão na torneira de passagem do dispositivo) para um cilindro graduado ou directamente para o balão contendo o mPEG-5K (se o aparelho de destilação tem graduação) e, mergulhar a outra extremidade cuidadosamente na fracção de destilado de fresco. </li><li> Usando a pressão de árgon, a unidade de DMSO através da cânula para o balão de reacção. Ligue um bubbler extra para o frasco (ou cilindro se necessário para a medição) e, feche a torneira de vidro conectado ao the borbulhador, no lado oposto da conduta de distribuição. NOTA: Quando um lado de uma cânula é retirada para a transferência, certifique-se de que a pressão de árgon positiva é aplicada. </li><li> Para evitar acidentes causados ​​por pressão de árgon, abrir a torneira de vidro durante 1-2 segundos e religar para continuar o fluxo de DMSO (repetido uma vez por cada 0,5 min) até à transferência completa é concluída. Reabrir a torneira quando terminar. NOTA: O mesmo procedimento deve agora ser seguido para destilação e recolha do monômero. O solvente e o monómero não pode ser recolhida ao mesmo tempo. </li><li> Transferência de 5 ml de potássio 0,3 M naftaleno via canulação em um cilindro graduado selado por um septo com cânula inserida (loop). NOTA: A mesma precaução conforme descrito na nota 4.13. pressão de árgon positiva deve ser mantido primeiro a partir do balão de naftaleno de potássio, para o cilindro e, em seguida, a partir do cilindro para o balão de reacção para evitar a contaminação de ar / água. </li><li> Insira outro agulha do manifold para dentro do cilindro (árgon). Remover a cânula ligada ao sistema de destilação cuidadosamente e inserir-se rapidamente no balão de reacção. NOTA: Use esta técnica para a transferência de base e monômero. </li><li> Adicionar gota a base de a gota, até a solução torna-se escura. Seguindo o lento desaparecimento de cor, adicionar uma outra parte até que a cor escura aparece novamente, e repita até que a transferência total. </li><li> Transferir o volume desejado de monómero (V PheGE = 5 mL) para atingir um grau de polimerização de PPheGE ~ N = 18-20. </li><li> Deixar a mistura reaccional durante 48 h a 80 ° C sob atmosfera de árgon, com agitação constante para assegurar uma polimerização completa. </li><li> Extingue-se a reacção por adição de gotas de HCl 1 N em metanol (medido usando papel de tornassol (pH neutro)) e observadas por um desaparecimento de cor. </li><li> Extrair o naftaleno a partir da solução de DMSO com hexano (3 x 50 ml). Remover o DMSO por destilação a vácuo ~ 70 ml (mesmo aparelho). arrulharl para baixo a solução pasta e adicionar 50 ml de THF. </li><li> Remover o sal a partir da solução de lama por centrifugação a 5000 xg durante 10 min. Transferir o sobrenadante e adicionar gota a gota a 500 ml de éter dietílico frio. </li><li> Recolhe-se o precipitado por filtração ou centrifugação (repetir duas vezes) e seco sob vácuo a 30 ° C durante 24-48 horas (rendimento de 85%). NOTA: O copolímero está agora pronto para caracterização. </li></ol> 5. Caracterização dos copolímeros <ol><li> Pesar 5-10 mg de copolímero (registro a massa real) em um prato de amostra de alumínio e selar hermeticamente com a tampa de alumínio. prato de amostra de carga e pan de referência (vazia) na calorimetria exploratória diferencial. </li><li> Programa de um método ( &quot;calor / frio / calor&quot;) ciclo: 1) aquecimento de 40 ° C a 100 ° C a 10 ° C / min, 2) arrefecer a -70 ° C a 10 ° C / min, 3) de calor a 100 ° C a 10 ° C / min. Repetir 2) e 3) duas vezes. Determinar o ponto de fusão (T m), crystallization (T C) e temperaturas de transição vítrea (Tg), e calor de fusão (AH f) a partir de vestígios térmica a partir do terceiro ciclo (se aplicável). </li><li> Dissolver os polímeros em THF (2 mg / ml) e filtrar através de um filtro de PTFE de 0,2 mm. Injectar a amostra num sistema de cromatografia de permeação em gel (50 ul) e usar o tempo de retenção para a amostra e uma curva de calibração produzida usando uma variedade de padrões de poliestireno para determinar o peso molecular do polímero. 19 </li><li> Dissolve-se os (co) polímeros (15 mg / ml) em DMSO d 6 para uma análise de espectroscopia de H-RMN. 19 </li><li> Determinar a concentração micelar crítica (CMC) do copolímero utilizando 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH) como uma sonda de fluorescência 9. <ol><li> Prepara-se uma solução stock de DPH em THF (2,32 mg / L) no escuro e adicionar 100 ul desta solução de estoque de cada um de uma série de tubos de ensaio. </li><li> Prepare uma solução de copolímero em THF e adicionar aliquotas de volume igual (2 ml) para a série de tubos de ensaio (cada uma contendo uma alíquota da solução-mãe DPH), resultando em concentrações finais que variam de copolímero de 0,01 a 1000 ^ g de copolímero / ml. </li><li> Subsequentemente, o copolímero de vórtice-DPH soluções e adicionar gota a gota a 10 ml de água duplamente destilada com agitação bar. As soluções devem ser, em seguida, agitou-se vigorosamente no escuro durante 48 h sob uma corrente de azoto para permitir evaporação lenta de THF. A concentração final de DPH em cada solução é 0,232 mg / L. </li><li> Medir a emissão de fluorescência das amostras a 430 nm (λ ex = 350 nm) utilizando um espectrofluorómetro de microplacas dupla de varrimento de trama e de fluorescência em função de log [polímero]. A intercepção entre as duas pistas lineares fornece o valor de CMC para o copolímero. </li></ol></li></ol> 6. procedimento para carregar doxorrubicina em BCMs <ol><li> Dissolve-se 12 mg de DOX em 1 ml de acetonitrile, adicionar 10 ul de trietilamina e deixar a agitar solução no escuro durante 2 horas. </li><li> Dissolve-se o copolímero (45 mg) em 1 ml de THF e agita-se durante o mesmo período de tempo. Adicionar a solução de copolímero à solução de DOX e enxaguar o frasco contendo copolímero residual com um volume adicional de THF (0,5 ml). </li><li> Adicionar a mistura de copolímero-medicamento (2,5 ml) gota a gota a um frasco (20 ml) contendo 15 ml de solução salina a 0,9% (NaCl) com agitação. </li><li> Transferir a solução para um saco de diálise (3,5 kDa cortado) e diálise contra solução salina a 0,9% (500 ml). NOTA: Alterar a solução salina externo depois de 6 horas e deixou a diálise continuar durante 24 horas com agitação no escuro a RT. </li><li> Transferir o dialisado para um tubo de 50 ml e centrifugar a 5000 xg durante 15 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para um sistema de ultraf iltração (com uma capacidade de 10 ml) que contém uma membrana de diálise (cut off 10 kDa). Coloque o adaptador mexendo no sistema de ultrafiltração, feche a tampa e aberta ao maiortream de nitrogênio. </li><li> Concentra-se a solução de BCM para um volume de 4 ml e adicionar 6 mL de solução salina fresca e repetir o procedimento duas vezes. </li><li> Concentra-se a solução de BCM para 4 ml, lavar a câmara com 0,5 ml de soro fisiológico e adiciona-se à solução. Loja em frascos castanhos a RT no antes de posterior utilização escuro. </li></ol> 7. Avaliação da doxorrubicina Carregando no DOX-BCMs <ol><li> Dissolve-DOX BCM em dimetilformamida (100 uL em 400 uL) para romper as micelas e dilui-se em solução aquosa de HCl (0,1 N) antes da avaliação (100 uL em 900 uL de HCl 0,1 N). </li><li> Medir a carga de droga a 490 nm, utilizando um sistema de bancada de microplacas espectrofotométrico. Use as seguintes equações para determinar a capacidade de carga de fármaco (DLC) e a eficiência de carga de fármaco (DLE): DLC (% em peso) = (peso de droga carregada / peso total de BCMs) x 100% DLE (%) = (peso de droga carregada / peso de droga na alimentação) x 100% </li></ol> 8. Avaliaçãode libertação in vitro de DOX de DOX-BCMs <ol><li> Investigar a libertação de DOX do BCMs a 37 ° C em solução salina 0,1 M tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) contra PBS pH 7,4 contendo 0,1% (w / v) de Tween 80, BCMs + BSA (50 mg / ml) contra PBS pH 7,4, e acetato-tampão a pH 0,1 H = 5,5. 20,21 </li><li> Dilui-se a formulação BCM-DOX (700 ul) em tampão escolhido (2,3 ml) para resultar numa quantidade total de 0,6-0,7 Å mg de DOX no saco de diálise. </li><li> Colocar a solução no saco de diálise, selar com clipes e mergulhar o saco em 200 ml de os respectivos meios externos. </li><li> Retirar 2 ml da solução do lado de fora do saco de diálise em pontos de tempo predeterminados e substituir com o mesmo volume de tampão fresco. </li><li> Armazenar as alíquotas retiradas a -20 ° C antes da análise por espectrometria de UV-Vis (Abs 490 nm). A percentagem cumulativa de fármaco libertado (E R) pode ser calculada usando a seguinte equação: <img alt= &quot;Equação1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54422 / 54422eq1.jpg&quot; /&gt; NOTA: Onde m DOX representa a quantidade de DOX nas BCMs, V 0 é o volume total do meio de libertação (200 ml), V t é o volume dos meios de comunicação substituídos (Vt = 2 ml), Ci é a concentração antes da correcção, e C N representa a concentração de DOX na amostra. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Devido a um bom controlo de polimerização aniónico que proporciona sobre o peso molecular, é um dos processos mais utilizados na indústria para a preparação de polímeros à base de monómeros oxirano (PEG e PPG). As condições óptimas e rigorosas deve ser utilizado para a polimerização com êxito para ser conseguida. purificação rigorosa de todos os reagentes e aparelhos adequados são essenciais para o personagem vivo da síntese. Limitações da configuração atual está geralmente associada à técnica de transferência que depen...

Em meios aquosos, copolímeros em bloco anfifílicos montar para formar micelas de copolímeros de blocos de tamanho nano (SGCN) que consistem de um núcleo hidrófobo rodeado por uma camada hidrófila ou corona. O núcleo da micela pode servir como um reservatório para a incorporação de fármacos hidrófobos; enquanto, a coroa hidrofílica fornece uma interface entre o núcleo e o meio externo. Poli (etileno glicol) (PEG) e seus derivados são uma das mais importantes classes de polímeros e um dos mais amplamente utilizados na formulação de fármaco. 1-3 BCMs provaram ser uma plataforma de entrega de droga digno com várias formulações contando com este tecnologia agora em desenvolvimento clínico de fase tardia. 4 Mais vulgarmente, o bloco hidrofóbico do copolímero é constituído por poli-caprolactona, poli (D, L-lactido), poli (óxido de propileno) ou poli (β-benzil-L-aspartato). 5 -9 O grupo de Kataoka investigado micelas esféricas formadas a partir de b PEO- </em&gt; -PBLA E poli (óxido de etileno) - b -. (Doxorrubicina conjugado-ácido poliaspártico) para entrega da doxorrubicina (DOX) 10,11 Em seus relatórios, eles dizem que as interações π-¸ entre a droga polímero conjugado ou PBLA e DOX livre actuar para estabilizar o núcleo micelar resultando em aumentos da carga e retenção da droga. É estabelecido que a compatibilidade ou interações entre uma droga e o bloco formando-core são determinantes de parâmetros-chave relacionados com o desempenho 12 Além de DOX., Uma série de cancro terapêutica incluem anéis aromáticos dentro da sua estrutura de núcleo (por exemplo, metotrexato, olaparib, SN -38). Como resultado, existe um interesse significativo na síntese de copolímeros que incluem anéis de benzilo em seus blocos de formação de núcleo. Polimerização de PEG e os seus derivados aniónicos de abertura de anel permitir o controlo sobre o peso molecular e resulta em materiais de baixa polidispersão com um bom rendimento. 13,14 éthyleóxido de ne com éter fenil glicidílico (PheGE) ou óxido de estireno (SO) pode ser (co) polimerizado para formar copolímeros em bloco que formam micelas para a solubilização de fármacos hidrofóbicos. 15-18 O presente relatório descreve os passos necessários para viver polimerização aniônica de fenil glicidil monómero de éter em mPEG-OH como macroiniciador (Figura 1). O copolímero em bloco resultante e seus agregados são então caracterizados em termos de propriedades relevantes para a utilização na entrega da droga.

<table><tbody><tr><td>DMEM/HAMF12</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12500</td><td>Suplementado com 10% de FBS. Quente em 37 > C banho-maria.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>Quente em 37 &deg; C Soro</td></tr><tr><td>bovino fetal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Origem do Canadá</td></tr><tr><td>MDA-MB-468 Linha celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>MTS reagente de tetrazólio</td><td>PROMEGA</td><td>G111B</td><td></td></tr><tr><td>Etossulfato de fenazina (PES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4544</td><td>>95%</td></tr><tr><td>mPEG5K (Mn 5.400 g/mol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81323</td><td>PDI=1,02</td></tr><tr><td>Dimetilsolfoxida (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td> <td>> 99,5%</td></tr> <tr><td>Naftaleno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147141</td> <td>> 99%</td></tr> <tr><td>Éter fenil glicidílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A32608</td> <td>> 85%</td></tr> <tr><td>Benzofenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>427551 ></td> <td>99%</td></tr> <tr><td>Potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451096</td><td>>98%</td></tr><tr><td>Produtos</td><td>químicos de laboratório de Caledon</td> de tetrahidrofurano <td>8900 1</td><td>Produtos</td></tr><tr><td>químicos de laboratório de Caledon</td><td>de hexano</td> ACS <td>5500 1</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Hidreto de cálcio (CaH2)</td><td>ACP</td><td>C-0460</td><td>>99,5%</td></tr> <tr><td>Éter dietílico</td><td>Caledon Produtos químicos de laboratório</td><td>1/10/4800</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calorimetria de varredura diferencial (DSC)</td><td>TA Instruments Inc</td><td>DSC Q100</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia de permeação em gel (GPC)</td><td></td><td>Molde de separação Waters 2695 / detector 2414&nbsp;</td><td>2 Colunas: Agilent Plgel 5 &micro; m</td></tr><tr><td>Espectroscopia de RMN</td><td>Mixed-D Varian Mercury 400MHz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio-d</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151858</td><td>99,96%</td></tr> <tr><td>DMSO-d</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156914</td><td>99,96%</td></tr> <tr><td>Bomba de vácuo</td><td>Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc.</td><td></td><td>Pressão final 1x10-4 torr</td></tr><tr><td>Drierit com indicador, 8 mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238988</td><td>Regenerado a 230&nbsp; &deg; C por 2 horas</td></tr></tbody></table>

aniônico polimerização de um copolímero anfifílicas para preparação de copolímero em bloco as micelas estabilizada por interacções de empilhamento π-¸

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

Neste estudo, um copolímero anfifílico que inclui um bloco de formação de núcleo, com grupos fenilo foi sintetizado por polimerização aniónica vivo de éter fenil glicidílico (PheGE) em metoxi-polietileno-glicol (MPEG-b -PPheGE). Caracterização do copolímero revelou uma distribuição estreita molecular (PDI &lt;1,03) e confirmado o grau de polimerização de mPEG 122 - b - (PheGE) 15. A concentração crítica de micelas de copolimero foi avaliada usando um método de fluorescência estabelecida com o comportamento de agregação avaliada por dispersão dinâmica de luz e microscopia electrónica de transmissão. O potencial do copolímero para o uso em aplicações de distribuição de droga foi avaliada de uma forma preliminar, incluindo biocompatibilidade in vitro, o carregamento e a libertação da doxorrubicina hidrofóbico de drogas anti-cancro (DOX). Uma formulação micelar estável de DOX foi preparado com níveis de carga de fármaco até 14% (% em peso), carga de fármaco efficiacetatos&gt; 60% (w / w) e de libertação sustentada de fármaco durante 4 dias sob condições f isiologicamente relevantes (pH ácido e neutro, a presença de albumina). O nível de carga elevada de droga de libertação sustida e é atribuída a estabilizar as interacções entre π ¸-DOX e o bloco de formação de núcleo das micelas.

<img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54422/54422fig3.jpg" /> Figura 3. Ilustração da polimerização aniónica de éter de glicidilo de mPEG fenil macroiniciador para produzir MPEG-b - (PheGE) 15 para a preparação de micelas de copolímero em bloco para o carregamento de doxorrubicina O esquema ilustra a desprotonação do grupo hidroxilo de mPEG utilizando naftaleno de potássio....

Os principais passos da vida polimerização aniônica de éter fenil glicidílico (PheGE) sobre metoxi-polietileno glicol (MPEG-b -PPheGE) são descritos. As micelas de copolímero em bloco resultante (SGCN) foram carregados com doxorrubicina 14% (% em peso) e de libertação sustentada de fármaco durante 4 dias sob condições f isiologicamente relevantes foi obtido.

Aniônico polimerização de um copolímero anfifílicas para Preparação de copolímero em bloco As micelas estabilizada por interacções de empilhamento π-¸

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

O objetivo geral deste trabalho é demonstrar os passos essenciais necessários para a síntese de materiais de copolímero em bloco por polimerização aniônica de abertura de anel e mostrar o fluxo necessário de estudos para a formulação de micelas de copolímero em bloco com um fármaco hidrofóbico. Este protocolo demonstra a execução adequada dos passos e procedimentos necessários para a síntese de copolímero em bloco por polimerização aniônica. A grande vantagem da abertura de anel por polimerização aniônica é a síntese de materiais com bom rendimento e baixa dispersidade polimérica.Bem como a escalabilidade do processo. Este é um momento empolgante para a liberação polimérica de fármacos. Com diversos medicamentos dependendo de formulações e micelas de copolímeros em bloco, atualmente em estágios avançados de pré-clínico ou em desenvolvimento clínico.Prepare os reagentes e os materiais para a transferência conforme descrito no protocolo textual. Pese o metoxipolietilenoglicol com peso molecular de 5.000. Adicione o mPEG em um frasco seco contendo um bastão de agitação e feche o adaptador de purgação com uma septa na parte superior.Conecte o frasco ao manifold e borbulhe argônio no frasco por dois a três minutos. Gire a válvula para a posição de vácuo para borbulhar o frasco. Gire o frasco manualmente e seque o vaso de reação de forma homogênea, com um secador de cabelo ou maçarico de calor, até que o mPEG derreta.Após um minuto, rompa o vácuo girando a válvula do manifold para a posição de Argônio com vários movimentos rápidos para resfriar o frasco. Mantenha o macroiniciador polimérico sob vácuo por aproximadamente duas horas e, em seguida, sob Argônio antes do início da reação. Em seguida, monte dois aparatos de destilação a alto vácuo que tenham sido previamente secos em uma estufa sob a capela.Um aparelho é para a destilação de DMSO e outro é para a destilação do monômero, éter de fenil glicerol. Conecte os frascos separados aos dois aparelhos e instale cada um em um manto de aquecimento hemisférico ou em banho de óleo. Conecte água fria ao topo de cada aparelho e à tubulação múltipla.Certifique-se de que cada aparelho esteja seguro e bem vedado. Ative o vácuo por meio da válvula. Ajuste o aquecimento por meio de um controlador de temperatura e inicie a agitação das soluções.Após duas horas de circulação em destilação de DMSO, feche a válvula de alto vácuo para coletar aproximadamente 20 mililitros de solução. Em seguida, libere a fração no frasco e repita a operação mais uma vez, para garantir a pureza da fração desejada que será coletada posteriormente. Aqueça o frasco contendo o mPEG sob vácuo com o maçarico até que o polímero derreta e, então, purgue novamente com argônio.Após duas horas, feche a válvula de alto vácuo e colete o volume de solvente. Pare o aquecimento e libere o vácuo a partir do manifold. Introduza Argônio na câmara, conforme descrito anteriormente.Sob pressão positiva de argônio, conecte um lado da cânula a um cilindro graduado, ou diretamente ao frasco contendo o mPEG, também sob argônio, e imerja cuidadosamente a outra extremidade na fração recém-destilada. Conecte um borbulhador adicional ao frasco, interrompa o fluxo de argônio e utilize apenas a pressão de argônio proveniente do aparato de destilação. Para evitar acidentes causados pela pressão de argônio, abra a rolha de vidro por um a dois segundos e feche novamente para continuar o fluxo de DMSO até que a transferência completa seja concluída.Em seguida, sob argônio, conecte um lado da cânula do cilindro graduado seco, vedado por um septo, a uma solução estoque de naftaleno potássio 0,3 molar. Depois, adicione um borbulhador extra ao cilindro graduado, feche o fluxo de argônio para o cilindro e, sob pressão positiva de argônio, transfira cinco mililitros de naftaleno potássio 0,3 molar por cânulação da solução estoque para o cilindro graduado. Insira outra agulha do manifold no cilindro e remova o borbulhador extra.Remova com cuidado a cânula conectada à solução estoque, insira-a rapidamente no frasco de reação e conecte um borbulhador extra. Em seguida, como descrito anteriormente, adicione a base gota a gota até que a solução escureça. Após o lento desaparecimento da cor, adicione outra porção até que a cor escura reapareça, e repita até a transferência completa.Como descrito anteriormente, transfira o volume desejado do monômero para a reação, a fim de atingir um grau de polimerização do éter glicol polifenólico de aproximadamente 18 a 20 unidades. Deixe a reação por 48 horas a 80 graus Celsius, sob atmosfera de argônio e com agitação constante, para garantir a polimerização completa. Interrompa a reação pela adição de gotas de ácido clorídrico normal e metanol, conforme observado pelo desaparecimento da cor.Extraia o naftaleno da solução de DMSO com hexano. Remova aproximadamente 70 mililitros do DMSO por destilação sob vácuo. Resfrie a solução em suspensão e adicione 15 mililitros de THF.Remova o sal da solução de suspensão por centrifugação a 5.000 vezes g durante dez minutos. Transfira o sobrenadante e adicione gota a gota a 500 mililitros de éter dietílico frio. Colete o precipitado por filtração ou por centrifugação.Após repetir a precipitação duas vezes, seque o precipitado à temperatura ambiente sob a capela, durante a noite, e depois sob vácuo a 30 graus celsius por 24 a 48 horas, obtendo um rendimento de 85%. O copolímero está agora pronto para caracterização, conforme descrito no protocolo textual. Dissolva 12 miligramas de doxorrubicina em um mililitro de acetonitrila. Adicione 10 microlitros de trietilamina e deixe a solução agitar no escuro por duas horas.Dissolva 45 miligramas do copolímero em um mililitro de THF e agite pelo mesmo período de tempo. Adicione a solução do copolímero à solução de doxorrubicina e lave o frasco contendo copolímero residual com um volume adicional de THF. Em seguida, adicione a mistura de copolímero-fármaco gota a gota a um frasco de 20 mililitros contendo 15 mililitros de solução salina 0,9% sob agitação.Transfira a solução para uma bolsa de diálise e realize a diálise contra 500 mililitros de solução salina 0,9%. Transfira o dialisado para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 5.000 × g durante 15 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um sistema de ultrafiltração que contenha uma membrana de diálise.Coloque o adaptador de agitação no sistema de ultrafiltração, feche a tampa e abra para um fluxo de nitrogênio. Concentre a solução de micelas de copolímero em bloco até um volume de quatro mililitros e adicione seis mililitros de soro fisiológico fresco. Em seguida, concentre novamente a solução de micelas de copolímero em bloco até 4 mililitros, enxágue a câmara com 0,5 mililitro de soro fisiológico e adicione ao meio.Armazene a solução resultante em frascos âmbar à temperatura ambiente e no escuro, antes de usá-la posteriormente. A polimerização aniônica por abertura de anel do éter de fenilglicerol sobre o macroiniciador mPEG foi utilizada para preparar o copolímero dibloco anfifílico por meio da protonação profunda do grupo hidroxila do mPEG. Utilizando naftaleno potássico como ânion radical, seguido da polimerização do monômero de éter de fenilglicerol.A caracterização do copolímero em bloco por cromatografia de permeação em gel e análise por espectroscopia de RMN de próton confirmou uma distribuição estreita de massa molecular com um grau de polimerização do éter de fenilglicerol de 15 unidades. Em meio aquoso, os copolímeros em bloco anfifílicos se auto-organizam formando micelas que consistem em um núcleo hidrofóbico cercado por uma camada externa hidrofílica. A microscopia eletrônica de transmissão confirmou uma morfologia esférica e a dispersão dinâmica de luz indicou um diâmetro hidrodinâmico de 25 nanômetros.A doxorrubicina foi encapsulada com sucesso nas micelas de copolímero em bloco. Em comparação com a droga protonada livre em solução, o autoextinção da doxorrubicina, observada por espectroscopia de fluorescência, confirmou a incorporação da droga nas micelas poliméricas, com uma capacidade de carregamento de até 14%. O perfil de liberação da doxorrubicina a partir das micelas de copolímero em bloco indicou boa estabilidade dessa formulação em pH neutro e liberação sustentada da droga ao longo de quatro dias em condições fisiologicamente relevantes.Uma vez dominada, esta técnica pode ajudar os alunos em ciências farmacêuticas a preparar a síntese de copolímeros dibloco para aplicação na liberação de fármacos. Este procedimento descrito aqui pode ser aplicado na síntese de uma ampla gama de copolímeros com PEG como iniciador. Aqui, a ênfase foi colocada em assegurar boas práticas de laboratório, que proporcionam condições anidras e resultam em materiais de alta qualidade.Após assistir a este vídeo, devo ter uma boa compreensão de como trabalhar em condições anidras e deveria ser capaz de aplicar essas etapas para a síntese de poliéster de PEG ou materiais de poliéster de PEG. Ao realizar qualquer uma das pesquisas descritas, é essencial lembrar que se está trabalhando em condições controladas, com solventes orgânicos potencialmente perigosos e outros agentes. Além disso, todas as substâncias químicas são tóxicas e devem ser manipuladas com as precauções necessárias.Por exemplo, usar luvas, jaleco de laboratório, sapatos fechados, bem como usar uma máscara ao pesar as drogas.

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Chemistry

Química

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Aniônico polimerização de um copolímero anfifílicas para Preparação de copolímero em bloco As micelas estabilizada por interacções de empilhamento π-¸ (Vídeo) | JoVE Journal

Aniônico polimerização de um copolímero anfifílicas para Preparação de copolímero em bloco As micelas estabilizada por interacções de empilhamento π-¸

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