Trabalhando com células auditivas HEI-OC1

O objetivo geral deste protocolo é descrever os procedimentos básicos para trabalhar com células HEI-OC1, que podem ser usados para estudar os efeitos de drogas farmacológicas em células auditivas e auxiliar na caracterização funcional da proteína motora prestina. As células HEI-OC1 são usadas por muitos pesquisadores ao redor do mundo em diferentes experimentos com diferentes objetivos e usando diferentes técnicas. Espera-se que os procedimentos descritos aqui forneçam uma base comum para tornar esses estudos comparáveis.

Claro, esses procedimentos experimentais podem ser melhorados. Mas as diferenças com as descritas aqui podem ser fundamentais para entender e explicar resultados possivelmente contraditórios. Nesta demonstração, descreveremos como trabalhar com células HEI-OC1 a partir de uma alíquota congelada para ter amostras prontas para realizar diferentes estudos com técnicas amplamente disponíveis.

Para iniciar este procedimento, remova um frasco de células HEI-OC1 criopreservadas do nitrogênio líquido e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius. Mergulhe apenas a metade inferior do frasco e deixe-o descongelar até que apenas uma pequena quantidade de gelo permaneça no frasco. Em um armário de segurança biológica, limpe a parte externa do frasco com álcool 70%.

Em seguida, pipete as células do frasco e libere todo o volume gota a gota, lentamente, em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de crescimento pré-aquecido, como DMEM suplementado com 10% de FBS. Em seguida, remova o DMSO centrifugando o tubo por cinco minutos. Após cinco minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em nove mililitros de meio de crescimento fresco.

Desagregar os aglomerados ou folhas de células fluindo e refluindo as células suspensas entre a pipeta e o meio três a quatro vezes com a ponta da pipeta tocando o fundo do tubo. Em seguida, coloque o volume total de células suspensas no meio de crescimento em uma placa de cultura de células plásticas não tratadas de 100 milímetros de diâmetro. Incube as células a 33 graus Celsius com 10% de CO2.

Nesta etapa, remova o meio antigo e lave as células com dois mililitros de PBS. Em seguida, cubra a monocamada da célula com 0,25% de tripsina. Examine as células usando um microscópio invertido quando 40% delas tiverem sido destacadas.

Se necessário, agite suavemente a placa de cultura para liberar quaisquer células presas restantes Ressuspenda as células e remova a tripsina centrifugando o tubo por cinco minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em nove mililitros de meio de crescimento fresco. Em seguida, desagregue os aglomerados ou folhas de células fluindo e refluindo as células suspensas entre a pipeta e o meio, três a quatro vezes com a ponta da pipeta tocando o fundo do tubo.

Prossiga para semear as células em placas de cultura de células de 100 milímetros de diâmetro. Incube-os a 33 graus Celsius com 10%CO2 e divida-os quantas vezes forem necessárias para os experimentos planejados ou para gerar um novo estoque. Para diferenciação, incubar células HEI-OC1 nas condições permissivas até atingirem cerca de 80% de confluência.

Em seguida, incube as células a 39 graus Celsius com 5% de CO2 por duas a três semanas e troque o meio a cada dois dias para remover as células mortas. Comece este procedimento contando as células usando um contador automático de células ou um hemocitômetro e ajuste a concentração celular para o valor necessário. Em seguida, semeie as células em uma placa de fundo plano transparente de 96 poços, uma placa de 96 poços com paredes brancas ou uma placa de seis poços.

Se exigido pelo ensaio específico, incube as células durante a noite para fixação do substrato antes de tratá-las com os medicamentos de interesse. Em seguida, medir o resultado do tratamento por citometria de fluxo ou outra técnica adequada. Para colher as células, lave-as duas vezes com 10 mililitros de PBS sem cálcio e magnésio.

Adicione dois mililitros da solução desenfreadora sem enzimas e incube as células por três minutos a 37 graus Celsius com 5% de CO2. Use um microscópio invertido para verificar o descolamento das células. Se necessário, mova a placa de cultura de células suavemente para separar mais células e tome cuidado para não sacudi-la.

Em seguida, adicione 10 mililitros de DMEM mais 10% FBS e pipete as células para cima e para baixo, suavemente, cinco vezes. Depois disso, observe as células ao microscópio. Se mais de 80% das células já estiverem separadas, não será necessária mais pipetagem.

Se as células ainda estiverem agrupadas, continue pipetando suavemente até que mais de 80% das células não estejam mais agrupadas. Um controle óptico das células deve mostrar muitas células redondas únicas com bordas de membrana lisas. Em seguida, prossiga com as medições de patch-clamp e NLC, conforme descrito no protocolo de texto.

As células HEI-OC1 cultivadas em condições não permissivas mostraram uma diminuição altamente significativa na viabilidade celular e um aumento igualmente significativo na morte celular em relação às culturas de células em condições permissivas. Uma vez que os efeitos do fármaco em células já moribundas ou com uma viabilidade diminuída podem ser diferentes dos efeitos do mesmo fármaco em células saudáveis, devem ser dedicados esforços consideráveis para discriminar os efeitos do fármaco dos efeitos das condições de cultura em qualquer estudo de citotoxicidade realizado em células NP-HEI-OC1. Portanto, recomendamos o uso de células HEI-OC1 cultivadas em condições permissivas para experimentos que não requerem especificamente células diferenciadas.

As imagens confocais mostradas aqui confirmam a expressão da proteína motora auditiva prestin em células HEI-OC1 cultivadas a 33 graus Celsius e 39 graus Celsius. Observe que a prestin imunolocaliza principalmente no citoplasma das células HEI-OC1 que crescem nas condições permissivas e está mais concentrada na membrana plasmática nas células mais diferenciadas. Estudos de citometria de fluxo mostraram um claro aumento na expressão de prestin em ambas as condições, sugerindo que a translocação foi acompanhada pela síntese de mais moléculas de prestin.

Por outro lado, os estudos eletrofisiológicos mostraram um NLC robusto em células HEI-OC1 crescendo a 33 graus Celsius, com um valor de pico que diminuiu e uma voltagem no pico de capacitância que mudou para os valores mais despolarizados à medida que as células foram movidas para as condições não permissivas por uma e duas semanas. Curiosamente, esses resultados sugerem que a função motora pode ser comprometida se a densidade das moléculas de prestina na membrana plasmática for muito alta. É importante lembrar que os protocolos aqui descritos requerem o uso correto de técnicas de cultura celular bem estabelecidas.

Além disso, lembre-se de evitar o uso de antibióticos. Além disso, lembre-se de que o fenótipo e a resposta das células HEI-OC1 dependerão fortemente dos parâmetros de cultura.