Name: Trabalhando com células auditivas HEI-OC1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a trabalhar com células HEI-OC1 para pesquisa auditiva e farmacológica usando linhagens de células de mamífero. Este método padronizado ajuda cientistas a estudar efeitos de drogas e caracterizar a proteína motora prestin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelos NIH Grants R01-DC010146 e R01-DC010397. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial dos Institutos Nacionais de Saúde.

<ol><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
<li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells%3A+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li>
<li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li>
<li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li>
<li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li>
<li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
<li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).</li>
<li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li>
<li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li>
<li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%2221st+Midwinter+Meeting+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li>
<li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis%3A+in+vitro+and+in+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necrosis%3A+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
<li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+necrosis%3A+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
<li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+signaling+of+the+Fas+receptor%3A+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin%27s+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li>
<li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+Oxygen+Tension%3A+Relation+to+Blood+Flow+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesse existente ou potencial.

Neste relatório nós descrevemos como cultura de células HEI-OC1 e usá-los para avaliar mecanismos de citotoxicidade induzida por drogas e investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs coclear. Os procedimentos técnicos, no entanto, são em geral suficiente para ser facilmente adaptado a diferentes estudos. Todos os protocolos descritos aqui requerem o uso correto de técnicas de cultura de células bem estabelecidos 10. Tal como com qualquer outra linha ...

House Ear Instituto-Órgão de Corti 1 células (IES-OC1) são derivadas do órgão auditivo de um ratinho transgénico 1,2. A incubação de uma célula a partir deste ratinho transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condições permissivas) induz a expressão de um gene de imortalização que desencadeia-de diferenciação e proliferação acelerada; movendo-se as células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condições não permissivas) levam à diminuição da proliferação, diferenciação e, pelo menos no caso de IES-OC1, morte celular 2,3. células HEI-OC1 foram clonados e caracterizados em nosso laboratório mais de uma década atrás, e os estudos iniciais indicaram que eles expressam marcadores específicos de células ciliadas da cóclea, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, mas também marcadores de apoio células como da conexina 26 e o receptor do factor de crescimento de fibroblastos (FGF-R) 2. Portanto, foi sugerido que HEI-OC1 poderia representar uma common progenitor de células sensoriais e de sustentação do órgão de Corti 2. Estudos paralelos fornecido forte evidência de que arquetípica drogas ototóxicas como cisplatina, gentamicina e estreptomicina induzida ativação da caspase-3 nestas células, enquanto que drogas consideradas não-ototóxicas, como a penicilina, não 2,3. Portanto, esta linha de células foi proposto como um sistema in vitro para investigar os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na ototoxicidade e para o rastreio do potencial ototoxicidade ou propriedades otoprotetoras de novas drogas farmacológicas. Estima-se que as células HEI-OC1 ter sido utilizada em mais de cento e cinquenta estudos publicados nos últimos dez anos. Considerando a olhar para o potencial efeito pró-apoptótica de diferentes drogas foi o principal objetivo da maioria dos estudos envolvendo esta linha celular, outros processos celulares importantes como autofagia e senescência estão apenas começando a ser investigado em células HEI-OC1 4-7. Eund estudo recente do nosso laboratório 8, usamos células HEI-OC1 para recolher um conjunto abrangente de dados sobre a morte celular, sobrevivência, proliferação, senescência e autofagia induzida por diferentes drogas farmacológicas frequentemente utilizadas na clínica. Também em comparação algumas das respostas de células HEI-OC1 com as de células HEK-293 (células de rim embrionário humano) e células HeLa (células epiteliais humanas) que receberam tratamento idêntico. Os nossos resultados indicaram que as células HEI-OC1 responder a cada droga de uma forma característica, com uma dose distinta e sensibilidade dependente do tempo, pelo menos, um dos mecanismos em estudo. Nós também enfatizou nesse estudo que uma correcta interpretação dos resultados experimentais será necessário realizar estudos paralelos com mais de uma técnica 8. Em outro estudo que investigou o uso de células HEI-OC1 para avaliar a resposta funcional do prestin, a proteína do motor de células ciliadas externas da cóclea (CCE) 9 </s-se&gt;. Nós relatamos citometria de fluxo e estudos de microscopia confocal de varredura a laser sobre o padrão de expressão prestin, bem como capacitância não-linear (NLC) e os estudos de fixação de células-remendo inteiros em células HEI-OC1 cultivadas na permissiva (P-HEI-OC1) e não permissivas (NP-HEI-OC1) condições. Os nossos resultados indicaram que tanto o aumento total de localização expressão prestin e membrana de plasma de uma maneira dependente do tempo em células NP-Hei-OC1. Curiosamente, também descobrimos que o aumento na localização prestin na membrana plasmática de células NP-Hei-OC1 correlacionada com uma diminuição em Na + K + ATPase, que translocados a partir da membrana plasmática para o citoplasma sem alterações significativas na expressão de células totais. Além disso, foi demonstrado que as células P-Hei-OC1 tem uma NLC robusta associada a prestin função motora, que diminuiu quando a densidade de moléculas Prestin presentes na membrana plasmática aumentada. Ao todo, estes resultados suportam fortemente a utilidade do HEI-OC1 células para investigar proteínas auditivas. Neste artigo de vídeo que descrevem como a cultura de células HEI-OC1, por isso é conveniente a utilização de células crescendo em condições permissivas (P-Hei-OC1) para estudos de citotoxicidade, como avaliar o mecanismo / s de citotoxicidade induzida pela droga e como para realizar estudos electrofisiológicos (por exemplo, de patch-clamp, capacitância não-linear (NLC)) para se investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs cocleares.

<table><tbody><tr>Células <td></td><td></td><td>HEI-OC1</td><td>TODOS OS KITS DE ENSAIO, EQUIPAMENTOS&nbsp;</td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica Classe II</td><td>A Baker Company</td><td>Sterilgard</td><td>III E AS EMPRESAS INDICADAS NA</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>AS COLUNAS ANTERIORES SÃO APENAS</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXEMPLOS, E QUALQUER OUTRO</td></tr><tr><td>PRODUTO SEMELHANTE Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PODE SER USADO.</td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Duas (2) incubadoras de células, uma a 33 &deg; C / 10% CO2 e outro a 39 > C/5% CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células, PS, 100 mm x 20 mm com aberturas</td> Placas de cultura de células <td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>, PS,&nbsp; 60 mm x 15 mm com aberturas&nbsp;</td>Frascos de cultura de tecidos <td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos Cellstar 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultura de células de 6 poços, com tampa-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Placa de cultura de tecidos, 96 poços, fundo plano com tampa</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Micro-Ensaio, Chimmey, 96 poços branco, fundo transparente</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de 50 ml com tampa Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de polipropileno de 15 ml com tampa-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, sem vermelho de fenol</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,25%&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS Kit de Ensaio de Proliferação de Células MTT</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 kit</td><td>de ensaio Promega</td><td>&nbsp; G8091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proliferação Celular BrdU&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Solução de dissociação celular não enzimática&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Kit de Ensaio de Citotoxicidade</td><td>Promega</td><td>&nbsp; G8741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento FACSAriaIII</td><td>BD Biosciences</td><td> FACSAriaIII</td><td>Com excitação de 488 nm (laser azul)</td></tr><tr><td>Scanner Digital Blot</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Eletroforese e Blotting</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Leitor de Placas com Software Soft Max Pro 5.2</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador Patch-clamp</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrator para preparação eletrodos de remendo</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

trabalhando com células auditivas hei-oc1

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 é uma das poucas linhagens de células auditivas de camundongos disponíveis para fins de pesquisa. Originalmente propostas como um sistema in vitro para triagem de drogas ototóxicas, essas células têm sido usadas para investigar vias apoptóticas ativadas por drogas, autofagia, senescência, mecanismo de proteção celular, respostas inflamatórias, diferenciação celular, efeitos genéticos e epigenéticos de drogas farmacológicas, efeitos de hipóxia, estresse oxidativo e do retículo endoplasmático e expressão de canais moleculares e receptores. Entre outros marcadores importantes das células ciliadas da cóclea, as células HEI-OC1 expressam endogenamente a prestina, a proteína motora paradigmática das células ciliadas externas. Assim, eles podem ser muito úteis para elucidar novos aspectos funcionais dessa importante proteína auditiva. As células HEI-OC1 são muito robustas, e sua cultura geralmente não apresenta grandes complicações. No entanto, eles exigem algumas condições especiais, como evitar o uso de coquetéis antibacterianos comuns contendo estreptomicina ou outros antibióticos, bem como incubação a 33 ° C para estimular a proliferação celular e incubação a 39 ° C para desencadear a diferenciação celular. Aqui, descrevemos como cultivar células HEI-OC1 e como usá-las em alguns ensaios típicos, como proliferação celular, viabilidade, morte, autofagia e senescência, bem como realizar medições de patch-clamp e capacitância não linear.

Em um par de publicações recentes já relatado um conjunto abrangente de estudos destinados a avaliar a resposta das células HEI-OC1 a vários medicamentos farmacológicos comumente utilizados, bem como investigar a função prestin 8,9. Nestes estudos, fizemos uso de todos os protocolos descritos nas secções anteriores. Um dos resultados destes estudos anteriores foi que as células HEI-OC1 cultivadas em condições não pe...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) é uma das poucas linhagens de células auditivas de camundongos atualmente disponíveis para fins de pesquisa. Este protocolo descreve como trabalhar com células HEI-OC1 para investigar os efeitos citotóxicos de drogas farmacológicas, bem como as propriedades funcionais das proteínas da orelha interna.

Trabalhando com células auditivas HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever os procedimentos básicos para trabalhar com células HEI-OC1, que podem ser utilizadas para estudar os efeitos de fármacos farmacológicos sobre células auditivas e auxiliar na caracterização funcional da proteína motora prestina. Células HEI-OC1 são usadas por muitos pesquisadores ao redor do mundo em diferentes experimentos, com diversos objetivos e utilizando diferentes técnicas. Espera-se que os procedimentos descritos aqui forneçam uma base comum para tornar esses estudos comparáveis.É claro que esses procedimentos experimentais podem ser ainda aprimorados. No entanto, as diferenças em relação aos descritos aqui podem ser fundamentais para compreender e explicar resultados possivelmente contraditórios. Nesta demonstração, descreveremos como trabalhar com células HEI-OC1, partindo de uma alíquota congelada até obter amostras prontas para realizar diferentes estudos com técnicas amplamente disponíveis.Para iniciar este procedimento, retire um frasco de células HEI-OC1 criopreservadas do nitrogênio líquido e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius. Mergulhe apenas a metade inferior do frasco e deixe descongelar até que reste apenas u

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Whole-cell patch-clamp gravações de dendritos do nervo auditivo fibra no interior da fita sinapse das células ciliadas da cóclea de mamíferos.

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

Um método confiável para investigar células ciliadas externas (CCE) respostas móveis, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão, é descrito. Motilidade das CCE é eliciada pela estimulação com um campo elétrico externo alternada, eo método tira proveito da alta velocidade de gravação de imagem, baseada em LED, iluminação e de última geração de software de análise de imagem.

Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

O implante coclear (IC) permitem ouvir pela estimulação elétrica direta do nervo auditivo. No entanto, a má frequência e intensidade resolução limita a qualidade de ouvir com CIs. Aqui descrevemos estimulação optogenética do nervo auditivo em ratos como uma estratégia alternativa para a investigação auditiva e desenvolvimento de futuros ICs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Existem vários métodos para a introdução de agentes ototóxicos na cóclea de modelos animais. Apresenta-se um protocolo cirúrgico para entrega de agentes ototóxicos no nicho da janela redonda. O procedimento é confiável, cria lesões intracocleares direcionadas e evita danos mecânicos à microarquitetura. O exame do autorreparo/regeneração coclear é possível.

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Os protocolos atuais para manter células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas (iMOP) e diferenciação ótica são descritos.  As condições de cultura e os marcadores moleculares que indicam diferenciação em epitélio sensorial e neurônios ganglionares espirais (SGN) são destacados.

Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

Modelos animais de implantes cocleares podem avançar o conhecimento das bases tecnológicas de tratamento de perda de audição neurossensorial permanente com estimulação elétrica. Este estudo apresenta um protocolo cirúrgico para agudo ensurdecedor e implante coclear de uma matriz de eletrodo em ratos, bem como a avaliação funcional com auditivo de tronco encefálico.

Cirurgia de implante coclear e gravações de resposta eletricamente evocado auditivo do tronco encefálico em camundongos C57BL/6

Este artigo apresenta um método de preparação da superfície coclear modificado que requer decaltificação e uso de um adesivo de células e tecidos para aderir aos pedaços de epélia coclear a 10 mm de cobertura redonda para imunohistoquímica em córquia de camundongo adulto.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Aqui apresentamos um protocolo para a Microscopia de Condução de Íons da Sonda Hopping (HPICM), uma técnica de sonda de varredura sem contato que permite imagens nanoescala de feixes de estereócilia em células ciliadas auditivas vivas.

Imagem do pacote de esterecilia com resolução de nanoescala em células capilares auditivas de mamíferos vivos

Porcos em miniatura (mini-porcos) são um modelo animal de grande porte ideal para a pesquisa de implantes cocleares. A cirurgia de implante coclear em mini-porcos pode ser utilizada para fornecer evidências iniciais da segurança e do desempenho potencial de novas matrizes de eletrodos e abordagens cirúrgicas em um sistema vivo semelhante aos seres humanos.

O Porco em Miniatura: Um Modelo Animal de Grande Porte para Pesquisa de Implante Coclear

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Aprenda a trabalhar com células HEI-OC1 para pesquisa auditiva e farmacológica usando linhagens de células de mamífero. Este método padronizado ajuda cientistas a estudar efeitos de drogas e caracterizar a proteína motora prestin.

Trabalhando com células auditivas HEI-OC1

Explorar mais vídeos