Name: Trabalhando com células auditivas HEI-OC1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a trabalhar com células HEI-OC1 para pesquisa auditiva e farmacológica usando linhagens de células de mamífero. Este método padronizado ajuda cientistas a estudar efeitos de drogas e caracterizar a proteína motora prestin.

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Este trabalho foi apoiado pelos NIH Grants R01-DC010146 e R01-DC010397. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial dos Institutos Nacionais de Saúde.

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<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
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<li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li>
<li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li>
<li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li>
<li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
<li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li>
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<li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li>
<li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li>
<li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%2221st+Midwinter+Meeting+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li>
<li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis%3A+in+vitro+and+in+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necrosis%3A+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
<li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+necrosis%3A+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
<li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+signaling+of+the+Fas+receptor%3A+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin%27s+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li>
<li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+Oxygen+Tension%3A+Relation+to+Blood+Flow+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesse existente ou potencial.

Neste relatório nós descrevemos como cultura de células HEI-OC1 e usá-los para avaliar mecanismos de citotoxicidade induzida por drogas e investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs coclear. Os procedimentos técnicos, no entanto, são em geral suficiente para ser facilmente adaptado a diferentes estudos. Todos os protocolos descritos aqui requerem o uso correto de técnicas de cultura de células bem estabelecidos 10. Tal como com qualquer outra linha ...

House Ear Instituto-Órgão de Corti 1 células (IES-OC1) são derivadas do órgão auditivo de um ratinho transgénico 1,2. A incubação de uma célula a partir deste ratinho transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condições permissivas) induz a expressão de um gene de imortalização que desencadeia-de diferenciação e proliferação acelerada; movendo-se as células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condições não permissivas) levam à diminuição da proliferação, diferenciação e, pelo menos no caso de IES-OC1, morte celular 2,3. células HEI-OC1 foram clonados e caracterizados em nosso laboratório mais de uma década atrás, e os estudos iniciais indicaram que eles expressam marcadores específicos de células ciliadas da cóclea, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, mas também marcadores de apoio células como da conexina 26 e o receptor do factor de crescimento de fibroblastos (FGF-R) 2. Portanto, foi sugerido que HEI-OC1 poderia representar uma common progenitor de células sensoriais e de sustentação do órgão de Corti 2. Estudos paralelos fornecido forte evidência de que arquetípica drogas ototóxicas como cisplatina, gentamicina e estreptomicina induzida ativação da caspase-3 nestas células, enquanto que drogas consideradas não-ototóxicas, como a penicilina, não 2,3. Portanto, esta linha de células foi proposto como um sistema in vitro para investigar os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na ototoxicidade e para o rastreio do potencial ototoxicidade ou propriedades otoprotetoras de novas drogas farmacológicas. Estima-se que as células HEI-OC1 ter sido utilizada em mais de cento e cinquenta estudos publicados nos últimos dez anos. Considerando a olhar para o potencial efeito pró-apoptótica de diferentes drogas foi o principal objetivo da maioria dos estudos envolvendo esta linha celular, outros processos celulares importantes como autofagia e senescência estão apenas começando a ser investigado em células HEI-OC1 4-7. Eund estudo recente do nosso laboratório 8, usamos células HEI-OC1 para recolher um conjunto abrangente de dados sobre a morte celular, sobrevivência, proliferação, senescência e autofagia induzida por diferentes drogas farmacológicas frequentemente utilizadas na clínica. Também em comparação algumas das respostas de células HEI-OC1 com as de células HEK-293 (células de rim embrionário humano) e células HeLa (células epiteliais humanas) que receberam tratamento idêntico. Os nossos resultados indicaram que as células HEI-OC1 responder a cada droga de uma forma característica, com uma dose distinta e sensibilidade dependente do tempo, pelo menos, um dos mecanismos em estudo. Nós também enfatizou nesse estudo que uma correcta interpretação dos resultados experimentais será necessário realizar estudos paralelos com mais de uma técnica 8. Em outro estudo que investigou o uso de células HEI-OC1 para avaliar a resposta funcional do prestin, a proteína do motor de células ciliadas externas da cóclea (CCE) 9 </s-se&gt;. Nós relatamos citometria de fluxo e estudos de microscopia confocal de varredura a laser sobre o padrão de expressão prestin, bem como capacitância não-linear (NLC) e os estudos de fixação de células-remendo inteiros em células HEI-OC1 cultivadas na permissiva (P-HEI-OC1) e não permissivas (NP-HEI-OC1) condições. Os nossos resultados indicaram que tanto o aumento total de localização expressão prestin e membrana de plasma de uma maneira dependente do tempo em células NP-Hei-OC1. Curiosamente, também descobrimos que o aumento na localização prestin na membrana plasmática de células NP-Hei-OC1 correlacionada com uma diminuição em Na + K + ATPase, que translocados a partir da membrana plasmática para o citoplasma sem alterações significativas na expressão de células totais. Além disso, foi demonstrado que as células P-Hei-OC1 tem uma NLC robusta associada a prestin função motora, que diminuiu quando a densidade de moléculas Prestin presentes na membrana plasmática aumentada. Ao todo, estes resultados suportam fortemente a utilidade do HEI-OC1 células para investigar proteínas auditivas. Neste artigo de vídeo que descrevem como a cultura de células HEI-OC1, por isso é conveniente a utilização de células crescendo em condições permissivas (P-Hei-OC1) para estudos de citotoxicidade, como avaliar o mecanismo / s de citotoxicidade induzida pela droga e como para realizar estudos electrofisiológicos (por exemplo, de patch-clamp, capacitância não-linear (NLC)) para se investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs cocleares.

<table><tbody><tr>Células <td></td><td></td><td>HEI-OC1</td><td>TODOS OS KITS DE ENSAIO, EQUIPAMENTOS&nbsp;</td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica Classe II</td><td>A Baker Company</td><td>Sterilgard</td><td>III E AS EMPRESAS INDICADAS NA</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>AS COLUNAS ANTERIORES SÃO APENAS</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>EXEMPLOS, E QUALQUER OUTRO</td></tr><tr><td>PRODUTO SEMELHANTE Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PODE SER USADO.</td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Duas (2) incubadoras de células, uma a 33 &deg; C / 10% CO2 e outro a 39 > C/5% CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células, PS, 100 mm x 20 mm com aberturas</td> Placas de cultura de células <td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>, PS,&nbsp; 60 mm x 15 mm com aberturas&nbsp;</td>Frascos de cultura de tecidos <td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos Cellstar 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultura de células de 6 poços, com tampa-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Placa de cultura de tecidos, 96 poços, fundo plano com tampa</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Micro-Ensaio, Chimmey, 96 poços branco, fundo transparente</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de 50 ml com tampa Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de polipropileno de 15 ml com tampa-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, sem vermelho de fenol</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,25%&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS Kit de Ensaio de Proliferação de Células MTT</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 kit</td><td>de ensaio Promega</td><td>&nbsp; G8091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proliferação Celular BrdU&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Solução de dissociação celular não enzimática&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Kit de Ensaio de Citotoxicidade</td><td>Promega</td><td>&nbsp; G8741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento FACSAriaIII</td><td>BD Biosciences</td><td> FACSAriaIII</td><td>Com excitação de 488 nm (laser azul)</td></tr><tr><td>Scanner Digital Blot</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Eletroforese e Blotting</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Leitor de Placas com Software Soft Max Pro 5.2</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador Patch-clamp</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrator para preparação eletrodos de remendo</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

trabalhando com células auditivas hei-oc1

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 é uma das poucas linhagens de células auditivas de camundongos disponíveis para fins de pesquisa. Originalmente propostas como um sistema in vitro para triagem de drogas ototóxicas, essas células têm sido usadas para investigar vias apoptóticas ativadas por drogas, autofagia, senescência, mecanismo de proteção celular, respostas inflamatórias, diferenciação celular, efeitos genéticos e epigenéticos de drogas farmacológicas, efeitos de hipóxia, estresse oxidativo e do retículo endoplasmático e expressão de canais moleculares e receptores. Entre outros marcadores importantes das células ciliadas da cóclea, as células HEI-OC1 expressam endogenamente a prestina, a proteína motora paradigmática das células ciliadas externas. Assim, eles podem ser muito úteis para elucidar novos aspectos funcionais dessa importante proteína auditiva. As células HEI-OC1 são muito robustas, e sua cultura geralmente não apresenta grandes complicações. No entanto, eles exigem algumas condições especiais, como evitar o uso de coquetéis antibacterianos comuns contendo estreptomicina ou outros antibióticos, bem como incubação a 33 ° C para estimular a proliferação celular e incubação a 39 ° C para desencadear a diferenciação celular. Aqui, descrevemos como cultivar células HEI-OC1 e como usá-las em alguns ensaios típicos, como proliferação celular, viabilidade, morte, autofagia e senescência, bem como realizar medições de patch-clamp e capacitância não linear.

Em um par de publicações recentes já relatado um conjunto abrangente de estudos destinados a avaliar a resposta das células HEI-OC1 a vários medicamentos farmacológicos comumente utilizados, bem como investigar a função prestin 8,9. Nestes estudos, fizemos uso de todos os protocolos descritos nas secções anteriores. Um dos resultados destes estudos anteriores foi que as células HEI-OC1 cultivadas em condições não pe...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) é uma das poucas linhagens de células auditivas de camundongos atualmente disponíveis para fins de pesquisa. Este protocolo descreve como trabalhar com células HEI-OC1 para investigar os efeitos citotóxicos de drogas farmacológicas, bem como as propriedades funcionais das proteínas da orelha interna.

Trabalhando com células auditivas HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever os procedimentos básicos para trabalhar com células HEI-OC1, que podem ser utilizadas para estudar os efeitos de fármacos farmacológicos sobre células auditivas e auxiliar na caracterização funcional da proteína motora prestina. Células HEI-OC1 são usadas por muitos pesquisadores ao redor do mundo em diferentes experimentos, com diversos objetivos e utilizando diferentes técnicas. Espera-se que os procedimentos descritos aqui forneçam uma base comum para tornar esses estudos comparáveis.É claro que esses procedimentos experimentais podem ser ainda aprimorados. No entanto, as diferenças em relação aos descritos aqui podem ser fundamentais para compreender e explicar resultados possivelmente contraditórios. Nesta demonstração, descreveremos como trabalhar com células HEI-OC1, partindo de uma alíquota congelada até obter amostras prontas para realizar diferentes estudos com técnicas amplamente disponíveis.Para iniciar este procedimento, retire um frasco de células HEI-OC1 criopreservadas do nitrogênio líquido e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius. Mergulhe apenas a metade inferior do frasco e deixe descongelar até que reste apenas uma pequena quantidade de gelo no interior do frasco. Em uma cabine de segurança biológica, limpe a parte externa do frasco com álcool 70%.Em seguida, pipete as células do frasco e adicione todo o volume gota a gota, lentamente, em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de crescimento pré-aquecido, como DMEM suplementado com 10% de FBS. A seguir, remova o DMSO por centrifugação do tubo durante cinco minutos. Após cinco minutos, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em nove mililitros de meio de crescimento fresco.Desagregue os aglomerados ou folhas de células fazendo fluxo e refluxo das células suspensas entre a pipeta e o meio três a quatro vezes, com a ponta da pipeta tocando o fundo do tubo. Em seguida, coloque o volume total das células suspensas no meio de crescimento em uma placa de cultura celular de plástico não tratada com diâmetro de 100 milímetros. Incube as células a 33 graus Celsius com 10% de CO₂.Nesta etapa, remova o meio antigo e lave as células com dois mililitros de PBS. Em seguida, cubra a monocamada celular com tripsina 0,25%. Examine as células utilizando um microscópio invertido quando 40% delas tiverem se destacado.Se necessário, balance suavemente o recipiente de cultura para liberar quaisquer células ainda aderidas. Re-suspenda as células e remova a tripsina por centrifugação do tubo durante cinco minutos. Posteriormente, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em nove mililitros de meio de crescimento fresco. Em seguida, desagregue os aglomerados ou camadas de células fazendo fluxo e refluxo das células suspensas entre a pipeta e o meio, de três a quatro vezes, com a ponta da pipeta tocando o fundo do tubo.Prossiga para semear as células em placas de cultura celular com diâmetro de 100 milímetros. Incube-as a 33 graus Celsius com 10%CO₂ e divida-as tantas vezes quanto necessário para os experimentos planejados, ou para gerar um novo estoque. Para diferenciação, incube as células HEI-OC1 nas condições permissivas até que alcancem cerca de 80% de confluência.Em seguida, incubar as células a 39 graus Celsius com 5% de CO2 por duas a três semanas e trocar o meio a cada dois dias para remover as células mortas. Inicie este procedimento contando as células utilizando um contador celular automático ou um hemocitômetro e ajuste a concentração celular ao valor necessário. Em seguida, semeie as células em uma placa de 96 poços transparente com fundo plano, uma placa de 96 poços com paredes brancas ou uma placa de seis poços.Se exigido pelo ensaio específico, incubar as células durante a noite para adesão ao substrato antes de tratá-las com as drogas de interesse. Em seguida, medir o resultado do tratamento por citometria de fluxo ou outra técnica adequada. Para colher as células, lavá-las duas vezes com 10 mililitros de PBS sem cálcio e sem magnésio.Adicione dois mililitros da solução despelizante livre de enzimas e incube as células por três minutos a 37 graus Celsius com 5% de CO₂. Utilize um microscópio invertido para verificar o desprendimento das células. Se necessário, movimente suavemente o recipiente de cultura celular para desprender mais células, tomando cuidado para não agitá-lo.Em seguida, adicione 10 mililitros de DMEM com 10% de FBS e aspire e expulse as células suavemente cinco vezes. Depois disso, examine as células ao microscópio. Se mais de 80% das células já estiverem separadas, não será necessário pipetar mais.Se as células ainda estiverem em aglomerados, continue pipetando suavemente até que mais de 80% das células não estejam mais em aglomerados. Um controle óptico das células deve mostrar muitas células individuais e arredondadas com bordas da membrana lisas. Em seguida, prossiga com as medidas de patch-clamp e NLC, conforme descrito no protocolo textual.Células HEI-OC1 cultivadas em condições não permissivas apresentaram uma diminuição altamente significativa na viabilidade celular e um aumento igualmente significativo na morte celular em comparação com culturas de células mantidas em condições permissivas. Uma vez que os efeitos de fármacos sobre células já em processo de morte ou com viabilidade reduzida podem diferir dos efeitos do mesmo fármaco sobre células saudáveis, esforços consideráveis devem ser dedicados a discriminar os efeitos dos fármacos dos efeitos das condições de cultivo em qualquer estudo de citotoxicidade realizado em células NP-HEI-OC1. Por isso, recomendamos o uso de células HEI-OC1 cultivadas em condições permissivas para experimentos que não exijam especificamente células diferenciadas.As imagens de microscopia confocal mostradas aqui confirmam a expressão da proteína motora auditiva prestina em células HEI-OC1 cultivadas a 33 graus Celsius e 39 graus Celsius. Observe que a imunolocalização da prestina ocorre principalmente no citoplasma das células HEI-OC1 crescendo em condições permissivas, e está mais concentrada na membrana plasmática nas células mais diferenciadas. Estudos de citometria de fluxo mostraram um aumento claro na expressão de prestina em ambas as condições, sugerindo que a translocação foi acompanhada pela síntese de mais moléculas de prestina.Por outro lado, os estudos eletrofisiológicos mostraram uma NLC acentuada em células HEI-OC1 cultivadas a 33 graus Celsius, com um valor de pico que diminuiu e uma voltagem no pico da capacitância que se deslocou para valores mais despolarizados à medida que as células foram transferidas para condições não permissivas por uma e duas semanas. Curiosamente, esses resultados sugerem que a função motora poderia ser comprometida se a densidade de moléculas de prestina na membrana plasmática for muito alta. É importante lembrar que os protocolos descritos aqui exigem o uso correto de técnicas bem estabelecidas de cultura celular.Além disso, lembre-se de evitar o uso de antibióticos. Adicionalmente, lembre-se de que o fenótipo e a resposta das células HEI-OC1 dependerão fortemente dos parâmetros de cultura.

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Biologia

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