Name: A Síntese de hidrogéis RGD-funcionalizado como uma ferramenta para aplicações terapêuticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a sintetizar hidrogéis funcionalizados com RGD para engenharia de tecidos usando polimerização assistida por micro-ondas. Este método melhora a viabilidade celular em culturas tridimensionais e oferece aplicações promissoras em medicina regenerativa.

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Autores gostariam de agradecer ao Prof. Maurizio Masi para discussão frutífera e Miss Chiara Allegretti para edição idioma. pesquisa dos autores é apoiado pelo Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573).

Nota: Os produtos químicos são utilizados como recebidos. Linear RGD é adquirida, mas ele pode ser preparado por síntese de péptidos em fase sólida de Fmoc padrão 16,19. Os solventes são de grau analítico. A diálise requer a utilização de membranas com um M W de corte igual a 3500 Da. Os compostos sintetizados são caracterizados por espectros de 1 H RMN registados num espectrómetro de 400 MHz utilizando clorofórmio (CDCl 3) ou óxido de deutério (D 2 O), como solventes, e os desvios químicos são reportados como valores de ô em partes por milhão. Além disso, os hidrogéis são submetidas a análise por FT-IR utilizando uma técnica grânulo de KBr e sua caracterização física envolve estudos de gelificação avaliadas usando o tubo de ensaio invertido a 37 ° C. 1. Síntese de 4-cloreto de 1 Azidobutanoyl <ol><li> Dissolve-se 500 mg de 4-azidobutanoic ácido (3,90 mmol) em 10 ml de diclorometano e 0,5 ml de dimetilformamida. </li><li> Arrefece-se a solução a 0 ° C, Usando um banho de gelo. </li><li> Adicionar 505 ul de cloreto de oxalilo (5,85 mmol) a 5 ml de diclorometano e adiciona-se lentamente gota a gota, ao sistema de reacção, enquanto se agitava. </li><li> Após 1 h a 0 ° C usando um banho de gelo, de regresso à temperatura ambiente. </li><li> Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. </li><li> Caracterizar o produto obtido por 1 H-RMN espectroscopia, dissolvendo a amostra em CDCl3 16. </li></ol> 2. Síntese de RGD-azida derivado de 2 <ol><li> Dissolve-se 50 mg de RGD (0,145 mmol) em 1 ml de NaOH 1M. </li><li> Dissolve-se 24 mg de 1 (0,16 mmol) em 2 ml de tetra-hidrofurano. </li><li> Adicionar toda a solução de RGD a solução 1 gota a gota a 0 ° C usando um banho de gelo. </li><li> Regressar até à temperatura ambiente e agitar durante a noite. </li><li> Adicionar 1 ml de HCl 1M. </li><li> Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. </li><li> Caracterizar a obtained produto por 1 H-NMR espectroscopia, dissolvendo a amostra em D 2 O 16. </li></ol> 3. PAA Alcino Modificação 3 <ol><li> Dissolve-se 200 mg de 35% w / w solução de PAA (2,8 mmol) em 15 ml de água destilada. </li><li> Adicionar 15,4 mg de cloridrato de propargilamina (0,20 mmol). </li><li> Dissolve-se 42,8 mg de hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt, 0,28 mmol) em 14 ml de uma mistura 1: 1 v / v de acetonitrilo: solução de água destilada por aquecimento a 50 ° C. </li><li> Adicionar toda a solução de HOBt a uma solução de PAA à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 53,6 mg de ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0,28 mmol) à mistura de reacção. </li><li> Use HCl a 1 M para ajustar o pH a 5,5 e agita-se o sistema reaccional durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Dializar a solução. Dissolve-se 11,2 g de cloreto de sódio em 2 L de água destilada e, em seguida, adicionar 0,2 ml de 37% w / w de HCl. Dializar a solução através de uma membrana com um M W de corte de 3,5 kDa. </li><li> Perfodiálise rm por três dias. Alterar a solução de diálise por dia com 2 L de água destilada recentemente preparada contendo 0,2 ml de 37% w / w de HCl. </li><li> Armazenar a solução final à temperatura de -80 ° C. Liofilizar-lo num liofilizador de acordo com os protocolos do fabricante. </li><li> Caracterizar o polímero funcionalizado por 1 H-RMN espectroscopia, dissolvendo a amostra em D 2 O 16. </li></ol> 4. Síntese de PAA-RGD 4 Polymer <ol><li> Dissolve-se 78 mg de PAA modificada alcino 3 (1,083 mmol) em 10 ml de água destilada. </li><li> Dissolve-se 25 mg de azida do RGD derivado 2 (0,0722 mmol) em 5 ml de tetra-hidrofurano. </li><li> Adicionar toda a solução de RGD com a solução polimérica. </li><li> Adicionar 2,2 mg de iodeto de cobre (0,0116 mmol) e 2,2 mg de ascorbato de sódio (0,0111 mmol). </li><li> Levar ao refluxo a mistura resultante durante a noite a 60 ° C, com agitação. </li><li> Arrefece-se a mistura a 25 ° C. </li><li> DialyzE é a solução. Dissolve-se 11,2 g de cloreto de sódio em 2 L de água destilada e, em seguida, adicionar 0,2 ml de 37% w / w de HCl. Dializar a solução através de uma membrana com um M W de corte de 3,5 kDa. </li><li> Executar a diálise durante três dias. Alterar a solução de diálise por dia com 2 L de água destilada recentemente preparada contendo 0,2 ml de 37% w / w de HCl. </li><li> Armazenar a solução final à temperatura de -80 ° C. Liofilizar-lo num liofilizador de acordo com os protocolos do fabricante. </li><li> Caracterizar o produto obtido por 1 H-RMN espectroscopia, dissolvendo a amostra em D 2 O 16. </li></ol> 5. Hidrogel-RGD funcionalizado Síntese <ol><li> Prepare o PBS. Dissolve-se 645 mg de sal de PBS em 50 ml de água destilada. </li><li> Misturar 40 mg de carbómero e 10 mg de 4 PAA funcionalizado em 9 ml de PBS (passo 5.1), à temperatura ambiente, até à dissolução completa (30 min). </li><li> Adicionar 400 mg de PEG para a solução e manter a agitação durante 45 min. </li><li> Pare a agitação e permitir que o sistema se contentar com 30 min. </li><li> Use NaOH 1 N para ajustar o pH para 7,4. </li><li> Para 5 ml da mistura obtida, adicionar 25 mg de pó de agarose. </li><li> Irradiar o sistema com a radiação de microondas a 500 W até ferver, durante um tempo geralmente entre 30 segundos e 1 minuto, e electromagneticamente aquecer até 80 ° C. </li><li> Deixar a mistura exposta a temperatura ambiente até a sua temperatura diminui para 50 ° C e adicionam-se 5 ml de PBS (passo 5.1), a fim de obter uma solução com uma razão de 1: 1 volumétrico. </li><li> Prepare 12 placa contendo cilindros de aço com múltiplas cavidades com um diâmetro de 1,1 cm. </li><li> Aqui alíquotas de 500 ul da solução e coloca-los uns aos cilindros de aço. </li><li> Deixar em repouso durante 45 minutos até completa gelificação do sistema. </li><li> Remover os cilindros utilizando um fórceps de aço inoxidável para se obter os hidrogeles. </li></ol> 6. O carregamento de ferramenta terapêutica (Drug ou células) <ol><li> Repita steps 5,1-5,7. </li><li> Quando a mistura (já no estado sol) atinge 37 ° C, adicionam-se 5 ml da solução contendo a cultura de células ou solução de fármaco desejado, a fim de se obter um sistema final numa proporção de 1: 1 volumétrico. </li><li> Repita os passos 5,9-5,12 obter redes poliméricas com biocompostos fisicamente retidas dentro do gel. </li></ol> 7. Hidrogel Caracterização <ol><li> Análise de FT-IR <ol><li> Após a formação do gel, embeber um dos hidrogéis sintetizados em 2,5 ml de água destilada, durante 24 h. </li><li> Retire os meios aquosos, onde hidrogel é submersas e congelar-seco com líquido N 2. </li><li> Laminar a amostra de hidrogel de acordo com a técnica de grânulo de KBr. <ol><li> Adicionar uma espátula cheia de KBr num almofariz de ágata. Aqui uma pequena quantidade da amostra de hidrogel (cerca de 0,1-2% da quantidade KBr, ou apenas o suficiente para cobrir a ponta da espátula) e misturar com o pó de KBr. </li><li> Moer a mistura até que o pó é fina e homogênea. &lt;/ Li&gt; <li> Usar o kit grânulo de KBr para formar o pellet IR. Pressionar o pó usando uma prensa de laboratório manual: durante 3 min a capacidade de pressão igual a 5 toneladas e, em seguida, durante 3 min a capacidade de pressão de 10 toneladas. </li><li> Solte a pressão para obter o sedimento final como homogênea e transparente na aparência. Insira o pellet no suporte de amostra do IR e executar o espectro 16. </li></ol></li></ol></li><li> Estudos de gelificação <ol><li> Encha 2 ml tubo de microcentrífuga com 900 jil de PBS e equilibrar a 37 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul da solução de polímero preparada para formar o hidrogel e incubar a 37 ° C. </li><li> Inverter o tubo e observar se o gel flui a 1, 2, 5, 10 e 20 min. Gravar o momento em que o gel não flui como o tempo de gelificação. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram não haver conflito de interesse e não receberam nenhum pagamento na preparação deste manuscrito.

A modificação da pós-polimerização do PAA com porções de alcino e a funcionalização do RGD com o grupo azida garantem a formação de uma ligação estável entre o polímero e o peptídeo. De fato, o triazol serve como uma unidade de ligação rígida entre os átomos de carbono, ligada às posições 1,4 do anel 1,2,3-triazol e não pode ser clivado hidroliticamente ou de outra forma. Além disso, o triazol é extremamente difícil de oxidar e reduzir, ao contrário de outras estruturas cíclicas, como benzenóides e heterociclos aromático...

Os hidrogéis são redes tridimensionais formadas por polímeros reticulados hidrófilos, que são naturais ou sintéticos, e caracteriza-se por uma estrutura tridimensional diferente. Estes dispositivos são cada vez mais atraente nos domínios biomédicos da entrega da droga, engenharia de tecidos, portadores do gene e sensores inteligentes 1,2. Com efeito, o seu elevado teor de água, bem como as suas propriedades reológicas e mecânicas torná-los candidatos adequados para imitar microambientes dos tecidos moles e os tornam ferramentas eficazes para citocina solúvel em água ou entrega do factor de crescimento. Um dos usos mais promissor é como um biomaterial injectável transportando células e compostos bioactivos. Os hidrogeles podem melhorar a sobrevivência de células e o destino celular haste de comando, mantendo e entregar precisamente sinais reguladores de células estaminais de um modo fisiologicamente relevante, tal como observado in vitro e em experiências in vivo 3,4. A vantagem principal da presente é a possibilidadepara manter as células injectadas no interior da zona de inoculação (in situ), minimizando a quantidade de células que deixa a área e extravasa na corrente circulatória, a migração em todo o corpo e perder a baliza 5. A estabilidade das redes tridimensionais de hidrogel é devido aos seus sítios de ligação cruzada, formadas por ligações covalentes ou forças de coesão entre as cadeias de polímero 6. Neste quadro, química selectiva ortogonal aplicada a cadeias poliméricas é uma ferramenta versátil capaz de melhorar o desempenho de hidrogel 7. Com efeito, a modificação de polímeros com grupos químicos adequados podem contribuir para fornecer químico apropriado, propriedades físicas e mecânicas para aumentar a viabilidade das células e a sua utilização na formação de tecido. Do mesmo modo, entre as técnicas para carregar células ou factores de crescimento no interior da matriz de gel, o uso do péptido RGD permite melhorias na adesão celular e na sobrevivência. RGD é um tripéptido compostade arginina, glicina e ácido aspártico, que é de longe o mais eficaz e, muitas vezes empregue tripéptido devido à sua capacidade para lidar com mais do que um receptor de adesão de célula e o seu impacto na ancoragem biológica de células, o comportamento e a sobrevivência 8,9. Neste trabalho, a síntese de hidrogeles funcionalizada-RGD é estudada com o objectivo de conceber redes caracterizados por propriedades bioquímicas suficientes para um microambiente celular hospitaleiro. A utilização de radiação de microondas na síntese de hidrogel oferece um procedimento simples para minimizar as reacções laterais e obter taxas de reacção mais elevadas e rendimentos em um período de tempo mais curto em comparação com os processos térmicos convencionais 10. Este método não requer passos de purificação e rendimentos hidrogéis estéreis devido às interacções dos polímeros e na ausência de solvente orgânico no sistema reaccional 11. Por isso, ele garante altas porcentagens de RGD ligados à rede polimérica porque nenhuma modificaçãoficações são necessários para os grupos químicos de polímeros envolvidos na formação de gel. Os grupos carboxilo, a partir de PAA e carbómero, e grupos hidroxilo, a partir de PEG e de agarose, para dar origem a estrutura tridimensional de hidrogel através de uma reacção de policondensação. Os polímeros mencionados são usados para a síntese de hidrogeles na lesão medular tratamentos de reparação 12. Estes dispositivos, como relatado em trabalhos anteriores 13,14, mostram elevada biocompatibilidade, assim como propriedades mecânicas e físico-químicas que se assemelham às de muitos tecidos vivos e na natureza tixotrópica. Além disso, eles permanecem localizadas in situ, na zona de injecção. Neste trabalho, os grupos carboxilo são PAA modificada com uma porção alcino (Figura 1), e um composto de RGD-azida é sintetizado explorar a reactividade do grupo terminal tripéptido -NH2 com um composto químico com a estrutura preparada (CH 2) n - N 3 (&lt;forte&gt; Figura 2). Subsequentemente, o PAA modificada reage com o derivado azida por meio de RGD CuAAC reacção clique 15-17 (Figura 3). O uso de um catalisador (I) de cobre conduz a uma significativa melhoria tanto na taxa de reacção e a regio-selectividade. A reacção CuAAC é amplamente utilizado em síntese orgânica e em ciência de polímeros. Combina elevada eficiência e elevada tolerância para os grupos funcionais, e não é influenciada pelo uso de solventes orgânicos. A alta seletividade, um tempo de reacção rápida e um procedimento de purificação simples permitem a obtenção de polímeros em estrela, copolímeros em bloco ou cadeias de enxerto fracções desejadas 18. Esta estratégia torna possível clique para modificar polímeros após a polimerização de personalizar as propriedades físico-químicas de acordo com a aplicação bioquímica final. As condições experimentais são CuAAC facilmente reprodutível (a reacção é insensível à água, enquanto que a oxidação de cobre pode ocorrer minimamente), e a natureza dotriazol formado assegura a estabilidade do produto. O uso de metal de cobre pode ser considerado um ponto crítico, devido ao seu possível efeito tóxico contra as células e no microambiente biológica, mas a diálise é utilizado como um método de purificação a fim de permitir a remoção completa dos resíduos catalíticos. Finalmente, o PAA modificada RGD é utilizado na síntese de hidrogel (Figura 4) e as propriedades físico-químicas das redes resultantes são investigados, a fim de verificar o potencial de funcionalidade desses sistemas como células transportadoras ou drogas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" /> Figura 1: PAA modificado síntese alcino Um esquema de funcionalização PAA com o grupo alcino;. &quot;n&quot; indica os monómeros com um grupo carboxilo reagir com propargilamina. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver</a>uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" /> Figura 2:.. RGD-azida síntese A síntese de derivado RGD-azida <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" /> Figura 3: Clique reacção Esquema de reação clique entre derivado RGD-azida e alcino-PAA.. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" /> Figura 4: Hidrogel Synthesis. RGD funcionalizado procedimento de síntese hidrogel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Solução de poli(ácido acrílico) média Mw ~100.000, 35% em peso em H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>523925</td><td>CAS 9003-01-4</td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol) 2.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84797</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Carbomeer 974P</td><td>Fagron</td><td>1387083</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen Corp.</td><td>16500-500</td><td>UltraPure Agarose</td></tr><tr><td>RGD peptídeo</td><td>abcam</td><td>ab142698</td><td></td></tr><tr><td>ácido 4-azidobutanoico</td><td>Aurum Pharmatech</td><td>Z-2421</td><td>&nbsp; CAS 54447-68-6</td></tr><tr><td>Cloreto de oxalila</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O8801</td><td>CAS 79-37-8</td></tr><tr><td>Cloridrato de propargilamina 95%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P50919</td><td>CAS 15430-52-1</td></tr><tr><td>Iodeto de cobre (I)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3140</td><td>CAS 7681-65-4</td></tr><tr><td>Ascorbato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0000039</td><td>CAS 134-03-2</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr>Laboratórios de Espectro<td>de Membrana de Diálise</td><td>, Inc.</td><td>132725</td><td>Membrana de Diálise Spectra/POR 3 Tubulação RC padrão MWCO: 3,5 kD</td></tr></tbody></table>

a síntese de hidrogéis rgd-funcionalizado como uma ferramenta para aplicações terapêuticas

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

O uso de polímeros como biomateriais tem proporcionado vantagens significativas em aplicações terapêuticas. Em particular, a possibilidade de modificar e funcionalizar cadeias poliméricas com compostos capazes de melhorar a biocompatibilidade, as propriedades mecânicas ou a viabilidade celular permite que o design de novos materiais enfrente novos desafios no campo biomédico. Com as estratégias de funcionalização de polímeros, a química do clique é uma ferramenta poderosa para melhorar a compatibilidade celular e as propriedades de entrega de medicamentos de dispositivos poliméricos. Da mesma forma, a necessidade fundamental da biomedicina de usar ferramentas estéreis para evitar potenciais efeitos colaterais adversos, como toxicidade ou contaminação do ambiente biológico, dá origem a um interesse crescente na estratégia assistida por micro-ondas.
A combinação de química de clique e o método assistido por micro-ondas é adequada para produzir hidrogéis biocompatíveis com as funcionalidades desejadas e melhores desempenhos em aplicações biomédicas. Este trabalho tem como objetivo sintetizar hidrogéis funcionalizados com RGD. O RGD (ácido arginilglicilaspártico) é um tripeptídeo que pode imitar proteínas de adesão celular e se ligar a receptores de superfície celular, criando um microambiente hospitaleiro para células dentro da rede polimérica 3D dos hidrogéis. A funcionalização do RGD ocorre por meio da cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen. Alguns grupos carboxila PAA são modificados com uma porção alcina, enquanto o RGD é funcionalizado com ácido azido como resíduo terminal da sequência peptídica. Finalmente, ambos os produtos são usados em uma reação de clique catalisada por cobre para vincular permanentemente o peptídeo ao PAA. Este polímero modificado é usado com carbômero, agarose e polietilenoglicol (PEG) para sintetizar uma matriz de hidrogel. A estrutura 3D é formada devido a uma reação de esterificação envolvendo grupos carboxila de PAA e grupos carbômero e hidroxila de agarose e PEG por meio de policondensação assistida por micro-ondas. A eficiência do mecanismo de gelificação garante um alto grau de funcionalização RGD. Além disso, o procedimento para carregar compostos terapêuticos ou ferramentas biológicas dentro dessa rede funcionalizada é muito simples e reprodutível.

O derivado de alcino PAA é eficientemente sintetizados a partir do ácido poliacrílico e propargilamina, como mostrado na Figura 1 em que n rotula os monómeros cujos grupos carboxilo reagem com a amina. A identidade do produto é confirmada por 1H-RMN espectroscopia. A Figura 5 mostra o 1 H-RMN espectro de PAA modificada com ligação tripla. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig5...

Apresentamos um protocolo para a síntese de hidrogéis funcionalizados com RGD como dispositivos para liberação de células e fármacos. O procedimento envolve cicloadição de alcino-azida catalisada por cobre (CuAAC) entre ácido poliacrílico modificado com alcino (PAA) e um derivado RGD-azida. Os hidrogéis são formados por policondensação assistida por micro-ondas e suas propriedades físico-químicas são investigadas.

A Síntese de hidrogéis RGD-funcionalizado como uma ferramenta para aplicações terapêuticas

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

O objetivo geral desta metodologia é sintetizar hidrogéis para aplicações em engenharia de tecidos de maneira muito simples. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de engenharia de tecidos, como a possibilidade de manter alta viabilidade celular em sistemas de cultivo celular tridimensionais. A principal vantagem desta técnica é que, utilizando uma reação rápida, podemos modificar facilmente os sistemas de hidrogel para melhorar sua capacidade de manter as células viáveis.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de lesão medular, pois as células carregadas dentro do andamio podem reconstruir o tecido danificado. Este método pode fornecer uma compreensão significativa sobre terapias celulares como medicina regenerativa e suas implicações em diversas metodologias. Também pode ser aplicado em vários outros sistemas, como os ósseo, cardíaco e cartilaginoso.Para sintetizar o derivado RGD-azida, dissolva 50 miligramas de RGD em um mililitro de hidróxido de sódio um molar. Em seguida, dissolva 24 miligramas de cloreto de 4-azidobutanato em dois mililitros de tetraidrofuran. Adicione toda a solução de RGD à solução de cloreto de 4-azidobutanato, gota a gota, a zero graus Celsius.Retorne à temperatura ambiente e agite durante a noite. Adicione um mililitro de HCl um molar. Remova o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.Caracterize o produto obtido por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de prótons, dissolvendo a amostra em óxido de deutério ou D2O. Para realizar a modificação alquínica do PAA, dissolva 200 miligramas de uma solução de PAA a 35% em peso em 15 mililitros de água destilada. Adicione 15,4 miligramas de cloreto de propargilamina.Em seguida, dissolva 42,8 miligramas de HOBt em 14 mililitros de uma solução de acetonitrila e água destilada na proporção um para um, aquecendo até 50 graus Celsius. Adicione toda a solução de HOBt à solução de PAA em temperatura ambiente. A seguir, adicione 53,6 miligramas de EDC à mistura de reação.Use HCL molar para ajustar o pH a 5,5 e agite o sistema de reação durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, dissolva 11,2 gramas de cloreto de sódio em dois litros de água destilada. E então adicione 200 microlitros de HCL a 37% peso por peso.Dialise a solução utilizando uma membrana com corte de peso molecular de 3,5 kilodaltons. Realize a diálise durante três dias. Troque a solução de diálise diariamente com dois litros de água destilada recém-preparada contendo 200 microlitros de HCl a 37% peso por peso.Armazene a solução final a menos 80 graus Celsius. Caracterize o polímero funcionalizado por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de prótons, dissolvendo a amostra em D2O. Para sintetizar o polímero PAA-RGD, dissolva 78 miligramas de PAA modificado com alcino em 10 mililitros de água destilada.Em seguida, dissolva 25 miligramas do derivado RGD-azida em cinco mililitros de tetrahidrofuran. Adicione toda a solução de RGD à solução polimérica. A seguir, adicione 2,2 miligramas de iodeto de cobre.E 2,2 miligramas de ascorbato de sódio. Refluxe a mistura resultante durante a noite a 60 graus Celsius com agitação. Resfrie a mistura até 25 graus Celsius.Para realizar a diálise da solução, dissolva 11,2 gramas de cloreto de sódio em dois litros de água destilada e adicione 200 microlitros de HCl a 37% peso por peso. Realize a diálise por três dias. Troque a solução de diálise diariamente com dois litros de água destilada recém-preparada contendo 200 microlitros de HCl a 37% peso por peso.Em seguida, coloque a solução final a menos 80 graus Celsius. Caracterize e armazene o polímero PAA-RGD resultante conforme feito para seus constituintes. Misture 40 miligramas de carbômero e 10 miligramas do PAA funcionalizado em nove mililitros de solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente até dissolução completa.Adicione 400 miligramas de PEG à solução e continue agitando por 45 minutos. Pare a agitação e deixe o sistema repousar por 30 minutos. Em seguida, use hidróxido de sódio 1 M para ajustar o pH a 7,4.A cinco mililitros da mistura obtida, adicione 25 miligramas de pó de agarose. Irradie o sistema com radiação de micro-ondas a 500 watts por 30 segundos a um minuto, até entrar em ebulição. E aqueça eletromagneticamente a solução até 80 graus Celsius.Deixe a mistura exposta à temperatura ambiente até que sua temperatura diminua para 50 graus Celsius. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS para obter uma solução em uma proporção volumétrica de um para um. Prepare uma placa de 12 poços contendo cilindros de aço com diâmetro de 1,1 centímetro.Retire alíquotas de 500 microlitros da solução e coloque-as em cada cilindro de aço. Deixe a placa em repouso por 45 minutos até a completa gelificação do sistema. Remova os cilindros utilizando pinças de aço inoxidável para obter os hidrogéis.Consulte o protocolo textual para a caracterização das propriedades físico-químicas dos hidrogéis funcionalizados com RGD. O Carbomer 974P, o PAA-RGD e o PEG, juntamente com a agarose, participam de uma politcondensação estatística aleatória após irradiação por micro-ondas. Grupos hidroxila presentes no PEG e na agarose reagem com grupos carboxila presentes no Carbomer 947P e no PAA-RGD para formar hidrogéis ACPEG-RGD.Considerando as propriedades reológicas, o módulo de armazenamento mostrou-se aproximadamente uma ordem de grandeza maior que o módulo de perda, indicando um material elástico em vez de viscoso. Além disso, é claramente visível que o comportamento do hidrogel é dominado, em baixos valores de deformação, pelo módulo elástico. A microscopia eletrônica de varredura mostra a morfologia de uma amostra de hidrogel funcionalizado com RGD e de um hidrogel sem funcionalização.Verificou-se que ambos os hidrogéis possuem uma estrutura altamente entrelaçada de poros interconectados, com alguns poros maiores contendo poros menores e algumas redes fibulares nas paredes dos poros. As propriedades semelhantes indicam que a presença de RGD não altera a rede polimérica. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas na área de engenharia de tecidos, permitindo explorar a estabilidade desses sistemas de cultura celular em diversas outras doenças.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como funcionalizar hidrogéis. Melhorando sua capacidade de manter células-tronco viáveis.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Este vídeo é ilustrar um método rápido, eficiente para metacrilato de poli (etileno-glicol), permitindo que as polimerizações de cadeia e síntese de hidrogel. Ele vai demonstrar como a introdução de funcionalidades semelhante metacrilamida em peptídeos, detalhe métodos analíticos comuns para avaliar a eficiência de funcionalização, fornecer sugestões para a solução de problemas e modificações avançadas, e demonstrar técnicas típicas de caracterização hidrogel.

A funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e Peptídeos On-resina para uso em Polimerizações cadeia e formação de hidrogel

Descrevemos um processo sequencial para formação mediada por luz e subsequente padronização bioquímica de matrizes de hidrogel sintético para aplicações de cultura de células tridimensionais. A construção e modificação de hidrogéis com química de fotoclique citocompatível é demonstrada. Além disso, são apresentadas técnicas fáceis para quantificar e observar padrões e determinar a viabilidade celular dentro desses hidrogéis.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Os protocolos são descritos para a fabricação de hidrogel degradáveis thermoresponsive baseado no hidrazona cross-linking de oligômeros polímeros na escala a granel, microescala e escala nanométrica, último para preparação do gel de nanopartículas e nanofibras.

Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

Diferentes métodos para manipular a arquitetura tridimensional em hidrogel à base de proteínas são avaliados aqui com respeito a propriedades do material. As redes se são acrescidas com um peptídeo de célula-adesivo, e sua viabilidade na cultura de pilha é avaliada usando duas linhas de células de modelo diferente.

Fácil manipulação das arquiteturas em hidrogel à base de proteínas para aplicações de cultura de células

Neste método, utilizamos a fotopolimerização e técnicas de química clique para criar padrões de proteína ou peptídeo na superfície de hidrogel de polietileno glicol (PEG), fornecendo imobilizada sinais bioativos para o estudo da resposta celular em vitro .

Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas

Modelos de cultura BICAMADA atuais não permitem para estudos funcionais em vitro que imitam o microambiente que na vivo . Usando o glicol de polietileno e um método de modelagem de óxido de zinco, este protocolo descreve o desenvolvimento de uma membrana basal de biomimetic ultrafinos com rigidez sintonizável, porosidade e composição bioquímica que imita pròxima na vivo matrizes extracelulares.

Cultura de células de hidrogel ultrafinos Porated elástico como uma membrana do porão biomimético para Dual

Este protocolo descreve a síntese e formulação de biomateriais hidrogéis de polímero supramolecular injetável (PNP). As aplicações desses materiais para entrega de medicamentos, estabilização biofarmacêutica e encapsulamento e entrega celular são demonstradas.

Hidrogéis de polímero supramolecular injetável para aplicações de entrega de células e medicamentos

O protocolo aqui apresentado mostra a síntese de um forte hidrogel adesivo gelatina o-nitrosobenzaldeído (gelatina-NB). A gelatina-RN tem uma capacidade de adesão tecidual rápida e eficiente, que pode formar uma forte barreira física para proteger as superfícies das feridas, por isso espera-se que seja aplicada no campo da biotecnologia de reparação de lesões.

Síntese de Hidrogel Adesivo Forte, Gelatina O-Nitrosobenzaldeído

Aqui, apresentamos dois protocolos para incorporar reações de síntese proteica livre de células em matrizes de hidrogel em macroescala sem a necessidade de uma fase líquida externa.

Métodos para Incorporação de Reações de Síntese Proteica Livre de Células em Hidrogéis em Macroescala

Aprenda a sintetizar hidrogéis funcionalizados com RGD para engenharia de tecidos usando polimerização assistida por micro-ondas. Este método melhora a viabilidade celular em culturas tridimensionais e oferece aplicações promissoras em medicina regenerativa.

A Síntese de hidrogéis RGD-funcionalizado como uma ferramenta para aplicações terapêuticas

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