Enumeração de células-tronco neurais Usando clonais Ensaios

O objetivo geral deste procedimento é enumerar a frequência de células-tronco neurais em uma população determinada, utilizando a formação e diferenciação de neuroesferas sob condições clonais. Este método possui utilidades fundamentais no campo das células-tronco neurais, como a avaliação de marcadores candidatos a células-tronco neurais, a purificação de células-tronco neurais e a distinção entre células-tronco neurais e progenitores neurais. As vantagens deste método são que ele leva 13 dias para ser realizado, o que é mais curto do que os métodos atuais para numerar a frequência de células-tronco neurais, e é realizado sob condições clonais.

Para iniciar este procedimento, no primeiro dia, prepare o meio de crescimento para CENs combinando o meio DMEM F12 com B27, EGF, BFGF e penicilina-estreptomicina. Em seguida, dissocie neuroesferas de camundongo E14.5 em um mililitro de meio de crescimento para CENs e um mililitro de hidróxido de sódio 0,05 normal durante sete minutos à temperatura ambiente. Pipete as células para cima e para baixo ocasionalmente para mantê-las em suspensão e, então, adicione um mililitro de ácido clorídrico 0,05 normal para neutralizar a alcalinidade.

Após isso, realize uma contagem celular utilizando coloração com azul de tripano e um hemocitômetro. Em seguida, semeie células de neuroesfera de camundongo E14.5 individualmente numa densidade de 50 células por mililitro ou menos, em 100 microlitros de meio de crescimento para CNEs, em uma placa de 96 poços. Incube as células a 37 graus Celsius, 5%CO2, por uma semana para gerar neuroesferas clonais.

Para cultivar neuroesferas para o meio condicionado, no terceiro dia dissocie neuroesferas de camundongo E14.5 e semeie as células individuais numa densidade de 20.000 células por mililitro em 10 mililitros de meio de crescimento para Células-Tronco Neurais em uma placa de cultura de 10 centímetros. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius, 5%CO2 por cinco dias para gerar neuroesferas cultivadas em massa. No oitavo dia, prepare a solução de revestimento misturando 700 microlitros de poli-L-lisina a 0,01%, 70 microlitros de laminina, adicione um miligrama por mililitro e 6.230 microlitros de PBS.

Em seguida, recubra uma placa de cultura de 10 centímetros com sete mililitros de solução de poli-L-lisina laminina por duas horas a 37 graus Celsius. Usando uma pipeta serológica de 10 mililitros, transfira todas as neuroesferas cultivadas em massa para um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugue as neuroesferas a 171 ×g por um minuto à temperatura ambiente e remova completamente o sobrenadante.

Em seguida, prepare o meio de diferenciação de Células-Tronco Neurais combinando o meio DMEM F12 com B27 e SBF. Adicione 10 mililitros do meio de diferenciação de Células-Tronco Neurais aos neuroesferoides e pipete para cima e para baixo algumas vezes para ressuspender os neuroesferoides. Em seguida, aspire a poli-L-lisina laminina do prato de cultura de 10 centímetros e lave uma vez com 10 mililitros de PBS.

Transfira todas as neuroesferas para a placa de cultura de 10 centímetros revestida com politlisina e laminina, e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius, 5%CO₂, para que as neuroesferas adiram à placa. No oitavo dia, conte o número de neuroesferas formadas em cada poço sob microscópio, em seguida, recubra cada poço de uma lâmina com câmara de 50 poços com 10 microlitros de solução de revestimento de politlisina e laminina por duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare três tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros contendo 30 mililitros de PBS cada.

Com pinças estéreis, remova o lamínula com câmara de 50 poços revestido, mergulhe o lamínula com câmara no primeiro tubo de PBS, seguido pelo segundo e depois pelo terceiro tubo de PBS, para remover a solução de revestimento. Em seguida, aspire qualquer líquido remanescente dos poços do lamínula com câmara. Transfira cuidadosamente todo o meio e as neuroesferas de cada poço da placa de 96 poços para um único frasco de cultura de 10 centímetros.

Certifique-se de que apenas uma neuroesfera seja selecionada cada vez, ajustando a coluna da pipeta para dois microlitros; sob o microscópio, escolha uma neuroesfera de exemplo usando uma micropipeta P10 equipada com uma ponteira de 10 microlitros. As neuroesferas podem ser selecionadas sob o microscópio, colocadas em uma cabine de fluxo laminar ou sobre uma bancada. Em seguida, transfira a neuroesfera para o centro de um poço da lamínula com câmara de 50 poços revestida.

Repita os procedimentos até que cada poço da lamínula com câmara contenha uma neuroesfera. Em seguida, adicione 10 microlitros de meio de diferenciação de CNT a cada poço da lamínula com câmara. Coloque a lamínula com câmara em uma placa de cultura de 10 centímetros.

Pode-se colocar até dois lamínulas com câmara em uma placa de 10 centímetros. Pipete PBS ao longo das bordas da placa para evitar o ressecamento do meio de diferenciação de CEN. Incube a lamínula com câmara durante a noite a 37 graus Celsius, 5%CO2.

No nono dia, transfira o meio condicionado dos neuroesferoides cultivados em massa para um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Usando uma seringa estéril de 20 mililitros, passe o meio condicionado através de um filtro de 0,2 micrômetro para remover quaisquer células ou debris. Em seguida, transfira o meio condicionado filtrado de volta para a placa de cultura de 10 centímetros.

Em seguida, utilizando pinças estéreis, coloque cuidadosamente a lamínula com câmara sobre o meio condicionado de forma invertida, de modo que as neuroesferas da amostra fiquem voltadas para baixo. Incube a lamínula com câmara por três dias a 37 graus Celsius, 5%CO2. No dia 12, remova cuidadosamente a lamínula com câmara do disco de cultura de 10 centímetros utilizando pinças estéreis.

Mergulhe suavemente a lamínula em PBS para remover o meio condicionado. Em seguida, retire a junta de silicone da lamínula, fazendo isso com cuidado e lentamente para evitar quebrar a lamínula. Observe atentamente o lado onde os neuroesferoides diferenciados estão aderidos.

Após isso, pipete um milímetro de paraformaldeído 4% sobre um pedaço de filme de parafina cortado no tamanho do lamínula. Coloque suavemente o lamínula sobre o filme de parafina com os neuroesferas voltados para baixo, em contato com o paraformaldeído, e fixe os neuroesferas por 20 minutos à temperatura ambiente. Aqui, neuroesferas individuais foram selecionadas e diferenciadas em um lamínula com câmara de 50 poços durante três dias.

Esta é uma imagem representativa de uma neuroesfera tripotente corada com DAPI e imunomarcada para GFAP, TUJ1 e O4. Esta imagem mostra a sobreposição de DAPI, GFAP, TUJ1 e O4. Este protocolo é utilizado para avaliar a capacidade da LeX, um marcador conhecido de CENs, de enriquecer células-tronco neurais. Este gráfico mostra a porcentagem de neuroesferas unipotentes, bipotentes e tripotentes geradas por células LeX positivas e LeX negativas. As células LeX positivas geram significativamente mais neuroesferas tripotentes do que as células LeX negativas.

Esta tabela mostra que a frequência de células-tronco neurais (NSC) de células LeX positivas e LeX negativas foi calculada como o produto do NFU e a porcentagem de neuroesferas tripotentes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como as neuroesferas podem ser cultivadas e diferenciadas em condições clonais para quantificar a frequência de células-tronco neurais. Ao realizar este método, é importante usar meios de crescimento e diferenciação recém-preparados, bem como solução de revestimento recém-preparada, para garantir condições ideais de crescimento e diferenciação para as neuroesferas.

Uma vez dominado, este método pode ser realizado em 13 dias, um período mais curto comparado aos métodos atuais para enumerar a frequência de células-tronco neurais. Este método poderia ser usado em conjunto com métodos atuais, como o ensaio de formação de colônias neurais, para enriquecer células-tronco mais jovens e identificar um marcador definitivo de célula-tronco neural.