Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas Escherichia coli: Concepção, produção e purificação

O objetivo geral deste procedimento é purificar e caracterizar vesículas bacterianas da membrana externa cheias de enzimas para uso como reagentes catalíticos in vitro. Essa técnica de isolamento enzimático permite que OMVs bacterianos sejam colhidos de meios de cultura e, em seguida, empregados para conduzir a catálise livre de células de um composto organofosforado. O empacotamento direcionado dentro de OMVs bacterianos melhora significativamente a estabilidade enzimática em uma variedade de condições de reação e armazenamento, ao contrário das técnicas tradicionais que geralmente resultam em uma perda gradual e contínua da atividade enzimática.

As implicações dessa técnica se estendem ao empacotamento de proteínas com relevância em vários campos, como o desenvolvimento de terapias, remediação ou desenvolvimento de sistemas catalíticos livres de células. Embora este protocolo detalhe a purificação de OMVs de E.coli, as técnicas com modificação na estratégia de embalagem podem ser prontamente usadas para purificação de OMV de uma variedade de culturas de células microbianas. Depois de gerar vesículas de membrana externa ou OMVs em bactérias de acordo com o protocolo de texto, centrifugue o meio de cultura bacteriano intacto a 7.000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos.

Remova e guarde o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. Em seguida, coloque o sobrenadante em uma segunda centrifugação para garantir que todas as bactérias sejam removidas do meio. Para remover agregados de proteínas e material celular grande do meio de cultura salvo, coloque a solução em uma seringa estéril de 10 a 50 mililitros.

Conecte um filtro de 0.45 mícron para atrair a extremidade da seringa. Em seguida, pressione o êmbolo e colete o fluxo em um novo tubo. Em alternativa, filtre a vácuo o meio de cultura, transferindo-o para um aparelho de filtração estéril.

Conecte a unidade a uma bomba de vácuo ou aspirador de pia para gerar sucção. Transfira o meio filtrado para um novo recipiente. Para isolar os OMVs, transfira o meio de cultura filtrado para tubos de ultracentrifugação.

Gire o meio a aproximadamente 150.000 vezes G e quatro graus Celsius por três horas usando um rotor que corresponda aos tubos que estão sendo utilizados. Imediatamente após a ultracentrifugação, para evitar a perda de massa do pellet, decantar o meio de cultura empobrecido com OMV do pellet OMV ligeiramente castanho, que pode ou não ser visível a olho nu. O pellet OMV formado após a ultracentrifugação só pode ser frouxamente aderido à vesícula de centrifugação.

Deve-se ter cuidado ao decantar para garantir que o pellet não seja desalojado e perdido. Guarde o sobrenadante para posterior dispersão dinâmica de luz para verificar se as partículas OMV foram totalmente esgotadas do meio. Adicione 0,5 a um mililitro de PBS filtrado estéril, PH 7,4 ou outro tampão filtrado, conforme determinado pelas necessidades ou condições experimentais, ao pellet e deixe-o incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, pipete cuidadosamente a solução purificada de OMV, misturando suavemente para garantir que todo o pellet foi solubilizado. Para determinar a distribuição de tamanho OMV, abra o software de rastreamento de nanopartículas DLS para o instrumento que está sendo usado. Ligue o microscópio e limpe todas as superfícies do microscópio e da unidade de rastreamento de nanopartículas.

Usando uma seringa estéril de um mililitro, adicione aproximadamente 0,5 mililitros de amostra OMV diretamente à janela de visualização do dispositivo de rastreamento de partículas através do encaixe inferior, tomando cuidado para cobrir toda a janela de visualização sem injetar bolhas de ar no sistema. Coloque a unidade de rastreamento de nanopartículas no microscópio stage e ligue o laser. Em seguida, clique em Capturar no software.

Ajuste o foco e a platina do microscópio para visualizar as partículas na tela de visualização presente na janela do software. Ajuste o obturador da câmera e o ganho da câmera até que as partículas brilhantes sejam claramente visualizadas em um fundo escuro. Ajuste a duração da captura para 60 segundos e clique em Gravar.

Quando solicitado, insira a temperatura do dispositivo de amostra, rotule a amostra e salve os dados de vídeo na conclusão de cada execução em uma pasta designada pelo usuário. Mantenha todos os parâmetros de análise no modo de detecção automática e clique em Processar sequência. Registre a distribuição e a concentração do tamanho das partículas como partículas por mililitro, conforme determinado pelo software.

Para determinar o teor de proteína OMV, use SDS-PAGE e Western Blots para avaliar a produção da enzima de pureza OMV e a eficiência de reticulação SpyCatcher ou SC para SpyTag ou ST. É imperativo confirmar a expressão das enzimas alvo e da proteína âncora. A expressão de proteínas recombinantes muitas vezes pode não ser bem-sucedida por vários motivos e a produção bem-sucedida de proteínas deve ser confirmada antes da caracterização do OMV.

Para realizar um ensaio de atividade de fosfotriesterase ou PTE, adicione cinco microlitros de uma diluição de um a 1.000 de paraoxon em tampão CHES a cinco microlitros de OMVs purificados em 90 microlitros de CHES. Faça leituras de absorbância a 405 nanômetros e 348 nanômetros a cada 20 segundos por aproximadamente duas horas de tempo total de reação para monitorar a progressão do produto de degradação do paraoxon cromogênico p-nitrofenol. Por fim, realize a análise dos dados de acordo com o protocolo de texto.

Aqui são mostrados exemplos da morfologia de OMVs purificados de E.coli via SEM. Os OMVs variam em tamanho de 50 a 250 nanômetros, conforme determinado usando instrumentação de rastreamento de partículas. Neste gráfico, a concentração absoluta de OMV é mostrada.

Quando o N terminal OMP-A-ST foi co-transformado com PTE-SC na presença de arabinose e IPTG, foi observado um aumento significativo na produção de OMV em comparação com as amostras controle. O SDS-PAGE e os Western Blots vistos aqui caracterizam ainda mais o conteúdo de proteína OMV e a expressão de proteína recombinante para OMP-A-ST, OMP-A nativo, PTE-SC e OMP-A-ST-PTE-SC. Nesta figura, os níveis gerais de expressão de PTE e a eficiência de empacotamento de OMV nos pellets de células, sobrenadante de UC e pellets de UC OMV purificados foram determinados por medições de velocidade inicial usando paraoxon como substrato cromogênico.

Aqui, o Triton X-100 foi usado para verificar a translocação de paraoxon em bicamadas OMV intactas. Houve pouca diferença de atividade com ou sem detergente, indicando que o paraoxon passa livremente pelos poros endógenos do OMV. Finalmente, como visto neste experimento, os dados cinéticos de PTE-SC são ajustados a uma equação cinética enzimática padrão de Michaelis-Menten para N terminal OMP-A-ST co-transformado com PTE-SC na presença de uma arabinose e IPTG e PTE-SC na presença de ativação de arabinose.

Uma vez que todas as construções genéticas tenham sido feitas e confirmadas, o empacotamento da enzima e a purificação do OMV podem ser realizados em um período de dois dias. Um terceiro dia é necessário para confirmar e caracterizar OMVs sempre que um novo construto é desenvolvido. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar as classificações de segurança de todos os materiais e equipamentos de centrifugação.

Além disso, é importante verificar o sucesso de cada etapa antes de prosseguir para a próxima. As etapas de caracterização descritas aqui podem ser complementadas com outras para confirmar o empacotamento enzimático e a morfologia do OMV. A concentração de proteínas, o conteúdo lipídico, a concentração de LPS e muitas outras propriedades podem variar com diferentes cargas úteis e condições de adução e podem influenciar as aplicações a jusante.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como purificar e caracterizar OMVs cheios de enzimas, bem como realizar ensaios preliminares para avaliar a atividade da carga enzimática. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias e reagentes químicos pode ser extremamente perigoso e precauções como técnica asséptica adequada e equipamento de proteção individual devem sempre ser usadas durante a realização deste procedimento.