Name: Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas Escherichia coli: Concepção, produção e purificação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a purificar e caracterizar vesículas de membrana externa de Escherichia coli contendo enzimas encapsuladas. Este método melhora a estabilidade enzimática para aplicações em catálise sem células e biotecnologia.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Escritório de Pesquisa Naval por meio de fundos principais fornecidos ao Laboratório de Pesquisa Naval.

1. Preparação dos plasmídeos <ol><li> Prepare um plasmídeo (por exemplo, pET22) contendo a proteína de ancoragem (OmpA) fundido com um domínio de ligação bi-ortogonal (referido no presente protocolo como âncora-ST), tag epitopo (como 6xHis, myc ou bandeira de tags para a purificação e identificação), tag periplasmático localização, a resistência aos antibióticos, e de origem adequada de replicação com base na estirpe bacteriana seleccionada 7. <ol><li> Extrair DNA de plasmídeo a partir de culturas durante a noite utilizando um kit de isolamento de ADN comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Preparar um plasmídeo (por exemplo, pACYC184) contendo a enzima / proteína (TEP) a ser embalado dentro do OMV fundido com o domínio de ligação bioorthogonal complementar à da proteína de ancoragem (referido neste protocolo como enzima-SC), etiqueta de epitopo, tag periplasmático localização, a resistência aos antibióticos, que é diferente do que o plasmídeo de proteína de âncora, e orig adequadoem de replicação com base na estirpe bacteriana seleccionada 7. <ol><li> Extrair DNA de plasmídeo a partir de culturas durante a noite utilizando um kit de isolamento de ADN comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante 7. </li></ol></li></ol> 2. Geração de uma cultura de E. coli OMV Packaging <ol><li> O isolamento de plasmídeo <ol><li> Purifica-se plasmídeos que codificam a enzima-SC construir e âncora-ST constrói a partir de linhas celulares de manutenção separadas utilizando um kit de isolamento de plasmídeo comercial de acordo com o protocolo do fabricante 7. Determinar a concentração e pureza do DNA por medição da absorvência a 260 nm e 280 nm. </li></ol></li><li> A co-transformação <ol><li> Seleccionar uma estirpe de E. coli, que está comercialmente disponível para facilitar a expressão de proteínas. NOTA: BL21 células (DE3) foram utilizados aqui. O lisogene de T7 é necessário para a expressão da construção de ancoragem-ST, que se baseia no promotor T7 e T7 ARN polimerase para protexpressão ein. A utilização de outras estirpes de bactérias exige quer a presença do gene lisogénio de T7 ou a utilização de um plasmídeo diferente pET22 7. </li><li> Dilui-se DNA de plasmídeo purificado a concentrações equivalentes molares, em seguida transformá-las em células bacterianas competentes, quer através de transformação de choque térmico ou electroporação, seguindo o protocolo do fabricante para as células competentes escolhidas. </li><li> células da placa transformada Onto Luria-Bertani (LB) placas de ágar com ampicilina (pET22) e cloranfenicol (pACYC184) contendo antibiótico; ambos presentes em concentrações finais de 25 ug / ml. </li><li> Colocar a placa de cultura a 37 ° C durante a noite para isolar apenas os clones que contêm ambos os plasmídeos. NOTA: As colónias que sobrevivem a selecção de antibiótico irá ser utilizado para todas as preparações futuras de OMV. Os antibióticos (ampicilina e cloranfenicol) será adicionada a todas as culturas líquidas para manter a pressão selectiva e assegurar a presença de ambos os plasmídeos. </li></ol></li></ol> 3. OMV Produção <ol><li> Expansão Colony <ol><li> Inocular 5 ml de meio de cultura (tipicamente Terrific Broth (TB) ou LB) contendo antibióticos nas concentrações acima mencionadas (passo 2.2.3) com uma única colónia a partir das placas de selecção descrito no 2.2.4. </li><li> Efectuar uma diluição 1: 100 de dobragem da cultura fermento durante a noite em frascos de cultura com deflectores. NOTA: Use um volume de mídia entre 250-500 ml. </li><li> Manter a cultura a 37 ° C com agitação a 250 rpm para garantir que o arejamento suficiente da cultura é atingido. </li></ol></li><li> Indução de cada plasmídeo <ol><li> Permitir que a cultura bacteriana para crescer a uma DO 600 de 0,6-0,8, cerca de 3 h de crescimento após a inoculação do balão de crescimento primário. </li><li> Para melhorar o rendimento final de TEP-SC vesículas carregadas, centrifugar toda a cultura a 7000 xg durante 15 min. Ressuspender o sedimento celular em pré-aquecido, o meio de cultura fresco. NOTA: Este optional passo ajuda a remover qualquer OMV vazio que estão presentes no meio de cultura antes da indução PTE-SC. </li><li> Adicione uma solução de 20% de L-arabinose em água e filtro estéril usando um filtro de 0,22 um. Loja solução de L-arabinose a 4 ° C durante 2-4 semanas. </li><li> Adicionar a solução de L-arabinose para o frasco de cultura para uma concentração final de 0,2% para iniciar a produção de TEP-SC. NOTA: Isso ajuda a pré-carregar o espaço periplásmico com PTE-SC antes da promoção de um maior vesiculation através da indução do mutante OmpA-ST. </li><li> Adicione uma solução 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) em água e filtro estéril usando um filtro de 0,22 um. NOTA: IPTG deve ser utilizado imediatamente, uma vez hidratado. Alíquotas de IPTG pode ser armazenado congelado durante 3-6 meses e pode ser descongelado imediatamente antes de usar. </li><li> Adicionar IPTG após um período de incubação adicional de três horas a uma concentração final de 0,5 mM, para iniciar a produção do OmpA-ST. </li><li> Permitir que a cultura-se crescer durante um adicional de 8-14 h a 37 ° C enquanto se agita. </li></ol></li></ol> 4. OMV Purificação <ol><li> Remoção de bactérias intactas <ol><li> Centrifuga-se o meio de cultura bacteriana durante 15 minutos a 7000 xg, a 4 ° C para sedimentar as bactérias intactas. </li><li> Decante, e salvar, os meios de comunicação fora do topo do poste centrifugação pellet celular tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> Repita os passos 4.1.1 e 4.1.2 para um ciclo de centrifugação adicional para garantir todas as bactérias intactas são removidos do meio de cultura tendo a certeza de decantar e salvar a mídia. </li></ol></li><li> A remoção de agregados de proteína <ol><li> Purificar o meio de cultura bacteriana utilizando um filtro de membrana de 0,45 um para remover as bactérias residuais e material celular indesejada grande. NOTA: Use um material de membrana biologicamente compatível para recuperações mais elevadas e adsorção de proteínas inferior, tais como acetato de celulose (CA) ou fluoreto de polivinilideno (PVDF). volumes de filtro de seringa inferior a 100 ml e volumes de filtro de vácuo superiores a 100 ml. <ol><li> Para filtro de seringa, desenhar meio de cultura em estéril seringa 10-50 ml. Encaixe de 0,45 um filtro de extremidade de Luer da seringa. Deprimir êmbolo e recolher flow-through em um novo navio. </li><li> Para aspirar filtro, transferir o meio de cultura a um aparelho de filtração estéril. Anexar unidade a bomba de vácuo ou afundar aspirador para gerar sucção. Transferência médio filtrada para nova embarcação. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento de OMV através Ultracentrifugação <ol><li> Adicione o meio de cultura filtrado em tubos de centrifugação tendo o cuidado de equilibrar tubos opostos na centrífuga. </li><li> Pelete a ~ 150.000 x g durante 3 horas a 4 ° C em uma ultracentrífuga com o rotor correspondente combinando tanto o instrumento e os tubos a ser utilizado. </li><li> Decanta-se o meio de cultura esgotado OMV a partir do sedimento OMV, tomando cuidado para não perturbar o sedimento OMV, imediatamente após a conclusão óf centrifugação como permitir a pastilha OMV permanecer nos meios de comunicação irá amolecer o sedimento reduzindo recuperação OMV. NOTA: Este sedimento será ligeiramente acastanhada e, dependendo da quantidade de partida de cultura bacteriana podem ou não podem ser visíveis a olho nu. Aspirando o suporte directamente a partir do topo do tubo de centrifugação, também é uma opção tendo em mente que os materiais removidos mais do OMV sedimentar o mais pura a amostra final será OMV. </li><li> Salve o sobrenadante centrifugado para testes mais tarde dinâmica de espalhamento de luz (DLS) para verificar se as partículas OMV foram totalmente descarregada a partir da mídia. </li><li> Adicionar 0,5-1 ml de filtrado tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4 ou 100 mM de tampão estéril N -ciclo-hexil-2-aminoetanossulfónico ácido (CHES) a pH 8,0 e o sedimento de OMV permitindo-se incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Certifique-se de que o sedimento não seca. NOTA: Os extremos em solução de força iónica, pH e temperatura podem resultar em reduzida solubilidade OMV e promover aggregação. </li><li> Cuidadosamente pipetar a solução purificada OMV a partir do tubo de centrífuga, misturando suavemente para assegurar que toda a pelete foi solubilizada. </li></ol></li></ol> 5. OMV Caracterização <ol><li> Usar qualquer software DLS ou rastreamento de nanopartículas comercialmente disponível seguindo os protocolos do fabricante fornecida únicas para cada instrumento para determinar a distribuição de tamanho OMV e concentração de partículas. NOTA: Aqui, distribuição de tamanho de OMV e concentração foi determinada utilizando NanoSight LM10 nanopartículas de rastreamento e software Análise NTA 2.3. <ol><li> Abra o software. </li><li> Ligue microscópio e limpar todas as superfícies da unidade de microscópio e rastreamento de nanopartículas. </li><li> Adicionar ~ 0,5 ml de amostra OMV directamente para a janela de visualização do dispositivo de localização de partículas através do encaixe Luer, com uma seringa esterilizada de 1 ml sendo certo para cobrir toda a janela de visualização, sem qualquer injecção de bolhas de ar no sistema. </li><li> lugar tele nanopartículas unidade de rastreamento no palco microscópio e ligar o laser. </li><li> Clique &quot;captura&quot; do software. </li><li> Ajuste o foco do microscópio e palco para visualizar as partículas na tela de visualização atual na janela do software. </li><li> Ajuste o &quot;obturador da câmera&quot; e &quot;Ganho Camera&quot; até que as partículas brilhantes são claramente visualizados em um fundo escuro. </li><li> Ajustar a duração de captura a 60 seg. </li><li> Clique em &quot;Record&quot;. </li><li> Quando solicitado, a entrada da temperatura / dispositivo de amostra, rotular a amostra, e salvar os dados de vídeo na conclusão da cada correr em uma pasta designada usuário. </li><li> Mantenha todos os parâmetros de análise (limiar de detecção, Blur, Pista Min Comprimento, Min esperado Particle Size) no modo de detecção automática e clique em &quot;sequência do processo.&quot; NOTA: Consulte o manual para saber como cada parâmetro pode ser ajustado de forma independente para os resultados da análise sintonia fina. </li><li> Ficha de distribuição de tamanho de partícula e as partículas / mL concentração tal como determinado pelo software. NOTA: Uma gama de tamanho hidrodinâmico OMV típica situa-se entre 30-200 nm com uma concentração de partículas / ml de ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Determinando OMV conteúdo Protein <ol><li> Use padrão de SDS-PAGE e protocolos de Western blot para avaliar a pureza OMV, a produção da enzima, e a eficiência de reticulação SC-ST 7. NOTA: A reticulação eficiência não é 100% 7. </li></ol></li></ol> 6. Verificação de Enzyme Packaging <ol><li> PTE Activity Assay <ol><li> Executar todos os ensaios enzimáticos em um tampão adequado, tal como tampão CHES 100 mM (pH 8) a 25 ° C em qualquer uma cuvete ou multiplexados numa placa de 96/384. </li><li> Adicionam-se 5 ul de uma diluição de 1: 1000 em tampão de paraoxon CHES 90 ul de CHES e 5 ul de OMV purificado (~ 36 vezes concentrada em comparação com a concentração de OMV presente no meio de cultura). Cuidado: Paraoxônio é um pesticida tóxicoe devem ser manuseados por fabricante e diretrizes institucionais. </li><li> Aqui as leituras de absorvância a intervalos regulares (cada 20 seg durante ~ 2 horas tempo total de reacção), a 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) e a 348 nm (ponto ε isosbestic = 5,4 mM-1cm-1) para se monitorizar a progressão da reacção do produto de decomposição paraoxon cromogénico, p-nitrofenol. NOTA: A valores de pH acima de 8 a forma desprotonada dominante do p-nitrofenol está presente permitindo um acompanhamento preciso a 405 nm. Em todas as outras soluções de complexo ou a diminuição do pH, é necessário utilizar o ponto isosbestic de 348 nm como múltiplas formas de o p-nitrofenol estará presente. </li><li> Calcular as velocidades iniciais de reacção através da determinação do declive da porção linear das curvas de progresso do passo 6.1.3 para comparar a quantidade relativa de TEP, em cada amostra, a eficiência de embalagem, e a produção total de TEP. </li><li> Execute enzimática padrãoprotocolos de ensaio para determinar K M, V max e gato k para a OMV encapsulado PTE. NOTA: A análise de Lineweaver-Burk pode ser utilizado para a determinação destes parâmetros cinéticos em que a intercepção de y = 1 / V max e de K = declive M / 20 V máx. </li></ol></li><li> Transmembrana Substrato / difusão do produto. <ol><li> Realizar a mesma análise cinética de ensaio tal como descrito no passo 6.1 utilizando concentrações crescentes de Triton X-100 em tampão CHES de 0-3% em volume. NOTA: A adição de Triton X-100 para as funções de OMV solubilizados para interromper a bicamada lipídica para permitir que o conteúdo do OMV ser livremente acessível à solução de reacção. </li><li> Calcular e comparar as velocidades iniciais em cada nível de Triton X-100 para verificar a passagem transmembranar do substrato / produto indicado por alteração mínima da actividade da enzima (velocidades iniciais) em comparação com a actividade da enzima in a ausência de Triton X-100. Se um aumento substancial na actividade enzimática é observado na presença de Triton X-100, é provável que o substrato não difundem livremente para dentro do OMV. </li><li> actividade da enzima livre de ensaio (como descrito acima na secção 6.1) na presença de Triton X-100 para verificar que a actividade da enzima não é inibida pelo próprio agente tensioactivo. NOTA: Se a actividade é grandemente influenciado por Triton X-100, aditivos alternativos, tais como saponinas ou diferentes polissorbato / tween surfactantes podem ser mais adequados para romper a membrana de OMV. </li></ol></li></ol> 7. OMV Armazenamento <ol><li> Congelando <ol><li> alíquotas lugar ~ 100 l de OMV purificado diretamente em nitrogênio líquido para tirar congelar as alíquotas sendo cuidado para não submergir totalmente os frascos ou entre em contato com qualquer azoto líquido com a própria amostra. NOTA: Purificada OMV podem ser congeladas rapidamente directamente no tampão que foi escolhida para solubilizar o sedimento durante a purificação de OMVprocesso de ion sem crioprotetores adicionais necessárias 7. </li><li> Conserve as alíquotas congeladas rapidamente a -80 ° C. </li><li> Descongelar alíquotas congeladas a partir do passo 7.1.1, colocando-os à temperatura ambiente sendo cuidado para não aquecer as amostras. </li><li> Antes da preparação de todas as amostras para o armazenamento desta maneira realizar o ensaio enzimático descrito no passo 6.1 comparando as velocidades iniciais antes e após congelação para verificar que não há perda significativa de actividade da enzima pós congelação-descongelação. NOTA: loja purificado OMV a 4 ° C, se uma redução na actividade enzimática é observada devido à congelação. </li></ol></li><li> Liofilização <ol><li> Liofilizar as aliquotas congeladas rapidamente OMV purificadas utilizando equipamento de liofilização comercialmente disponível 21. </li><li> Loja liofilizada alíquotas à temperatura ambiente durante semanas ou a -80 ° C durante muitos meses. </li><li> Adicionar o mesmo volume de água purificada para a OMV como liofilizado antes da liofilização e deixar em repouso à temperatura ambiente durante 30 minutos para re-hidratar tele provar. Misture delicadamente quando seja necessário cuidado para não vórtice ou sonicate da OMV. </li><li> Adicionar liofilizado em pó OMV directamente para o ponto-de-cuidado para aplicações onde antes de diluição / solubilização não é necessário. </li></ol></li></ol>

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<li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast%2C+efficient%2C+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+BioSyst%22%5BJournal%5D)">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li>
<li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils%3A+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Este protocolo funções para demonstrar um representante dirigido técnica de embalagem em que uma enzima de interesse é produzido e embalado em OMV por E. coli. Tal como com muitas técnicas complexas, existem várias áreas em que o protocolo pode ser modificado para acomodar para uso em diferentes aplicações únicas, algumas das quais são descritas abaixo. Enquanto o mecanismo de OMV embalagem e encapsulamento enzima pode ser adaptado às necessidades específicas existem várias etapas dentro deste protocolo que são...

Apresentado aqui é um método para a concepção, produção e purificação de vesículas carregadas por enzimas bacterianas da membrana externa (OMV). OMV são pequenos, principalmente unilamelar, proteolipossomas que variam em tamanho de 30-200 nm, de 1,2. Todas as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas que foram estudados até à data demonstraram libertação de qualquer das OMV ou vesículas extracelular (EV) de sua superfície de 3,4. O mecanismo preciso pelo qual OMV são produzidos ainda não foram completamente elucidados, devido às diversas populações bacterianas que eles, bem como as diferentes funções que eles servem secretam. OMV foram mostrados para o transporte de uma ampla gama de cargas de pequenas moléculas, péptidos, proteínas e material genético para servir uma variedade de sinalização complexas, a translocação do gene, e virulência funciona 5,6. Os mecanismos exactos de OMV biogénese não estão bem caracterizados, e parecem diferir entre as espécies bacterianas. apesar this verdade, temos desenvolvido um método para melhorar a eficiência de embalagem de uma proteína recombinante em OMV através da criação de uma ligação sintética entre uma proteína de interesse e uma proteína endógena altamente abundantes na membrana externa bacteriana e subsequente OMV. Na ausência de uma ligação sintética, ou incorporados artificialmente afinidade, entre a proteína expressa de forma recombinante e a OMV a eficiência de embalagem observada é muito baixo 7. Este resultado é de se esperar que a incorporação das proteínas dentro da OMV quer ocorre por meio de encapsulamento acaso no preciso momento da formação de OMV na superfície bacteriana ou através de uma embalagem dirigido por mecanismos que não são bem compreendidos. Algum sucesso foi observado em proteínas de embalagem simplesmente através da sobre-expressão dentro do espaço periplásmico que depende de encapsulamento acaso mas eficaz embalagem é altamente dependente da proteína com algumas proteínas de embalagens, a eficiência elevada comparado com outras tha não embalar em tudo 8-10. Através da utilização de técnicas de biologia sintética comuns procuramos projetar Escherichia coli (E. coli) para produzir simultaneamente, pacote e secretar uma enzima ativa de interesse em OMV que contorna as limitações do conhecimento atual sobre como OMV são formados e como a carga é selecionada pelas bactérias para embalagem. Para os fins deste pedido de um sistema de divisão de bioconjugação proteína foi escolhida como a ligação sintética de escolha para facilitar a embalagem direccional no OMV. Tal como o nome sugere um sistema de bioconjugação proteína de separação é constituída por duas subunidades domínios complementares que interagem um com o outro. Os domínios proteicos separação seleccionadas para efeitos deste protocolo são referidos como o SpyCatcher (SC) e SpyTag domínio (ST) e são derivados da proteína de ligação pyogenes Streptococcus fibronectina (FbaB) 11. Este sistema de proteína de divisão é incomum em que wuando as duas subunidades estão dentro da proximidade de uma ligação isopéptido forma espontaneamente entre as extremidades proximal resíduos de ácido aspártico e de ácido amino de lisina, criando uma ligação covalente. Formação da ligação isopéptido não requer a adição de proteínas chaperonas, enzimas, catalisadores ou cofactores e pode facilmente ocorrer à temperatura ambiente (TA) e sobre uma ampla gama de condições f isiologicamente relevantes 12. Como prova do conceito, phosphotriesterase (TEP) (EC 3.1.8.1) a partir de Brevundimonas diminuta foi seleccionado para ser embalado em E. coli derivada OMV 13. TEP contém um Zn / Zn local activo binuclear e tem a capacidade de quebrar organofosfatos através de uma reacção de hidrólise convertendo aryldialkylphosphates em dialkylphosphates e álcoois arilo 14. A exposição a organofosforados prejudica a função neurotransmissor adequada através da inibição da hidrólise da acetilcolina pela acetilcolinesterase nas junções neuromusculares Makincompostos derivados g organofosforados extremamente perigosas 15. A exposição prolongada ou significativa para organofosforados geralmente resulta em convulsões incontroláveis e, normalmente, causa a morte por meio de asfixia. Enquanto TEP apresenta a maior actividade catalítica em relação paraoxon, um insecticida muito potente, ele também é capaz de hidrolisar uma variedade de outros pesticidas e V / G tipo nervosas agentes químicos 16. Para facilitar a embalagem OMV, um plasmídeo bacteriano foi concebido que codifica uma construção de genes que contém um promotor indutível, uma sequência de localização periplasmático, e um local de clonagem múltipla curto a montante da sequência do gene CS. Inserção do gene da TEP entre o líder e a sequência de SC permitido para a criação de um interruptor genético que tem como alvo a proteína de fusão PTE-SC para o espaço periplásmico de embalagem OMV. Enquanto os esforços descritos aqui concentrar em PTE, o gene da enzima é intermutável e pode ser facilmente substituída por outra sequência de gene com o FACilitate embalagem de uma enzima ou proteína alternativa. À medida que a segunda parte da ligação sintética, uma proteína da membrana externa abundante (OmpA) é escolhido para apresentar a sequência do péptido ST. Embora a escolha de proteína de ancoragem pode variar, é essencial que a proteína tem um domínio permissiva, que apresenta no interior do espaço periplasmático, tolera a construção de fusão sem induzir citotoxicidade, é conhecido por estar presente em OMV, e não se agregar quando é recombinantemente produzido. OmpA kDa é uma proteína transmembranar de porina 37.2 que é conhecida por ser altamente expresso na membrana externa bacteriana e subsequente OMV 17. Ele está implicado no transporte de moléculas pequenas, &lt;2 nm de tamanho, através da membrana bacteriana 18. Nativo OmpA tem dois domínios estruturalmente únicos, um motivo barril beta transmembranar e uma porção C-terminal solúvel periplasmically conhecido para interagir com o peptidoglicano 19. No designe mutante fusão OmpA-STd aqui a porção C-terminal de OmpA foi eliminado e o ST foi fundido com o N- periplasmically virado ou C-terminais. Excluindo a parte periplasmático de OmpA diminui o número de interacções entre a membrana exterior eo peptidoglycan resultando na desestabilização da membrana levando a hiper-vesiculation 7. OmpA genómico foi mantida para além da construção de OmpA-ST expressa de forma recombinante para mitigar a desestabilização da membrana bruta.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Sempre prepare fresco ou alíquota e congele.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Adicione imediatamente antes do uso após o meio esfriar o suficiente por ser autoclavado.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Cloranfenicol&nbsp;</td><td>Qualquer</td><td></td><td>adição imediatamente antes do uso após a mídia esfriar o suficiente por ser autoclavada.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Meios de cultura TB/LB</td><td>Quaisquer</td><td></td><td>outros meios de crescimento provavelmente funcionarão de forma semelhante.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Qualquer</td><td></td><td>um dos muitos potenciais surfactantes adequados.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de cultura perplexos</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Os defletores promovem níveis mais altos de aeração.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>CHES Fisher Biorreagents</td><td>BP318-100</td><td>Tampão ideal usado para degradação de paraoxon (pH > 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Substância muito tóxica a ser manuseada com cuidado e descartada adequadamente.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro de Seringa 0.45 &micro; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>O diâmetro do filtro dependerá do volume da amostra. A membrana de baixa ligação a proteínas é crítica.</td></tr><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>A temperatura e a mistura precisas são essenciais para o crescimento bacteriano reprodutível.&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga de cultura Sorvall</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Centrífuga de cultura de grande volume (500 ml) capaz de 7.000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Sorvall&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capaz de forças centrífugas &ge; 150.000 x g.</td></tr><tr><td>Rotor Ultracentrífugo</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Certifique-se de que o rotor e os tubos adequados sejam usados e que tudo esteja devidamente equilibrado.</td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga ultra-transparentes (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Certifique-se de que não haja fraturas por estresse antes do uso e que os tubos estejam bem equilibrados.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Necessário para ensaios cinéticos enzimáticos.</td></tr><tr><td>DLS/rastreamento de partículas</td><td>NanoSight&nbsp;</td><td>LM10</td><td>Necessário para a distribuição do tamanho do OMV e determinação da concentração.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Cepa de expressão bacteriana adequada.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Outros plasmídeos podem ser usados no lugar desses.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Outros plasmídeos podem ser usados no lugar destes.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Kit de exemplo.</td></tr></tbody></table>

dirigido embalagem proteína da membrana externa no interior de vesículas<em&gt; escherichia coli</em&gt;: concepção, produção e purificação

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Um crescente interesse na aplicação de técnicas de biologia sintética para programar vesículas de membrana externa (OMV) estão levando a algumas aplicações muito interessantes e originais para OMV, onde nanopartículas tradicionais estão provando muito difícil de sintetizar. Até à data, todas as bactérias Gram-negativas têm sido mostrados para produzir embalagens OMV demonstrando um de uma variedade de carga que inclui pequenas moléculas, péptidos, proteínas e material genético. Com base na sua carga diversa, OMV estão implicadas em muitos processos biológicos que vão desde a comunicação célula-célula para a transferência de genes e entrega de factores de virulência, dependendo de quais as bactérias são a produção de OMV. Só recentemente é que OMV bacteriana se tornar acessível para uso em uma ampla gama de aplicações através do desenvolvimento de técnicas para controlar e embalagem direta de proteínas recombinantes em OMV. Este protocolo descreve um método para a produção, purificação, e da utilização de enzima embalados OMV para proporcionar melhorada Overaprodução ll da enzima recombinante, o aumento da vesiculação e estabilidade da enzima melhorada. a utilização bem sucedida deste protocolo irá resultar na criação de uma estirpe bacteriana que produz simultaneamente uma proteína recombinante e dirige-o para o encapsulamento OMV através da criação de uma ligação sintética entre a proteína recombinante e uma proteína de âncora de membrana externa. Este protocolo também detalha métodos para isolar OMV a partir de culturas de bactérias, bem como técnicas de manejo adequadas e coisas a considerar quando se adaptando este protocolo a ser utilizado para outras aplicações únicas, tais como: entrega farmacêutica de medicamentos, diagnósticos médicos, e remediação ambiental.

A expressão simultânea de duas proteínas recombinantes, como é necessário para a estratégia de embalagem OMV detalhado neste protocolo, podem ser realizadas através de um número de diferentes caminhos. Aqui, um sistema de dois vectores foi utilizado com origens de replicação compatíveis e cassetes de genes indutíveis separadas. Para a expressão do PTE-SC construir uma estrutura do plasmídeo comercial (pACY184) foi manipulado para incluir uma cassete de gene indutível arabinose e um duplo...

Um protocolo para a produção, purificação e uso de vesículas de membrana externa (OMV) empacotadas com enzimas, proporcionando maior estabilidade enzimática para implementação em diversas aplicações, é apresentado.

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

O objetivo geral deste procedimento é purificar e caracterizar vesículas da membrana externa bacteriana preenchidas com enzimas, para utilização como reagentes catalíticos in vitro. Essa técnica de isolamento enzimático permite que as VMEs bacterianas sejam obtidas a partir do meio de cultura e posteriormente empregadas para realizar catalise livre de células de um composto organofosforado. O empacotamento direcionado dentro das VMEs bacterianas melhora significativamente a estabilidade da enzima ao longo de diversas condições de reação e armazenamento, diferentemente das técnicas tradicionais, que frequentemente resultam em perda gradual e contínua da atividade enzimática.As implicações desta técnica estendem-se à embalagem de proteínas com relevância em múltiplas áreas, como o desenvolvimento de terapêuticas, remediação ou o desenvolvimento de sistemas catalíticos livres de células. Embora este protocolo detalhe a purificação de VMOs a partir de E. coli, as técnicas, com modificações na estratégia de embalagem, poderiam ser facilmente utilizadas para a purificação de VMOs a partir de diversas culturas celulares microbianas. Após gerar vesículas da membrana externa ou VMOs em bactérias de acordo com o protocolo descrito, centrifugue o meio de cultura bacteriana intacto a 7.000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos.Remova e guarde o sobrenatante, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. Em seguida, submeta o sobrenatante a uma segunda centrifugação para garantir a remoção completa das bactérias do meio. Para remover agregados proteicos e material celular grande do meio de cultura armazenado, aspire a solução para dentro de uma seringa estéril de 10 a 50 mililitros.Acople um filtro de 0,45 mícron à extremidade da seringa. Em seguida, pressione o êmbolo e colete o filtrado em um novo tubo. Alternativamente, filtre o meio de cultura a vácuo transferindo-o para um aparelho de filtração estéril.Conecte a unidade a uma bomba de vácuo ou aspirador de pia para gerar sucção. Transfira o meio filtrado para um novo recipiente. Para isolar as VMOs, transfira o meio de cultura filtrado para tubos de ultracentrifugação.Centrifugue o meio a aproximadamente 150.000 × g e quatro graus Celsius durante três horas, utilizando um rotor compatível com os tubos empregados. Imediatamente após a ultracentrifugação, para evitar perda da massa do pellet, desprenda o meio de cultura esgotado de OMVs do pellet de OMVs, que apresenta coloração levemente marrom e pode ou não ser visível a olho nu. O pellet de OMVs formado após a ultracentrifugação pode estar apenas fracamente aderido ao recipiente de centrifugação.Deve-se ter cuidado ao decantar para garantir que o precipitado não seja deslocado e perdido. Guarde o sobrenadante para dispersão dinâmica da luz posterior, a fim de verificar se as partículas de OMV foram completamente removidas do meio. Adicione 0,5 a um mililitro de PBS estéril filtrado, pH 7,4, ou outro tampão filtrado conforme determinado pelas necessidades ou condições experimentais, ao precipitado e deixe incubando à temperatura ambiente por 30 minutos.Em seguida, pipete cuidadosamente a solução purificada de OMVs, misturando suavemente para garantir que todo o precipitado tenha sido solubilizado. Para determinar a distribuição de tamanho das OMVs, abra o software de rastreamento de nano-partículas por DLS do instrumento em uso. Ligue o microscópio e limpe todas as superfícies do microscópio e da unidade de rastreamento de nano-partículas.Usando uma seringa estéril de um mililitro, adicione aproximadamente 0,5 mililitros da amostra de OMV diretamente na janela de visualização do dispositivo de rastreamento de partículas através do encaixe inferior, tomando cuidado para cobrir completamente a janela de visualização sem injetar bolhas de ar no sistema. Coloque a unidade de rastreamento de nano-partículas na platina do microscópio e ligue o laser. Em seguida, clique em Capturar no software.Ajuste o foco do microscópio e o estágio para visualizar as partículas na tela de visualização presente na janela do software. Ajuste o obturador da câmera e o ganho da câmera até que as partículas brilhantes sejam claramente visualizadas sobre um fundo escuro. Ajuste a duração da captura para 60 segundos e, em seguida, clique em Gravar.Quando solicitado, insira a temperatura do dispositivo da amostra, rotule a amostra e salve os dados de vídeo ao final de cada execução em uma pasta designada pelo usuário. Mantenha todos os parâmetros de análise no modo de detecção automática e clique em Processar Sequência. Registre a distribuição do tamanho das partículas e a concentração em partículas por mililitro conforme determinado pelo software.Para determinar o teor de proteína nas VMOs, utilize eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE) e Western Blots para avaliar a pureza das VMOs, a produção de enzimas e a eficiência de reticulação entre SpyCatcher ou SC e SpyTag ou ST. É fundamental confirmar a expressão das enzimas-alvo e da proteína âncora. A expressão de proteínas recombinantes frequentemente pode ser mal-sucedida por diversas razões, e a produção bem-sucedida de proteínas deve ser confirmada antes da caracterização das VMOs.Para realizar um ensaio de atividade fosfotriesterase ou PTE, adicione cinco microlitros de uma diluição 1 para 1.000 de paraoxon em tampão CHES a cinco microlitros de OMVs purificadas em 90 microlitros de CHES. Faça leituras de absorbância a 405 nanômetros e 348 nanômetros a cada 20 segundos durante aproximadamente duas horas de tempo total de reação para monitorar o avanço do produto cromogênico da degradação do paraoxon, o p-nitrofenol. Por fim, realize a análise dos dados conforme o protocolo descrito no texto.Mostrados aqui estão exemplos da morfologia de OMVs purificadas de E.coli por MEV. As OMVs variam em tamanho de 50 a 250 nanômetros, conforme determinado pelo uso de instrumentação de rastreamento de partículas. Neste gráfico, é mostrada a concentração absoluta de OMVs.Quando o OMP-A-ST N-terminal foi co-transformado com PTE-SC na presença de arabinose e IPTG, observou-se um aumento significativo na produção de OMVs em comparação com as amostras controle. Os géis de SDS-PAGE e os blots de Western apresentados aqui caracterizam ainda mais o conteúdo proteico das OMVs e a expressão das proteínas recombinantes para OMP-A-ST, OMP-A nativo, PTE-SC e OMP-A-ST-PTE-SC. Nesta figura, os níveis gerais de expressão de PTE e a eficiência de empacotamento em OMVs nos pellets celulares, no sobrenadante da UC e nos pellets purificados de OMVs pela UC foram determinados por meio de medidas de velocidade inicial utilizando o paraoxon como substrato cromogênico.Aqui, o Triton X-100 foi utilizado para verificar a translocação do paraoxon através das bicamadas de OMV intactas. Houve pouca diferença na atividade com ou sem o detergente, indicando que o paraoxon atravessa livremente as porinas endógenas na OMV. Por fim, como observado neste experimento, os dados cinéticos de PTE-SC foram ajustados à equação padrão de cinética enzimática de Michaelis-Menten para a OMP-A-ST com extremidade N co-transformada com PTE-SC na presença de arabinose e IPTG e PTE-SC na presença de ativação por arabinose.Uma vez que todas as construções genéticas tenham sido realizadas e confirmadas, o empacotamento da enzima e a purificação de OMVs podem ser concluídos em um período de dois dias. Um terceiro dia é necessário para confirmar e caracterizar as OMVs sempre que uma nova construção for desenvolvida. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar as classificações de segurança de todos os materiais e do equipamento de centrifugação.Além disso, é importante verificar o sucesso de cada etapa antes de prosseguir para a próxima. As etapas de caracterização descritas aqui podem ser complementadas com outras para confirmar o empacotamento da enzima e a morfologia das OMVs. A concentração de proteína, conteúdo lipídico, concentração de LPS e muitas outras propriedades podem variar conforme diferentes cargas e condições de adução, e podem influenciar aplicações posteriores.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar e caracterizar OMVs preenchidas com enzimas, bem como realizar ensaios preliminares para avaliar a atividade da carga enzimática. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias e reagentes químicos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como técnica asséptica adequada e equipamento de proteção individual, devem ser sempre utilizadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

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