Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia

O objetivo geral deste procedimento é preparar amostras de cristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para coleta de dados de cristalografia seriada em fontes de laser de elétrons síncrotron e livres de raios-x. Este método deve ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia estrutural de proteínas de membrana, como transporte e transdução única através da membrana. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a determinação da estrutura de proteínas de membrana em seu ambiente lipídico nativo à temperatura ambiente com consumo mínimo de amostra e um dano insignificante por radiação.

Indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a fase cúbica lipídica é um material viscoso semelhante a um gel que é difícil de manusear sem ferramentas especiais e experiência anterior. Inicie este procedimento com a reconstituição das proteínas de membrana na Fase Cúbica Lipídica, ou LCP, usando as seringas número um e número dois, conforme descrito no protocolo de texto. Depois que um LCP transparente e homogêneo for formado, mova toda a amostra para a seringa número dois.

Desconecte a seringa número um enquanto mantém o acoplador conectado à seringa número dois. Conecte uma agulha removível a outra seringa limpa de 100 microlitros, chamada Seringa Número Três. Aspire aproximadamente 70 microlitros da solução precipitante nele.

Desconecte a agulha da seringa número três, mantendo a esférula de teflon dentro da seringa. Conecte as seringas número dois e número três através do acoplador, certificando-se de que as esférulas de teflon estejam corretamente encaixadas em ambas as seringas. Aparafuse cuidadosamente o acoplador firmemente na posição.

Oriente as seringas acopladas verticalmente, com a Seringa Número Dois na parte inferior, e injete a amostra LCP carregada de proteínas da Seringa Número Dois na Seringa Número Três lenta e constantemente, até que a corda LCP toque o êmbolo da Seringa Número Três. O volume LCP injetado equivalerá a cerca de 1/10 do volume inicial do precipitante na seringa número três. Verifique o volume pela leitura da escala em ambas as seringas.

Em seguida, desconecte a seringa número dois. O acoplador agora está conectado apenas à Seringa Número Três, que contém a amostra imersa na solução precipitante. Use o Parafilm para vedar completamente a seringa número três, incluindo a interface êmbolo-seringa, a extremidade de abertura do acoplador e a porca da agulha.

A vedação incompleta durante esta etapa pode fazer com que as condições do precipitante mudem e a amostra desidrate. Repita a injeção das etapas da amostra LCP carregada de proteínas para configurar a cristalização em seis seringas adicionais, utilizando um total de aproximadamente 50 microlitros da amostra LCP. Armazene as seringas seladas em um saco plástico lacrado com um ou dois lenços de limpeza sem fibras pré-embebidos em água para proteger contra a desidratação da amostra.

Feche o saco e guarde as seringas em uma incubadora de 20 graus Celsius durante o crescimento do cristal. Para detecção de cristais, remova as seringas da incubadora para emitir as amostras LCP diretamente dentro das seringas a cada 12 a 24 horas sob um microscópio estéreo com luz polarizada cruzada. Identifique os cristais como partículas brilhantes compactas ou, no caso de tamanho de cristal menor, como um brilho uniforme do filamento LCP.

Retorne as seringas lacradas para o saco e guarde a 20 graus Celsius para uso futuro. A etapa de titulação lipídica é necessária para absorver o excesso de solução precipitante e evitar o congelamento lipídico após a injeção no feixe de laser de elétrons livre de raios-x. Cerca de uma hora antes do início da coleta de dados, remova as seringas com as amostras da incubadora de 20 graus Celsius.

Selecione de duas a quatro seringas para consolidação da amostra com base em uma aparência de cristal semelhante e semelhança de condições de cristalização. Remova cuidadosamente o selo Parafilm das seringas selecionadas. Remova o acoplador da seringa e coloque a agulha removível limpa na primeira seringa selecionada.

Empurre suave e lentamente o êmbolo para frente para espremer o precipitante através da agulha em um tubo de microcentrífuga. Tenha cuidado nesta etapa; porque a aplicação de alta pressão no êmbolo pode ejetar parte do LCP carregado de cristal junto com a solução precipitante, levando a uma perda parcial ou total da amostra. Pare o êmbolo quando a maior parte do precipitante tiver sido removida e o LCP tiver se acumulado na entrada da agulha.

Execute este processo para as outras seringas selecionadas. Para consolidar as amostras LCP resultantes, conecte duas seringas por meio de um acoplador limpo. Pressione o êmbolo de uma seringa para transferir toda a amostra de uma seringa para outra.

Desconecte a seringa vazia. Repita esta etapa para consolidar todo o material LCP carregado de cristais em uma seringa. Remova o máximo de precipitante possível.

Adicione aproximadamente cinco microlitros de 7,9 MAG ou o lipídio hospedeiro MAG de cadeia curta original a uma seringa vazia. Ligue esta seringa à seringa com a amostra consolidada através de um acoplador de seringa e misture pressionando alternadamente os êmbolos da seringa. Repita o processo até que toda a solução residual tenha sido absorvida e um LCP homogêneo e transparente seja formado.

Mova toda a amostra de LCP misturada para uma seringa e desconecte a seringa vazia. Encaixe uma agulha de carregamento do injetor LCP na seringa com a amostra consolidada. Ejete cuidadosamente aproximadamente um microlitro da amostra LCP em uma lâmina de vidro e cubra-a com uma lamínula de vidro.

Pressione suavemente a lamínula para colocar a amostra em sanduíche. Tire imagens da amostra LCP sob um microscópio estéreo com a maior ampliação possível, usando uma iluminação de campo brilhante e polarizadores cruzados. Se possível, tire imagens adicionais usando um microscópio de florescência UV e um gerador de imagens para confirmar a existência de microcristais de proteína na amostra.

Estime o tamanho e a densidade do cristal. A densidade de cristal ideal para um experimento de coleta de dados dependerá do tamanho do cristal, do diâmetro do feixe de raios-x e do diâmetro do fluxo LCP, e deve resultar em uma taxa de acerto de cristal de cerca de 10 a 40%Finalmente, carregue o injetor LCP e execute a cristalografia serial de femtossegundo LCP ou a coleta de dados LCP SFX, conforme descrito no protocolo de texto. Aqui são mostrados microcristais do receptor de serotonina em complexo com ergotamina fotografados usando um modo de microscópio de campo claro e fotografados usando um modo de microscópio de luz polarizada cruzada.

A estrutura do complexo ergotamina do receptor de serotonina foi obtida pela abordagem LCP SFX. Aqui são mostrados microcristais do receptor de alisamento em complexo com a ciclopamina que foram fotografados usando um modo de microscópio de polarização cruzada. A estrutura do complexo receptor ciclopamina foi obtida pela abordagem LCP SFX.

Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em menos de duas horas se for executado corretamente. Embora este método possa fornecer informações sobre a estrutura dos alvos de proteínas de membrana, com ligeiras modificações, também pode ser aplicado proteínas. A implicação dessa técnica se estende à descoberta de medicamentos; Porque as estruturas de alta resolução fornecem excelentes modelos das interações padrão da proteína de lignana e ajudam no design de medicamentos mais eficientes.