Name: Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a preparar microcristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para cristalografia serial. Este método permite determinar estruturas em ambiente lipídico nativo, com consumo mínimo de amostra e danos por radiação negligenciáveis.

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Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 GM108635 e U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Semente Award Grant e NSF STC prêmio 1231306. Agradecemos A. Walker para assistência com a preparação do manuscrito.

1. Soluções de filtragem e Lipídeos Nota: Todos os reagentes e instrumentos utilizados neste protocolo deve ser o mais limpo possível para evitar a introdução de contaminantes particulados nas amostras, que podem entupir o injector LCP. <ol><li> Filtrar todas as soluções precipitantes e lípidos fundidos a 5 ^ m filtros spin-down. seringas limpas cuidadosamente e aplicar ar comprimido para secar. Opcionalmente, usar um portátil de sala limpa capuz para evitar armadilhas partículas de pó ou fibras durante os procedimentos de preparação de amostras. </li></ol> 2. Reconstituição da MP no LCP Nota: A escolha do melhor lipídico acolhimento LCP para a cristalização depende do alvo MP, e é geralmente identificado durante anfitrião lipídicas ensaios de rastreio de cristalização 14. Monoacilglicerï¿½s (GAMs) representam a classe mais comum de lipídios utilizados para LCP cristalização 15. Os protocolos são baseados no uso de 9,9 MAG (mono-oleína) como ohospedar lipídico, uma vez que esta é a lipídico de maior sucesso no meso cristalização até à data 16. 9.9 MAG pode ser substituído por outros lípidos hospedeiras LCP ou misturas lipídicas depois de tomar em consideração as diferenças em seu comportamento de fase. Por exemplo, no caso de GPCRs, mono-oleína é normalmente dopado com colesterol para a estabilização do receptor. Aqui, usa 9: 1 (w / w) 9,9 MAG: mistura de colesterol como o lípido hospedeiro. <ol><li> Mistura MP alvo, o qual é purificado em solução detergente micela, com o lípido LCP hospedeiro apropriado utilizando duas seringas (# 1 e # 2) e um acoplador, tal como descrito anteriormente 13. </li><li> Resumidamente, seringa carga # 1 com o lípido fundido e seringa # 2 com a solução de MP. Usar uma proporção entre lípido e solução MP aquosa correspondente ao nível que é imediatamente abaixo da capacidade de hidratação máxima do lípido hospedeiro LCP correspondente, por exemplo, 3: 2 v / v de lípido / solução de MP para 9,9 MAG, 1: 1 v / v solução / MP lipídico para a maioria dos outros MAGs de cadeia mais curta (7,9 MAG, 9,7 MAG, etc). </li><li> Ligue as seringas através de um acoplador de seringa e começar a misturar as substâncias pressionando os êmbolos para mover a mistura e para trás entre as seringas, até que a amostra se torna homogênea e transparente. Prepare aproximadamente 50 mL da amostra LCP para a recolha de um conjunto de dados completo pela LCP-SFX. O volume da amostra final será tipicamente um aumento de aproximadamente um factor de dois (a ~ 100 uL) após a consolidação da amostra e titulação de lípidos (ponto 5). </li></ol> 3. Criação de cristalização em seringas <ol><li> Depois de um LCP transparente e homogênea é formada, mover toda a amostra para a seringa # 2. Retire seringa # 1, enquanto mantém o acoplador ligado à seringa # 2. </li><li> Conectar uma agulha removível (26s calibre) para mais 100 ul de seringa limpa (seringa # 3) e aspirado de aproximadamente 70 ul da solução de agente precipitante para ele. A composição da solução de agente precipitante, que desencadeia formação de microcristais de alta densidade é único para cada alvo MP e deve ser determinada antes de prosseguir para estes protocolos. Aqui, utilizar uma composição de solução precipitante optimizado que produz uma chuva de microcristais do receptor A 2A (40 mM de tiocianato de sódio, 100 mM de citrato de sódio de pH 5, 26-28% PEG400). </li><li> Desligue a agulha da seringa # 3, mantendo a ponteira Teflon dentro da seringa. </li><li> Ligue seringas # 2 e # 3 através do acoplador, certificando-se que virolas de teflon estão correctamente no lugar em ambas as seringas. Cuidadosamente parafuso acoplador firmemente na posição. </li><li> Orient as seringas acopladas verticalmente com seringa # 2 na parte inferior e injectar a amostra LCP proteína-laden da seringa # 2 para a seringa # 3 lenta e progressivamente até que a corda LCP toca o êmbolo da seringa # 3. O volume LCP injectado deverá ascender a cerca de 1/10 do volume inicial precipitante em seringa # 3 (~ 7 mL). Verifique se o volume pela escala de leitura em ambos os SyriNGES (ambos os êmbolos deve mover-se em cerca de 7 mL). </li><li> Desconecte seringa # 2. O acoplador de agora está ligado apenas à seringa # 3 que contém a amostra imersa na solução de agente precipitante. </li><li> Use Parafilm para selar completamente seringa # 3, incluindo a interface do êmbolo da seringa, a fim de o acoplador de abertura e a porca de agulha. selagem incompleta durante esta etapa pode causar as condições precipitantes de mudar e a amostra para desidratar. </li><li> Repita os passos de 3,3-3,7 para configurar a cristalização em 6 seringas adicionais (# 4 # 9) utilizando um total de ~ 50 mL da amostra LCP (~ 7 jul de LCP por cada seringa). </li><li> Loja seringas seladas num saco de plástico selado com um ou dois tecidos de limpeza livres de fibras pré-embebido com água para a protecção contra a desidratação amostra. Selar o saco e armazenar seringas em um C incubadora de 20 ° durante o crescimento de cristal. </li></ol> 4. Detecção de cristal <ol><li> Retirar as seringas da incubadora para a imagem LCamostras P diretamente no interior das seringas (# 3 # 9) a cada 12-24 horas sob um microscópio estereoscópico com luz cross-polarizado. Identificar como cristais brilhantes partículas embaladas apertadamente ou, no caso de menor tamanho do cristal como um brilho uniforme do filamento LCP. </li><li> Devolver as seringas seladas para o saco, e armazenar a 20 ° C para uso futuro. </li></ol> 5. Consolidação da amostra e Titulação com 7,9 MAG Nota: A etapa de titulação lipídico descrita aqui serve a dois propósitos: a) para absorver a solução precipitante excesso e b) para evitar lipídico congelamento após a injecção para o feixe XFEL. Quando uma amostra de LCP composto de 9,9 MAG é injectado numa câmara de vácuo durante a recolha de dados, a evaporação intensiva pode arrefecer a amostra até temperaturas inferiores à temperatura de transição de fase de equilíbrio (~ 18 ° C), conversão de partes da amostra para uma fase cristalina lamelar (Lc). Essas manchas de fase Lc, quando atingido pelo raio, produzir diffr pó intensoanéis de ação que podem danificar um detector sensível 6, como o detector de arranjo de pixels Cornell-SLAC (CSPAD). A titulação de 9,9 amostra MAG com um lípido de cadeia mais curta (9,7 MAG ou 7,9 MAG) alivia este problema, uma vez que tais misturas têm temperaturas de transição de fase inferior. Aqui, descrevemos a titulação de um LCP composta de 9,9 MAG com um MAG 7.9. Quando mais curtos de cadeia MAG (MAG 9.7, 7.9 MAG, etc.) são utilizados para a cristalização ou quando os dados de cristalografia de série são recolhidos à pressão ambiente a titulação no passo 5.11 ainda é necessária, mas pode ser realizada utilizando o lípido LCP hospedeiro original é empregue para cristalização. <ol><li> Cerca de 1 hora antes do início da recolha de dados, remover seringas com amostras de 20 ° C a incubadora. </li><li> Escolha 2-4 seringas para a consolidação da amostra com base em uma aparência de cristal semelhante e semelhança das condições de cristalização. </li><li> Remova cuidadosamente o Parafilm vedação das seringas selecionados. </li><li> Removero acoplador seringa e encaixe uma agulha removível limpo (26s calibre) à primeira seringa selecionado. Devagar e com cuidado empurrar o êmbolo para a frente para espremer o precipitante para fora através da agulha para dentro de um tubo de microcentrífuga. Exercício cuidado neste passo, porque a aplicação de uma alta pressão sobre o êmbolo neste passo pode libertam algum do LCP cristal carregado juntamente com a solução de agente precipitante, conduzindo a uma perda parcial ou completa da amostra. </li><li> Pare o êmbolo, quando a maior parte do precipitante foi removido e o LCP acumulou na entrada da agulha. </li><li> Repita o passo 5,4-5,5 com os outros seringas selecionados. </li><li> Para consolidar as amostras LCP resultantes, conectar duas seringas em conjunto através de um acoplador limpo. </li><li> Empurrar o êmbolo de uma seringa para transferir toda a amostra a partir de uma das seringas para outro. </li><li> Desligue a seringa vazia. </li><li> Repita os passos de 5,7-5,9 para consolidar todo o material de cristal LCP carregado a partir do 2-4 préseringas Escolhidas em uma seringa. Remover o máximo precipitante possível. </li><li> Adicionar 5 uL de ~ 7,9 MAG ou o lípido hospedeiro MAG de cadeia mais curta original para uma seringa vazia. Ligue este seringa para a seringa com a amostra consolidada através de um acoplador de seringa e misturar por alternativamente pressionando êmbolos das seringas. Repetir até que toda a solução residual é absorvida e um LCP homogénea e transparente é formado. A quantidade final de LCP após titulação pode variar de 20 para 35 ul dependendo do volume do excesso de agente precipitante e da sua composição. </li><li> Mover toda a amostra LCP mista em uma seringa e retire a seringa vazia. </li></ol> 6. Caracterização de microcristais <ol><li> Anexar um carregamento de agulha LCP-injector (estilo ponto 3, calibre 22, uma polegada de comprimento) para a seringa com a amostra consolidada. </li><li> Cuidadosamente ejetar ~ 1 ml da amostra LCP numa lâmina de vidro e cubra com uma lamela de vidro. Pressione suavemente sobre atampa de deslizamento de sanduíche da amostra. </li><li> Captar imagens da amostra LCP sob um microscópio estéreo com a maior ampliação possível (tipicamente 100X), utilizando uma iluminação de campo brilhante e cross-polarizadores. Se possível, leve imagens adicionais usando um microscópio UV-fluorescência e um SONICC (segunda ordem não-linear de imagem de cristais quirais) 17 imager para confirmar a existência de microcristais de proteína na amostra. </li><li> Estimar o tamanho do cristal e da densidade 10. A densidade de cristal ideal para um ensaio de recolha de dados irá depender do tamanho do cristal, o diâmetro do feixe de raios-X e o diâmetro do fluxo de LCP, e deve resultar numa taxa de acerto de cristal de cerca de 10-40%. </li></ol> 7. Ajuste de cristal Densidade Nota: Se a densidade de cristal encontrados na Etapa 6.4 é demasiado elevada, o que resulta numa grande percentagem de múltiplas batidas de cristal, os cristais podem ser diluídos, seguindo os passos descritos abaixo para optimizar oamostra para coleta de dados. Se a densidade de cristal é muito baixo para a recolha de dados eficiente em todas as amostras preparadas, em seguida, as condições de crescimento de cristal deve ser re-optimizados, uma vez que não existe um método fiável para a concentração de cristais na MP LCP. <ol><li> Preparar a quantidade necessária de LCP puro para ser utilizado para a diluição imitando a composição LCP (o mesmo lípido e precipitante) da amostra original com cristais que precisa de ser diluída. </li><li> Mova todos LCP puro em uma seringa. Retire seringa vazia, mas deixar o acoplador conectado. </li><li> Remover a agulha da seringa que contém a amostra de LCP com microcristais. Ligar a seringa da amostra para a seringa contendo LCP puro através do acoplador. </li><li> Misturar o conteúdo das seringas, empurrando-o para trás e para a frente através do acoplador até à homogeneidade é alcançada. </li><li> Repita a Seção 6 para re-avaliar a densidade microcrystal na amostra ajustada. </li></ol> 8. LCP Injector Carregando umnd LCP-SFX Coleta de Dados <ol><li> Desligue o acoplador da seringa com a amostra e anexar uma agulha 1 &quot;de carregamento para a seringa. </li><li> Transferir 20-40 ul de amostra no reservatório de um injector de LCP. </li><li> Insira o injector LCP para a câmara de amostra 18, inicie o injector, ajustar a taxa de fluxo e recolher dados LCP-SFX. </li></ol> 9. Incorporação de cristais de proteínas solúveis em LCP Nota: Usando meios altamente viscosos, tais como de LCP, para entrega de cristais de proteínas solúveis permite diminuir drasticamente o consumo de proteína numa experiência de cristalografia de série. Nestas etapas que descrevem como incorporar cristais de proteínas solúveis em LCP. Os cristais podem ser obtidos por qualquer técnica, consolidadas em conjunto sob a forma de uma suspensão de cristais e filtrou-se, se necessário. <ol><li> Ajuste a densidade de cristal em suspensão para garantir taxas de cristal de vida de aproximadamente 10-40%. </li><li> TEst a compatibilidade da solução precipitante com LCP usando 7,9 MAG, 9,7 MAG ou uma mistura 1: 1 de 7,9 e 9,9 MAG MAG como o lípido hospedeiro. </li><li> Misture ~ 25 ul da suspensão de cristais com ~ 25 uL de lípido hospedeiro utilizando um misturador de seringa até se formar um LCP homogéneos. </li><li> Avaliar o tamanho do cristal e densidade conforme descrito na Seção 6. Coloque a amostra no injector LCP e recolher dados, conforme descrito no ponto 8. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Os protocolos descritos aqui fornecem um esboço geral do processo de preparação da amostra para um experimento padrão LCP-SFX com um injector LCP. Com base na nossa experiência, a quantidade total de amostra LCP microcristal carregados final necessário para a recolha de um conjunto de dados completo é tipicamente 50-100 ul (Tabela 1; 25-50 ul de amostra de proteína-LCP em carga inicial), dependendo do tamanho microcristal , a qualidade e densidade. Uma vez que cada 100 ul de seringa de vidro estanque ao gás pode acomodar cerca de 7 ul de LCP sob a forma de uma cadeia estendida completamente para assegurar adequada e até mesmo a difusão da solução de agente precipitante para o LCP, pelo menos, de quatro a sete amostras em seringas devem ser preparados para cada experimento LCP-SFX. Uma vez que a amostra é extrudida através de uma estreita 20-50 uM em diâmetro capilar, é crucial para evitar qualquer material de partículas estranhas na amostra. As poeiras e fibras que poderia ser ocasionalmente introduzidas no LCPamostra ou precipitantes soluções podem entupir o capilar de injector e aumentar o tempo de paragem durante o experimento. Portanto, é importante para filtrar o lípido e todas as soluções através de um filtro de poro de 5 um, antes de preparar amostras. Opcionalmente, uma sala limpa ou um pano limpo capô quarto portátil pode ser usado para preparação de amostras. Estes protocolos baseiam-se na utilização de 9,9 MAG (mono-oleína) como o lípido hospedeiro para MP cristalização. Eles, no entanto, não estão limitados a 9,9 MAG e podem ser facilmente adaptados a quaisquer outros lípidos hospedeiras LCP ou misturas de lípidos depois de ter em conta as diferenças no comportamento da fase lipídica. A maioria das estruturas de MPs cristalizados em LCP foram obtidos usando um dos MAG, com 9,9 MAG sendo o representante mais sucesso até agora 15. A principal desvantagem do uso de 9,9 MAG para SFX é a sua transição para a fase cristalina lamelar após arrefecimento abaixo de 18 ° C, o que muitas vezes ocorre quando a aquisição de dados é executada em vácuo. o titraticom 7,9 MAG descrito na Seção 5 deste protocolo oferece uma boa solução para este problema. Em nossa experiência, os cristais de resistir a tal titulação, sem quaisquer efeitos adversos. Se, no entanto, a adição de 7,9 MAG ou outro MAG de cadeia curta não é desejável, a titulação pode ser realizada com 9,9 MAG. Neste caso, o gás que estabiliza o fluxo de LCP durante a injecção para o vácuo deve ser mudado de hélio para azoto, o qual pode evitar a formação de uma fase lipídica cristalino na maioria das amostras, à custa de ter um fluxo de amostras de menos estável. A consistência de tipo gel de LCP tem uma grande vantagem para o uso como um meio transportador de cristal, uma vez que permite o ajuste da taxa de fluxo de cristal em uma ampla gama, adequada para a recolha de dados de cristalografia de série em modernas fontes XFEL e sincrotrão. Combinando a taxa de fluxo de cristal com o pulso XFEL resultados taxa de repetição em drástica redução no consumo de cristal por ordens de magnitude compared a injecção de líquido. LCP é um meio veículo adequado para administração não só de cristais MP cultivadas na mesma, mas também para os cristais de 21 proteínas solúveis. Vários meios de comunicação portador de cristal alternativas viscosos foram recentemente introduzidas 22-24, ampliando o arsenal de ferramentas e reagentes para a realização de experiências de cristalografia de série. Além disso, a cristalografia de série com LCP como um meio de entrega de cristal tem sido demonstrada em fontes de síncrotron convencionais, pelo menos, para o bem-difração cristais 24,25. futuras atualizações de fontes de síncrotron que aumentam a intensidade dos raios-X por ordens de magnitude, bem como melhorias em tecnologias de detector, fará com que a cristalografia de série um método ainda mais acessível e atraente para a determinação da estrutura. LCP-SFX tem demonstrado a sua potência para determinação estrutural MP. Para sistemas biológicos, tais como desafio (GPCR ou complexos macromoleculares) em que Large, cristais de difração de qualidade são difíceis de crescer, LCP-SFX pode proporcionar um atrativo, se não a única, opção viável para resolver uma estrutura de resolução atômica. Com todas as suas vantagens, ou seja, usando LCP como matriz para a cristalização MP e entrega de cristal, baixo consumo de proteínas, a ausência de danos da radiação, sala de coleta de dados de temperatura, possibilidades de estudos resolvido em tempo 26,27 e nenhuma exigência de cristal colheita, LCP- SFX deve desempenhar um papel importante no futuro da biologia estrutural.

A cristalografia de raios-X é a técnica mais bem sucedidos até à data para a resolução de estruturas de resolução atómica de proteínas de membrana (MPs). Cristalização a partir de mesofases lipídicas, também conhecidos como fase cúbica lipídica (LCP), ou em cristalização meso, representa um dos principais desenvolvimentos em cristalografia de MP que permitiu que a determinação da estrutura de alta resolução de metas desafiadoras, tais como receptores acoplados à proteína G (GPCRs ) 1. Os recentes avanços em ferramentas e tecnologias LCP fez esta técnica disponível para uma grande comunidade de biólogos estruturais em todo o mundo 2. No entanto, em muitos casos, os cristais que se formam em MP LCP são demasiado pequenos para ser utilizado mesmo em linhas de luz mais avançada microfocus sincrotrão, onde as amostras sofrem de danos por radiação e deterioração antes de sinal suficiente em alta resolução pode ser obtida 3. Uma nova abordagem para a coleta de dados cristalográficafoi habilitado com o comissionamento do laser de elétrons livres primeiro raio-X (XFEL). O método é baseado no princípio de &quot;difração antes da destruição&quot;, introduzido pela primeira vez, teoricamente, 4 e, em seguida, confirmada experimentalmente em amostras biológicas no Linac Coherent Light Source (LCLS) 3, pioneiro do mundo em XFELs duras. Um XFEL gera impulsos de alto brilho de raios X dentro de poucas dezenas de duração femtosegundo que difractam a partir de um cristal intocada antes dos átomos da proteína pode mover-se em resposta a danos por radiação. Nas experiências iniciais, os microcristais foram continuamente fornecido à intersecção com o feixe XFEL numa corrente aquosa produzida por um injector de líquido 5. Esta configuração experimental é conhecido como cristalografia de femtosegundo série (SFX). A principal desvantagem de usar injetores de líquidos para a SFX é a sua alta taxa de fluxo, o que, consequentemente, requer dezenas a centenas de miligramas de proteína purificada para a recolha de um conjunto de dados completo. por employing um injetor especial que pode lidar com as amostras LCP gel-like (LCP microextrusion injector) 6, entregamos com sucesso microcristais de vários GPCRs humanos diferentes cultivadas em uma matriz de LCP e obteve as suas estruturas de alta resolução 6-9, com uma proteína significativamente reduzida consumo para menos de 0,3 mg por conjunto de dados. O injector consiste num reservatório que pode conter até 20, 40 ou 100 ul de LCP cristal-carregado e um tubo capilar estreito (10-50 um de diâmetro) através do qual a amostra é extrudida através de aplicação de uma alta pressão (até 10.000 psi) a partir de um êmbolo hidráulico com um nível de pressão amplificado, accionado por um líquido a partir de uma bomba de HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência). O fluxo de LCP que sai do bico capilar é estabilizada por um fluxo paralelo de gás não reactivo (tipicamente hélio ou nitrogénio). Aqui nós fornecemos manifestações visuais das etapas necessárias para preparar e caracterizar amostraspara uma experiência LCP-SFX. Detalhes adicionais podem ser encontrados nos protocolos publicados 10. Como exemplo, iremos utilizar adenosina Um receptor A 2A 11 e preparar cristais desta proteína em LCP para a recolha de dados de raios-X utilizando a abordagem SFX. Enquanto os nossos protocolos são compatíveis com qualquer injector capaz de fazer streaming LCP para coleta de dados por cristalografia de série para fontes XFEL e síncrotron, para fins de ilustração, vamos usar o injetor LCP descrito na Ref. 6. Condições precipitantes otimizados que produzem microcristais de alta densidade em LCP devem ser identificados por high-throughput screening cristalização 12,13 antes de prosseguir com este protocolo. Um fluxograma típico para este protocolo é demonstrado na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>LCP hospedeiro lipídico monooleína (9.9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Hospedando lipídio para a proteína a ser cristalizada</td></tr><tr><td>LCP hospedeiro lipido monooleína (9.9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp;</td><td>Hospedeiro de lipídios para a proteína a ser cristalizada</td></tr><tr><td>Monopalmitoleína lipídica do hospedeiro LCP (9,7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>Lipídio hospedeiro para a proteína a ser cristalizada</td></tr><tr><td>Lipídio hospedeiro LCP 7,9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850534</td><td>Lipídio hospedeiro para tiração para evitar a formação da fase cristalina lamelar (Lc) durante a injeção da amostra</td></tr><tr><td>Solução proteica purificada concentrada a 20-50 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Proteína-alvo</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>Usado para dissolver lipídios</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>Usado para lavar seringas</td></tr><tr><td>Onze 100 &#956; l Seringas à prova de gás Hamilton sem agulhas</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>Para preparação LCP</td></tr><tr><td>Oito acopladores de seringas</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>Para preparação LCP</td></tr><tr><td>Agulha de carregamento LCP-injetor</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 estilo de ponto 3, comprimento 1 polegada</td><td>Para distribuição LCP e carregamento do injetor</td></tr><tr><td>Agulha removível</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>Para remoção de solução precipitante</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Usado para selagem de seringas</td></tr><tr><td>Lenços de limpeza de lentes sem fiapos</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de filtro centrífugo, Ultrafree-MC, 0,5 ml, Durapore 5 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>Usado para filtrar soluções precipitantes e lipídios</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio, 1 polegada x 3 polegadas&nbsp;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Dois frascos de lavagem com pontas finas. Um cheio de milli-Q ou água destilada, o outro com metanol</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>Estes são usados para limpar as seringas, agulhas e acoplador.&nbsp; O metanol é usado primeiro, depois a água.</td></tr><tr><td>Luvas</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>Para secar seringas, agulhas, ferrules e acopladores</td></tr><tr><td>Óculos</td><td></td><td></td><td></td>de segurança</tr><tr><td>Latas de ar pressurizado</td><td>Office Depot (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>Para limpeza de seringas</td></tr><tr><td>Aquecedor de bloco seco com um controlador de temperatura digital</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&nbsp;</td><td>Usado para descongelar lipídios</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>Soluções giratórias</td></tr><tr><td>Mini para sala limpa - Capuz portátil de pressão positiva de 12 polegadas com filtro HEPA</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>Preparação de amostras de limpeza</td></tr><tr><td>Microscópio de zoom estéreo equipado com um polarizador linear e analisador rotativo&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Microscópio UV de verificação da densidade de cristal</td></tr><tr><td></td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>Opcional, para fins de imagem de cristal</td></tr><tr><td>Imager SHG</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>Opcional, para fins de imagem de cristal</td></tr></tbody></table>

preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para serial femtosecond cristalografia

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

proteínas de membrana (MPs) são componentes essenciais das membranas celulares e drogas metas primárias. desenho racional de drogas se baseia em informações estruturais preciso, normalmente obtidos por cristalografia; No entanto MPs são difíceis de cristalizar. Os progressos recentes na determinação estrutural MP tem beneficiado muito com o desenvolvimento de métodos lipídicas fase cúbica (LCP) de cristalização, que normalmente produzem bem-difração, mas muitas vezes pequenos cristais que sofrem com os danos da radiação durante a coleta de dados cristalográfica tradicional para fontes de síncrotron. O desenvolvimento da nova geração de raios-X laser de elétrons livres (XFEL) fontes que produzem pulsos de femtossegundos extremamente brilhantes permitiu sala de coleta de dados de temperatura de microcristais com nenhum ou danos da radiação insignificante. Nossos esforços recentes na combinação da tecnologia LCP com cristalografia de femtosegundo série (LCP-SFX) resultaram em estruturas de alta resolução de vários receptores acoplados à proteína G humanos, which representar um alvo extremamente difícil para a determinação da estrutura. Na técnica de LCP-SFX, LCP é recrutado como matriz para o crescimento e entrega de microcristais MP para a interseção do fluxo de injector com um feixe de XFEL para coleta de dados cristalográfica. Demonstrou-se que LCP-SFX pode melhorar substancialmente a resolução de difracção quando apenas sub-10 uM cristais estão disponíveis, ou quando a utilização de cristais de menor dimensão, à temperatura ambiente pode ultrapassar vários problemas associados com cristais cryocooled maiores, tais como acumulação de defeitos, alta mosaicidade e artefatos cryocooling. avanços futuros em fontes de raios-X e tecnologias detector deve fazer cristalografia de série altamente atraente e viável para a implementação não só na XFELs, mas também em linhas de luz síncrotron mais acessíveis. Aqui nós apresentamos protocolos visuais detalhadas para a preparação, caracterização e entrega de microcristais no LCP para experiências de cristalografia de série.Esses protocolos incluem métodos para a realização de experiências de cristalização em seringas, detectar e caracterizar as amostras de cristal, optimizando a densidade de cristal, o carregamento microcristal LCP carregados para dentro do dispositivo injector e fornecendo a amostra para o feixe de recolha de dados.

Abaixo descrevemos resultados representativos obtidos com amostras preparadas seguindo os protocolos acima, o que nos permitiu recolher dados SFX e resolver estruturas de alta resolução de cinco GPCRs humanos: receptor de serotonina 5-HT 2B em complexo com um ergotamina agonista 8 (PDB ID 4NC3 ), receptor de smoothened (SMO) em complexo com um ciclopamina antagonista 6 (PDB ID 4O9R), receptor de δ-opióide em complexo com um receptor de angiotensina bi-funcional ligando peptídico DIPP-NH2 7 (PDB ID 4RWD), em complexo com um bloqueador de ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), e um complexo entre rodopsina e arrestina 19 (PDB ID 4ZWJ); e dois testes proteínas solúveis: lisozima (PDB ID 4ZIX) e ficocianina (PDB ID 4ZIZ). 5-HT 2B medeia diversas funções fisiológicas centrais e periféricos do neurotransmissor serotonina. este receptorfoi utilizado para estabelecer e validar o método LCP-SFX, por comparação da estrutura de temperatura ambiente obtida pelo LCLS com a estrutura cryocooled resolvido por microcrystallography tradicional no Advanced Photon Source (APS). Um total de ~ amostra LCP 100 ul com microcristais de proteínas (tamanho médio de cerca de 5 mm) foi preparado e usado para a coleta de dados SFX, ea estrutura LCP-SFX de 5HT 2B foi resolvido com sucesso em 2,8 Å (Figura 2) 8. Detalhes adicionais úteis na preparação da amostra e a recolha de dados são fornecidos na Tabela 1. receptor de Smoothened (SMO) é um membro da classe F GPCRs e o alvo molecular da ciclopamina teratogénica, com funções bem demonstrados no desenvolvimento embrionário e crescimento tumoral. Inicialmente, cristais relativamente grandes de SMO / ciclopamina com uma dimensão média de 120 x 10 x 5 mm foram obtidos e, em seguida, utilizado para collecti dadosno a uma fonte de sincrotrão usando cristalografia baseada goniómetro convencional. No entanto, estas grandes cristais produzidos pobre de difracção a uma linha de luz de micro-focagem (10 um de diâmetro) que sofrem de grande mosaicidade (acima de 2-3 graus), provavelmente devido à acumulação de defeitos de crescimento de cristal, ou de efeitos relacionados com a cryocooling. LCP-SFX, no entanto, permitiu-nos a recolher dados sobre a qualidade de difração em LCLS a partir de 5 cristais mm de tamanho à temperatura ambiente. A estrutura foi resolvida por substituição molecular a uma anisotrópica 3.4, 3.2 e 4.0 a resolução ao longo dos três eixos principais, identificar claramente a localização da ciclopamina no bolso de ligação 6 (figura 3). opiatos alcalóides, como a morfina, visando receptor μ-opióide (μ-OR) são amplamente utilizados para controle da dor aguda. No entanto, seu uso extensivo leva a tolerância adquirida e dependência. Co-administração de morfinascom o receptor opióide-δ (δ-OR) antagonistas tem sido demonstrado para evitar os efeitos secundários acima referidos, promovendo, assim, a procura de compostos com uma função-OU δ-antagonista e μ-OU-agonista misto. Foram obtidos os dados de difracção de iniciais em δ-ou num complexo com um bi-funcional de tetra-péptido DIPP-NH2 utilizando cristais cryocooled que difractados a 3,3 A com uma fonte de raios-X sincrotrão empregando estratégia de recolha de dados baseada em goniómetro convencional. Estes dados revelaram uma densidade de electrões parcialmente ambígua para o ligando peptídico. Subsequentemente, os dados de difracção de XFEL à temperatura ambiente foram obtidos e a estrutura foi determinada a 2,7 Å de resolução mostrando uma densidade claro para o ligando e o receptor 7. Esta estrutura oferecida uma oportunidade para mais a função do receptor opióide compreensão e selectividade e fornecida informações valiosas para o desenvolvimento de novos analgésicos. (AT1 R) é um GPCR que serve como um regulador principal da pressão arterial. Nós cristalizado AT 1 R no complexo com um antagonista ZD7155 no LCP. Optimized cristais atingiram um tamanho máximo de 40 x 4 x 4 mm 3 com o melhor de difracção atingindo apenas ~ 4 A a uma fonte de sincrotrão. Ao alterar condições de cristalização, obteve-se uma chuva de cristais menores (10 × 2 × 2 m 3), que foram utilizados para obter a estrutura temperatura ambiente com resolução de 2,9 Å utilizando radiação XFEL. Um total de imagens 2,764,739 detector foram recolhidas para fazer um conjunto de dados completo de cerca de 65 ul de LCP cristal carregadas correspondentes a cerca de 0,29 mg de proteína 9. Do número total de quadros, 457,275 foram identificados como visitas de cristal, que corresponde a uma taxa de sucesso de 17%, dos quais 73,130 quadros (16%) de visitas foram indexados e integrados com sucesso. GPCRs sinalizar através de duas vias principais mediada quer por proteínas G ou arrestinas. A estrutura do receptor adrenérgico β 2 ligado a uma proteína heterotrimérica G s foi resolvido há alguns anos 20, enquanto a estrutura de um GPCR num complexo com arrestina tinha permanecido elusiva. Obtivemos pequenos cristais de uma proteína de fusão rodopsina-arrestina na LCP, que atingiu 25-30 mm na maior dimensão, mas, apesar de otimização extensa, diffracted apenas para ~ 7 Å de resolução para fontes de síncrotron. Usando o método LCP-SFX, dentro de 12 horas de XFEL beamtime, foram coletados 22,262 visitas de cristal, dos quais 18,874 padrões foram indexados e integrado ao anisotrópica limites de resolução de 3,8 Å / 3,8 Å / 3.3 a 19 com sucesso. Rodopsina-arrestina é um complexo de proteína muito desafiador que resistiu a determinação da estrutura usando abordagens tradicionais. A determinação sucesso desta estrutura tem demonstrado o enorme potencial doo método LCP-SFX para resolver problemas difíceis e proporcionou uma oportunidade única para examinar o mecanismo de sinalização de arrestina-tendenciosa em GPCRs. Finalmente, em adição à membrana cristais de proteínas produzidas na fase lipídica, a preparação de amostras e método de entrega foi adaptado com sucesso para cristais de proteínas solúveis, onde LCP é usado como um meio de suporte para a entrega de cristais, o que nos permite diminuir drasticamente o consumo de proteínas necessária para a determinação da estrutura. Estruturas de duas proteínas modelo, lisozima e ficocianina, foram resolvidos em 1,89 Â e 1,75 Á, respectivamente, resolução por este método, usando menos de 0,1 mg de cada proteína de 21. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Serotonina receptor 2B </td><td> receptor smoothened </td><td><strong&gt; Δ-receptor opióide </td><td> Receptor AT1 </td><td> A rodopsina-arrestina </td><td> lisozima </td><td> phycocyanin </td></tr><tr><td> PDB ID </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td> Total da amostra utilizada *, ul </td><td> 100 </td><td> 83 </td><td> 50 </td><td> 65 </td><td> 75 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> A proteína total usado, ug </td><td> 300 </td><td> 500 </td><td> 300 </td><td> 290 </td><td> 340 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> O tamanho médio de cristal, uM </td><td> 5 × 5 × 5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 2 × 2 </td><td> 5-10 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 10 × 5 </td></tr><tr><td> taxa de acerto,% </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> 17 </td><td> 0,45 </td><td> 40 </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td> O tempo total de recolha de dados, hr </td><td> 10 </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> 12 </td><td> 0,75 </td><td> 0,67 </td></tr><tr><td> Número de padrões indexados </td><td> 32819 </td><td> 61964 </td><td> 36.083 </td><td> 73130 </td><td> 18874 </td><td> 54.544 </td><td> 6629 </td></tr><tr><td> grupo espacial </td><td> C 2 1 2 2 </td><td> P 2 1 </td><td> C 2 </td><td> C 2 </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> H 3 2 </td></tr><tr><td> Resolução, uma </td><td> 2.8 </td><td> 3.2 / 3.4 / 4.0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3,3 / 3,8 / 3,8 </td><td> 1,89 </td><td> 1.75 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Resumo da preparação da amostra e coleta de dados estatísticas para estruturas representativas resolvido usando o método LCP-SFX. A quantidade de amostra necessária para uma experiência LCP-SFX depende da qualidade de difracção de cristal, a densidade de cristal, o diâmetro do bico de injector, bem como a taxa de repetição do tamanho do feixe XFEL, intensidade e pulso. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de fluxo de um processo de preparação de amostra típica para a preparação de exemplo LCP-SFX. Começa com LCP cristalização da proteína alvo em seringas de vidro à prova de gás. Depois de cristais são obtidos, o LCP cristal-laden é consolidada em uma seringa e titulada com lipídica adicional, a unidade de absorvânciab a solução precipitante excesso. Os cristais são então caracterizadas usando vários métodos de microscopia antes da coleta de dados XFEL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> Figura 2. Um resultado representativo, a estrutura de 5-HT 2B em complexo com ergotamina. (a) microcristais de 5-HT 2B / ergotamina fotografada usando um modo de microscópio de campo brilhante 8. Este número foi reutilizado a partir de referência 8 com permissão de direitos autorais de Science. (B) microcristais de 5-HT 2B / ergotamina fotografada usando um modo de microscópio cross-polarizado 8. Este número foi reutilizado a partir de referência 8 com direitos de autora permissão da Science. (c) Uma representação dos desenhos animados do 2B estrutura de 5-HT / ergotamina obtido pela abordagem LCP-SFX. Lipídios que foram construídos no modelo são mostrados na representação stick. A ergotamina ligando é mostrado na representação esferas. As linhas contínuas indicam os limites de membrana aproximados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> Figura 3. Um resultado representativo, a estrutura de SMO em complexo com ciclopamina. Painel esquerdo, microcristais de SMO / ciclopamina fotografada utilizando um microscópio de modo transversal polarizada 6. Este número foi reutilizado a partir da referência 6, com permissão de direitos autorais de Nature Communications. O painel direito, uma representati desenhos animadossobre a estrutura de SMO / ciclopamina obtidos pela abordagem LCP-SFX. ciclopamina ligando é mostrado na representação esferas. As linhas contínuas indicam os limites de membrana aproximados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Descrevemos procedimentos para a preparação e entrega de microcristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para cristalografia seriada em lasers de elétrons livres de raios-X e fontes síncrotron. Esses protocolos também podem ser aplicados para incorporação e entrega de microcristais de proteínas solúveis, levando a uma redução substancial do consumo de amostras em comparação com a injeção de líquidos.

Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar amostras de cristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para coleta de dados de cristalografia serial em fontes de sincrotrons e lasers de elétrons livres de raios X. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área da biologia estrutural de proteínas de membrana, como transporte e transdução de sinais através da membrana. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a determinação da estrutura de proteínas de membrana em seu ambiente lipídico nativo, à temperatura ambiente, com consumo mínimo de amostra e dano por radiação desprezível.Indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque a fase cúbica lipídica é um material gelatinoso viscoso, difícil de manipular sem ferramentas especiais e experiência prévia. Inicie este procedimento com a reconstrução de proteínas de membrana na Fase Cúbica Lipídica, ou LCP, utilizando as seringas número um e número dois, conforme descrito no protocolo textual. Após a formação de uma LCP transparente e homogênea, transfira toda a amostra para a Seringa Número Dois.Desconecte a seringa número um mantendo o acoplador conectado à seringa número dois. Conecte uma agulha removível a outra seringa limpa de 100 microlitros, chamada seringa número três. Aspire aproximadamente 70 microlitros da solução precipitante para dentro dela.Desconecte a agulha da seringa número três mantendo a esfera de teflon dentro da seringa. Conecte as seringas número dois e número três por meio do acoplador, certificando-se de que as esferas de teflon estejam corretamente posicionadas em ambas as seringas. Parafuse cuidadosamente o acoplador firmemente até a posição final.Oriente as seringas acopladas verticalmente, com a Seringa Número Dois na parte inferior, e injete lentamente e de forma contínua a amostra de LCP carregada com proteína da Seringa Número Dois na Seringa Número Três, até que o filete de LCP toque o êmbolo da Seringa Número Três. O volume injetado de LCP corresponderá a aproximadamente 1/10 do volume inicial de precipitante na Seringa Número Três. Verifique o volume pela leitura da escala em ambas as seringas.Em seguida, desconecte a Seringa Número Dois. O acoplador agora está conectado apenas à Seringa Número Três, que contém a amostra imersa na solução precipitante. Use Parafilm para selar completamente a Seringa Número Três, incluindo a interface entre o êmbolo e a seringa, a extremidade aberta do acoplador e a porca da agulha.O selamento incompleto durante esta etapa pode alterar as condições do precipitante e causar a desidratação da amostra. Repita os passos da injeção da amostra de LCP contendo a proteína para montar a cristalização em mais seis seringas, utilizando um volume total de aproximadamente 50 microlitros da amostra de LCP. Armazene as seringas seladas em um saco plástico fechável com um ou dois lenços de limpeza livres de fibras previamente embebidos em água, para proteger contra a desidratação da amostra.Feche o saco e armazene as seringas em um incubador a 20 graus Celsius durante o crescimento dos cristais. Para detecção de cristais, remova as seringas do incubador e emita as amostras de LCP diretamente dentro das seringas a cada 12 a 24 horas sob um microscópio estereoscópico com luz polarizada cruzada. Identifique os cristais como partículas brilhantes bem compactadas ou, no caso de cristais menores, como um brilho uniforme do filamento de LCP.Retorne as seringas seladas para o saco e armazene a 20 graus Celsius para uso futuro. A etapa de titulação de lipídios é necessária para absorver a solução precipitante em excesso e para prevenir o congelamento dos lipídios durante a injeção no feixe do laser de elétrons livres sem raios X. Cerca de uma hora antes do início da coleta de dados, remova as seringas com as amostras do incubador a 20 graus Celsius.Selecione duas a quatro seringas para consolidação da amostra com base na aparência semelhante dos cristais e na similaridade das condições de cristalização. Remova cuidadosamente o selo de Parafilm das seringas selecionadas. Remova o acoplador da seringa e fixe uma agulha removível limpa à primeira seringa selecionada.Empurre suave e lentamente o êmbolo para frente para expelir o precipitante através da agulha em um tubo de microcentrifugação. Tenha cautela nesta etapa, pois aplicar alta pressão no êmbolo pode ejetar parte do LCP carregado de cristais junto com a solução de precipitante, levando à perda parcial ou total da amostra. Pare o êmbolo quando a maior parte do precipitante tiver sido removida e o LCP tiver se acumulado na entrada da agulha.Realize este processo para as outras seringas selecionadas. Para consolidar as amostras de LCP resultantes, conecte duas seringas através de um acoplador limpo. Pressione o êmbolo de uma seringa para transferir toda a amostra de uma das seringas para a outra.Desconecte a seringa vazia. Repita este passo para consolidar todo o material LCP carregado de cristais em uma única seringa. Remova o máximo de precipitante possível.Adicione aproximadamente cinco microlitros de 7.9 MAG ou do lípido hospedeiro MAG de cadeia mais curta original a uma seringa vazia. Conecte essa seringa à seringa com a amostra consolidada por meio de um acoplador de seringas e misture alternando a pressão nos êmbolos das seringas. Repita o processo até que toda a solução residual tenha sido absorvida e uma fase cúbica líquida (LCP) homogênea e transparente tenha se formado.Transfira toda a amostra de LCP misturada para uma seringa e desconecte a seringa vazia. Fixe uma agulha de carregamento de injetor de LCP à seringa contendo a amostra consolidada. Cuidadosamente, ejetar cerca de um microlitro da amostra de LCP sobre uma lâmina de vidro e cubra-a com uma lamínula de vidro.Pressione suavemente a lamínula para comprimir a amostra. Capture imagens da amostra de LCP sob um microscópio estereoscópico com a maior ampliação possível, utilizando iluminação em campo claro e polarizadores cruzados. Se possível, obtenha imagens adicionais utilizando um microscópio e um sistema de imagem de fluorescência UV para confirmar a presença de microcristais de proteína na amostra.Estime o tamanho e a densidade dos cristais. A densidade ideal de cristais para um experimento de coleta de dados dependerá do tamanho dos cristais, do diâmetro do feixe de raios X e do diâmetro do fluxo de LCP, e deve resultar em uma taxa de acerto de cristais de cerca de 10 a 40%. Por fim, carregue o injetor de LCP e realize a cristalografia serial de femtosegundo com LCP, ou coleta de dados LCP SFX, conforme descrito no protocolo textual. Aqui são mostrados microcristais do receptor de serotonina em complexo com ergotamina, imagens obtidas usando um modo de microscópio de campo claro e imagens obtidas usando um modo de microscópio com luz polarizada cruzada.A estrutura do complexo entre o receptor da serotonina e a ergotamina foi obtida pelo método LCP SFX. São mostrados aqui microcristais do receptor smoothant em complexo com ciclopamina, que foram imagens usando um modo de microscópio com polarização cruzada. A estrutura do complexo entre o receptor e a ciclopamina foi obtida pelo método LCP SFX.Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em menos de duas horas, se for executado corretamente. Embora este método possa fornecer informações sobre a estrutura de proteínas membranares-alvo, com pequenas modificações, também pode ser aplicado a outras proteínas. A aplicação desta técnica estende-se à descoberta de fármacos; porque estruturas de alta resolução fornecem excelentes modelos para as interações padrão entre proteínas lignanas e auxiliam no desenvolvimento de medicamentos mais eficazes.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui é descrito o procedimento implementado no Grupo Biologia Caffrey Membrana Estrutural e Funcional para configurar manualmente ensaios de cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

Os protocolos descrevem os passos essenciais para a obtenção de cristais de difração de qualidade de uma proteína de membrana a partir de reconstituição da proteína em uma fase lipídica cúbicos (LCP), encontrando condições iniciais com os ensaios pré-cristalização LCP-FRAP, a criação de ensaios de cristalização LCP e cristais colheita .

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

Aqui nós apresentamos um protocolo para a produção controlada de microcristais de proteína. O processo usa um dispositivo automatizado permitindo manipulação controlada de vários parâmetros de cristalização. A cristalização de proteínas é realizada pela adição de automatizado e controlada de soluções de cristalização ao monitoramento e investigar a distribuição de raio de partículas em gota a cristalização.

Crescimento de cristais de proteína com dimensões distintas usando automatizado cristalização juntamente com In Situ Difusão dinâmica da luz

Este protocolo descreve em detalhes como fabricar e operar dispositivos microfluídicos para coleta de dados de difração de raios x em temperatura ambiente. Além disso, descreve como monitorar a cristalização de proteínas por difusão dinâmica da luz e como processar e analisar obtidos dados de difração.

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

O sucesso de um experimento de cristalografia de tempo-resolvido serial femtosecond é dependente da entrega de amostra eficiente. Aqui, descrevemos os protocolos para otimizar a extrusão de Bacteriorrodopsina microcristais de um injector de microextrusão de alta viscosidade. A metodologia baseia-se na homogeneização da amostra com um romance acoplador de três vias e visualização com uma câmera de alta velocidade.

Melhorando a extrusão de alta viscosidade de microcristais de tempo-resolvido Serial Femtosecond cristalografia em Lasers de raio-x

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O objetivo deste artigo é dar ao espectador uma compreensão sólida de como transformar seu protocolo de difusão de vapor de pequeno volume, para o cultivo de grandes cristais de proteína única, em um método de microcristalização em lote de grande volume para cristalografia seriada.

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O protocolo apresentado descreve uma abordagem direta para triagem de condições de cristalização de proteínas e crescimento de cristais usando uma placa de diálise de alto rendimento de 96 poços. O uso de tubos dialisadores para o crescimento em larga escala de microcristais também é demonstrado para aplicações de cristalografia seriada e MicroDE.

Cristalização de proteínas de alto rendimento via microdiálise

Este protocolo descreve um setup para a cristalização do transportador de esterol ABCG5/G8. ABCG5/G8 é reconstituído em bicelas para cristalização em gota suspensa. O protocolo não requer materiais ou substratos especializados, tornando-o acessível e de fácil adaptação em qualquer laboratório para determinação da estrutura da proteína através da cristalografia de raios X.

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Aprenda a preparar microcristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para cristalografia serial. Este método permite determinar estruturas em ambiente lipídico nativo, com consumo mínimo de amostra e danos por radiação negligenciáveis.

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