Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia

O objetivo geral deste procedimento é preparar amostras de cristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para coleta de dados de cristalografia serial em fontes de sincrotrons e lasers de elétrons livres de raios X. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área da biologia estrutural de proteínas de membrana, como transporte e transdução de sinais através da membrana. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a determinação da estrutura de proteínas de membrana em seu ambiente lipídico nativo, à temperatura ambiente, com consumo mínimo de amostra e dano por radiação desprezível.

Indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque a fase cúbica lipídica é um material gelatinoso viscoso, difícil de manipular sem ferramentas especiais e experiência prévia. Inicie este procedimento com a reconstrução de proteínas de membrana na Fase Cúbica Lipídica, ou LCP, utilizando as seringas número um e número dois, conforme descrito no protocolo textual. Após a formação de uma LCP transparente e homogênea, transfira toda a amostra para a Seringa Número Dois.

Desconecte a seringa número um mantendo o acoplador conectado à seringa número dois. Conecte uma agulha removível a outra seringa limpa de 100 microlitros, chamada seringa número três. Aspire aproximadamente 70 microlitros da solução precipitante para dentro dela.

Desconecte a agulha da seringa número três mantendo a esfera de teflon dentro da seringa. Conecte as seringas número dois e número três por meio do acoplador, certificando-se de que as esferas de teflon estejam corretamente posicionadas em ambas as seringas. Parafuse cuidadosamente o acoplador firmemente até a posição final.

Oriente as seringas acopladas verticalmente, com a Seringa Número Dois na parte inferior, e injete lentamente e de forma contínua a amostra de LCP carregada com proteína da Seringa Número Dois na Seringa Número Três, até que o filete de LCP toque o êmbolo da Seringa Número Três. O volume injetado de LCP corresponderá a aproximadamente 1/10 do volume inicial de precipitante na Seringa Número Três. Verifique o volume pela leitura da escala em ambas as seringas.

Em seguida, desconecte a Seringa Número Dois. O acoplador agora está conectado apenas à Seringa Número Três, que contém a amostra imersa na solução precipitante. Use Parafilm para selar completamente a Seringa Número Três, incluindo a interface entre o êmbolo e a seringa, a extremidade aberta do acoplador e a porca da agulha.

O selamento incompleto durante esta etapa pode alterar as condições do precipitante e causar a desidratação da amostra. Repita os passos da injeção da amostra de LCP contendo a proteína para montar a cristalização em mais seis seringas, utilizando um volume total de aproximadamente 50 microlitros da amostra de LCP. Armazene as seringas seladas em um saco plástico fechável com um ou dois lenços de limpeza livres de fibras previamente embebidos em água, para proteger contra a desidratação da amostra.

Feche o saco e armazene as seringas em um incubador a 20 graus Celsius durante o crescimento dos cristais. Para detecção de cristais, remova as seringas do incubador e emita as amostras de LCP diretamente dentro das seringas a cada 12 a 24 horas sob um microscópio estereoscópico com luz polarizada cruzada. Identifique os cristais como partículas brilhantes bem compactadas ou, no caso de cristais menores, como um brilho uniforme do filamento de LCP.

Retorne as seringas seladas para o saco e armazene a 20 graus Celsius para uso futuro. A etapa de titulação de lipídios é necessária para absorver a solução precipitante em excesso e para prevenir o congelamento dos lipídios durante a injeção no feixe do laser de elétrons livres sem raios X. Cerca de uma hora antes do início da coleta de dados, remova as seringas com as amostras do incubador a 20 graus Celsius.

Selecione duas a quatro seringas para consolidação da amostra com base na aparência semelhante dos cristais e na similaridade das condições de cristalização. Remova cuidadosamente o selo de Parafilm das seringas selecionadas. Remova o acoplador da seringa e fixe uma agulha removível limpa à primeira seringa selecionada.

Empurre suave e lentamente o êmbolo para frente para expelir o precipitante através da agulha em um tubo de microcentrifugação. Tenha cautela nesta etapa, pois aplicar alta pressão no êmbolo pode ejetar parte do LCP carregado de cristais junto com a solução de precipitante, levando à perda parcial ou total da amostra. Pare o êmbolo quando a maior parte do precipitante tiver sido removida e o LCP tiver se acumulado na entrada da agulha.

Realize este processo para as outras seringas selecionadas. Para consolidar as amostras de LCP resultantes, conecte duas seringas através de um acoplador limpo. Pressione o êmbolo de uma seringa para transferir toda a amostra de uma das seringas para a outra.

Desconecte a seringa vazia. Repita este passo para consolidar todo o material LCP carregado de cristais em uma única seringa. Remova o máximo de precipitante possível.

Adicione aproximadamente cinco microlitros de 7.9 MAG ou do lípido hospedeiro MAG de cadeia mais curta original a uma seringa vazia. Conecte essa seringa à seringa com a amostra consolidada por meio de um acoplador de seringas e misture alternando a pressão nos êmbolos das seringas. Repita o processo até que toda a solução residual tenha sido absorvida e uma fase cúbica líquida (LCP) homogênea e transparente tenha se formado.

Transfira toda a amostra de LCP misturada para uma seringa e desconecte a seringa vazia. Fixe uma agulha de carregamento de injetor de LCP à seringa contendo a amostra consolidada. Cuidadosamente, ejetar cerca de um microlitro da amostra de LCP sobre uma lâmina de vidro e cubra-a com uma lamínula de vidro.

Pressione suavemente a lamínula para comprimir a amostra. Capture imagens da amostra de LCP sob um microscópio estereoscópico com a maior ampliação possível, utilizando iluminação em campo claro e polarizadores cruzados. Se possível, obtenha imagens adicionais utilizando um microscópio e um sistema de imagem de fluorescência UV para confirmar a presença de microcristais de proteína na amostra.

Estime o tamanho e a densidade dos cristais. A densidade ideal de cristais para um experimento de coleta de dados dependerá do tamanho dos cristais, do diâmetro do feixe de raios X e do diâmetro do fluxo de LCP, e deve resultar em uma taxa de acerto de cristais de cerca de 10 a 40%. Por fim, carregue o injetor de LCP e realize a cristalografia serial de femtosegundo com LCP, ou coleta de dados LCP SFX, conforme descrito no protocolo textual. Aqui são mostrados microcristais do receptor de serotonina em complexo com ergotamina, imagens obtidas usando um modo de microscópio de campo claro e imagens obtidas usando um modo de microscópio com luz polarizada cruzada.

A estrutura do complexo entre o receptor da serotonina e a ergotamina foi obtida pelo método LCP SFX. São mostrados aqui microcristais do receptor smoothant em complexo com ciclopamina, que foram imagens usando um modo de microscópio com polarização cruzada. A estrutura do complexo entre o receptor e a ciclopamina foi obtida pelo método LCP SFX.

Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em menos de duas horas, se for executado corretamente. Embora este método possa fornecer informações sobre a estrutura de proteínas membranares-alvo, com pequenas modificações, também pode ser aplicado a outras proteínas. A aplicação desta técnica estende-se à descoberta de fármacos; porque estruturas de alta resolução fornecem excelentes modelos para as interações padrão entre proteínas lignanas e auxiliam no desenvolvimento de medicamentos mais eficazes.