Name: De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda uma plataforma de criohistologia de alto rendimento para análise de tecidos mineralizados em biologia musculoesquelética. Este método digital e independente de observador permite associar múltiplos sinais moleculares a células específicas de forma eficiente e econômica.

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Os autores gostariam de agradecer as seguintes fontes de financiamento: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 e T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui nós apresentamos um protocolo cryohistology detalhada para co-localizar e quantificar várias medidas biológicas, alinhando imagens de várias rodadas de coloração / imagens em uma única seção. O método descrito utilizando o cryotape é especialmente útil uma vez que mantém a morfologia do tecido difícil de secção (por exemplo, osso mineralizado e cartilagem). Além disso, o tecido seccionados é aderida firmemente para a lâmina de vidro, para permitir que vários ciclos de coloração / imagem da mesma secção; Ao...

Pesquisa biológica, muitas vezes requer fenotipagem eficiente, o que é frequentemente associada com algum tipo de análise histológica 1-3. Esta necessidade é ainda mais evidente com os projectos ambiciosos para interromper cada gene no genoma do rato 4. Estas análises histológicas pode variar de avaliar a morfologia celular e / ou características anatómicas a expressão de mapeamento de genes específicos ou proteínas para células individuais. Na verdade, uma das contribuições fundamentais de histologia para o campo da genômica é a capacidade de associar um sinal molecular específica para uma região ou célula tipo específico. Os métodos tradicionais de histologia, especialmente para tecidos músculo-esqueléticas, são muitas vezes demorado e trabalhoso, exigindo, por vezes semanas para corrigir, descalcificação, seção, mancha e imagem do espécime, em seguida, analisar as imagens através da interpretação humana. Análise de múltiplos sinais moleculares, quer seja através de imuno-histoquímica, em hybridizat situion, ou colorações especiais, requer várias seções e até mesmo várias amostras para realizar de forma adequada. Além disso, estas várias respostas não podem ser co-localizadas à mesma célula e, por vezes, pode não ser co-localizados a uma região específica de uma dada amostra. Como o campo da genómica e epigenomics se move para a era digital, o campo histológico também deve seguir o mesmo caminho para fornecer eficiente e de alta taxa de transferência e análise automatizada de uma variedade de sinais moleculares dentro de um único corte histológico. De fato, há uma demanda para melhoria de técnicas histológicas que podem associar vários sinais moleculares às células específicas dentro de uma dada amostra. Recentemente, publicou um novo método cryohistological de alto rendimento para avaliar várias medidas de resposta dentro de um determinado seção de tecido mineralizado 5-14. O processo envolve a estabilização do criocorte com cryotape congelado, fazendo aderir a secção gravado rigidamente a uma lâmina de microscópio, ea realização de várias rodadas de coloração e de imagem em cada seção. Estes ciclos de imagens são então alinhadas manualmente ou através de automação computador antes de análise de imagem (Figura 1). Aqui, apresentamos protocolos detalhados deste processo e fornecer exemplos onde estas técnicas têm melhorado nossa compreensão dos diferentes processos biológicos.

<table><tbody><tr><td>10% de formalina tamponada neutra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Vários fornecedores disponíveis. Tóxico. Pode ser substituído por paraformaldeído a 4%.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>Diferentes tamanhos podem ser usados dependendo do tecido</td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>Pode ser substitituado com outras criometrias. No entanto, as resinas à base de PVA/PEG funcionaram melhor em nossas mãos.</td></tr><tr><td>2-metil-butano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Disco de amostra</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Lâminas de criostato</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Cryotape</td><td>Section Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Microscopy Sciences</td><td>62800-46</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de plástico</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71890-01</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Adesivo Óptico Norland, 61</td><td>Adesivo Óptico Norland Óptico</td>, <td>61</td><td></td></tr><tr><td>Luz Negra UV</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Microscóferas vermelhas InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas verdes InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp;</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Complexo de alizarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&nbsp;</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Demeclociclina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp;</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>ELF 97 substrato de fosfatase ácida fluorescente amarela</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Vários fornecedores disponíveis. Pode ser substituído por Hoechst 33342 ou outros corantes nucleares.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (contracoloração nuclear Cy5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Acetato de sódio anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>tartarato de sódio dibásico di-hidratado&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Nitrito de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Sal TR Vermelho Rápido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>Vários fornecedores disponíveis. Também pode ser substituído por outros kits de substrato, como Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naftol AS-MX&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>N,N dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Toluidine azul O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>Outros scanners lineares ou lado a lado também podem ser usados.</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>CFP Conjunto de Filtros</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Filtros GFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros YFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros amarelo personalizado (ELF 97)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>costume; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros TRITC</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Conjunto de Filtros</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane Sistema de Transferência</td> de <td>Fita Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>62800-10</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>CryoJane Tape Windows</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>62800-72</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Corrediças Adesivas CryoJane</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>62800-4X</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr></tbody></table>

de alto rendimento, multi-imagem cryohistology de mineralizadas tecidos

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

Há uma necessidade crescente de fenotipagem e histopatologia eficientes de uma variedade de tecidos. Essa necessidade de fenotipagem é evidente com os projetos ambiciosos para interromper todos os genes do genoma do camundongo. A comunidade de pesquisa precisa de meios rápidos e baratos para fenotipar tecidos por meio da histologia. As análises histológicas dos tecidos esqueléticos costumam ser demoradas e, na melhor das hipóteses, semiquantitativas, exigindo regularmente interpretação subjetiva das lâminas de indivíduos treinados. Aqui, apresentamos um paradigma criohistológico para fenotipagem eficiente e barata de tecidos mineralizados. Primeiro, apresentamos um novo método de criossecção estabilizada com fita que preserva a morfologia dos tecidos mineralizados. Essas seções são então aderidas rigidamente a lâminas de vidro e fotografadas repetidamente ao longo de várias rodadas de coloração. As imagens resultantes são então alinhadas manualmente ou por meio de software de computador para produzir pilhas compostas de várias imagens em camadas. O protocolo permite a co-localização de vários sinais moleculares para células específicas dentro de uma determinada seção. Além disso, esses sinais fluorescentes podem ser quantificados objetivamente por meio de software de computador. Este protocolo supera muitas das deficiências associadas à histologia de tecidos mineralizados e pode servir como uma plataforma para a fenotipagem de alto rendimento e alto conteúdo de tecidos musculoesqueléticos no futuro.

Um fluxo de trabalho geral para o Alto Rendimento, Multi-Imagem Cryohistology A Figura 1 representa o fluxo de trabalho geral utilizado para esta técnica. Ele inclui várias etapas de fixação através de várias rodadas de imagem e, finalmente, de alinhamento de imagem / análise. O processo pode demorar tão pouco como uma semana para ir de fixação de amostra através de 4 rodadas de imagem, o que ...

Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma de criohistologia semiautomatizada de alto rendimento para produzir imagens compostas alinhadas de múltiplas medidas de resposta de várias rodadas de imagens fluorescentes em seções congeladas de tecidos mineralizados.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

O objetivo desta tecnologia é fornecer ferramentas histológicas que integrem sistemas modelo complexos de maneira totalmente digital, com alto rendimento, independente do observador, custo-efetiva e significativa para biólogos do sistema músculo-esquelético. A histologia, embora fundamental para a maioria dos pesquisadores biológicos, é frequentemente trabalhosa e não quantitativa. Por isso, há uma necessidade de técnicas histológicas que ofereçam análise eficiente, de alto rendimento e automatizada.Com nossa plataforma de criohistologia, o pesquisador pode associar múltiplos sinais moleculares a células específicas dentro de um determinado espécime por meio da imagens e coloração do mesmo lâmina várias vezes de maneira de alto rendimento. Demonstrarão o procedimento a Doutora Xi Jiang e Li Chen, assistentes de pesquisa em meu laboratório, que foram pioneiras no desenvolvimento e na execução dessas técnicas. Para iniciar este procedimento, remova o espécime da formalina, dissecando qualquer tecido em excesso, e transfira para sacarose a 30%, preparada em PBS 1x.Incube as amostras em sacarose por 12 a 24 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, preencha uma fôrma de criomoldagem com meio de inclusão criogênica e coloque as amostras na fôrma. Então, alinhe as amostras na fôrma de modo que o plano de corte da região de interesse fique paralelo ao fundo da fôrma.Em seguida, coloque o molde de criomoldagem sobre uma peça de gelo seco até que uma fina camada do meio de criomoldagem congele, fixando os espécimes no lugar. Depois, preencha o volume restante do molde de criomoldagem com o meio de criomoldagem, mantendo o molde sobre o pellet de gelo seco. Após isso, coloque o molde de criomoldagem em um recipiente contendo 2-metilbutano pré-resfriado com gelo seco.Uma vez que os espécimes estejam completamente congelados, remova o molde criogênico e agite o excesso de 2-metilbutano. Envolva o molde criogênico em celofane e armazene a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius. Neste procedimento, transfira o bloco de espécime do congelador para um criostato ajustado a menos 20 a menos 25 graus Celsius.Em seguida, retire o bloco do criomolde e corte o meio de crioinclusão em excesso com uma lâmina de barbear. Depois, adicione um pouco de meio de crioinclusão sobre o disco do espécime e alinhe o bloco de forma que a superfície do disco do espécime fique paralela à superfície inferior do bloco. Aguarde a solidificação do meio de crioinclusão.Em seguida, coloque o disco do espécime na cabeça do espécime e ajuste a cabeça de modo que a lâmina corte paralelamente à superfície do bloco de espécime. Em seguida, corte pedaços de fita criogênica para cobrir a região de interesse e pré-resfrie-os no criostato. Depois disso, reduza o bloco até um nível dentro da região de interesse, continuando a fazer ajustes conforme necessário.Uma vez que a região de interesse tenha sido alcançada e um corte possa ser realizado, remova com uma escova as aparas da superfície do bloco. Em seguida, retire o suporte não aderente da criotira segurando a tira pelas abas prateadas douradas não adesivas. Depois, posicione a tira sobre o bloco com o lado adesivo voltado para baixo.Aplicar pressão sobre a fita criogênica utilizando o rolo e fazer um corte usando o motor automático ou a roda de corte manual do criostato. Em seguida, colocar o corte com o lado do tecido voltado para cima sobre uma lâmina de microscópio de plástico dentro do criostato. Remover a lâmina de plástico do criostato e permitir que o meio de crioinclusão derreta, de modo que o corte adira à superfície da lâmina.Repita o corte para as seções seriadas ou outras regiões de interesse. Após a conclusão, coloque as seções em uma caixa para lâminas e armazene-as a quatro, menos 20 ou menos 80 graus Celsius, dependendo do tempo de armazenamento necessário e das medidas de análise posteriores. Para realizar o método com adesivo curável por UV, primeiramente identifique a lâmina de microscópio.Aplicar uma gota de adesivo óptico ativado por UV em dois lâminas de vidro e usar a borda de uma lâmina para espalhar uma camada fina de adesivo sobre a superfície das lâminas. Em seguida, cortar a aba de prata e ouro e posicionar a seção com a fita voltada para cima sobre a camada de adesivo da primeira lâmina. Aplicar a seção com um movimento de rolagem de uma borda para a outra, a fim de minimizar a formação de bolhas aprisionadas sob a fita.Em seguida, remova a seção colada do primeiro lâmina e coloque-a sobre a camada adesiva do segundo lâmina, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas. Uma vez que o número apropriado de seções para o experimento em questão tenha sido colocado em cada lâmina, remova o excesso de adesivo das áreas circundantes. Em seguida, examine atentamente as seções em busca de bolhas ou fibras sob a fita.Em seguida, coloque as lâminas de microscópio sob a luz negra UV por cinco a dez minutos para promover a reticulação da camada adesiva. Nesta etapa, prepare a solução do marcador de referência dissolvendo 50 microlitros de microesferas verdes e 50 microlitros de microesferas vermelhas em 100 microlitros de água. Armazene a solução no escuro a quatro graus Celsius.Em seguida, mergulhe a ponteira de uma pipeta na solução de microesferas e aplique a solução de microesferas em cada seção, adjacente à região de interesse. A seguir, seque as lâminas à temperatura ambiente e proteja-as da luz cobrindo-as com papel alumínio por 30 minutos, caso esteja processando as lâminas naquele dia. Caso contrário, coloque as lâminas em uma caixa de lâminas a quatro graus Celsius.Após corar os cortes, monte as lamínulas sobre as lâminas utilizando meio de montagem acquiesce. Para realizar a aquisição de imagens, carregue as lâminas nas bandejas do microscópio e insira as bandejas na torre de bandejas do microscópio de digitalização de lâminas. Em seguida, clique na lista de perfis no software do microscópio para carregar um perfil para cada lâmina com o tempo de exposição apropriado para cada fluoróforo.Em seguida, clique no botão Iniciar Varredura de Visualização para obter uma imagem de visualização de cada lâmina. O software atribuirá automaticamente um nome de arquivo lendo os códigos de barras colocados nas etiquetas das lâminas. Alternativamente, um nome de arquivo pode ser atribuído manualmente a cada lâmina.Defina as regiões de interesse acessando o assistente de detecção de tecido, desenhando cada região com a ferramenta de desenho, fazendo os ajustes necessários e salvando-as para rodadas subsequentes de imagem. Após configurar cada lâmina, inicie o processo de digitalização clicando no botão Iniciar Digitalização. Após cada rodada de aquisição de imagem, mergulhe as lâminas em um frasco Coplin contendo PBS 1x até que as lamínulas se soltem das lâminas, antes do próximo passo de coloração.Após a conclusão de todas as rodadas de imageamento, exporte as imagens de cada canal individual como arquivos TIF ou JPG para montagem e análise das imagens. Nesta figura, uma seção do fêmur de um camundongo de três meses foi corada com calceína azul e submetida ao imageamento para detecção do mineral acumulado, visto em branco, e das marcações de mineralização, vistas em verde e vermelho na primeira rodada de imageamento. Em seguida, as lâminas foram submetidas ao imageamento para atividade de TRAP, vista em amarelo na segunda rodada, e atividade de fosfatase alcalina, vista em vermelho na terceira rodada de imageamento.Por fim, as lâminas foram coradas com azul de toluidina na quarta rodada. Os marcadores de referência foram imagiados durante cada rodada de aquisição de imagens, incluindo a rodada cromogênica, e foram alinhados utilizando o software personalizado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um tempo menor do que o necessário para descalcificar um espécime típico.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir imagens de alto conteúdo e alta qualidade de tecidos mineralizados, o que esperamos que possa ser mais amplamente utilizado pela comunidade musculoesquelética.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

É apresentada uma estratégia para analisar quantitativamente os dados histológicos na medula óssea. A microscopia confocal de células marcadas com fluorescência em seções de tecido resulta em imagens bidimensionais, que são analisadas automaticamente. As análises de co-localização de diferentes tipos de células são comparadas com dados de imagens simuladas, fornecendo informações quantitativas sobre as interações celulares.

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Este trabalho apresenta um novo protocolo de processamento e imagem para análises de seção transversal de tecido grosso e tridimensional que permitem a exploração completa das modalidades de imagem confocal. Este protocolo preserva a antigenicidade e representa um sistema robusto para analisar histologia da pele e potencialmente outros tipos de tecido.

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.

Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

Este método descreve o uso do modelo do rato do R26-confetti (confetti) para estudar tecidos mineralizado, cobrindo todas as etapas da estratégia de melhoramento à aquisição da imagem. Incluído é um protocolo geral que pode ser aplicado a todos os tecidos moles e um protocolo modificado que pode ser aplicado a tecidos mineralizados.

Rastreamento genético clonal usando o mouse confetti para estudar tecidos mineralizados

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos que abrangem as escalas microscópica e macroscópica.

Pipeline para estudo anatômico tridimensional em várias escalas do coração humano

A combinação de multiplexidade iterativa de branqueamento (IBEX) e um ensaio comercial de marcação de nucleotídeos (Click-iT EdU) permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos em seções fixas de tecido murino congelado. Além disso, um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto fornece aquisição e análise de imagens de alto rendimento.

Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Esse protocolo inclui um fluxo de trabalho passo a passo para amostras vasculares calcificadas: manuseio de tecidos, descalcificação, validação de RNA, detecção de níveis de calcificação e estratégias de seleção por região de interesse no Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). O objetivo é apresentar um método abrangente para preservar a morfologia do tecido vascular e o RNA para análise transcriptômica espacial confiável.

Preparação e Processamento de Artérias Calcificadas com Morfologia e RNA Preservados para Perfil Espacial Digital

Esse protocolo padroniza a criotomografia eletrônica (crio-ET) para tecidos espessos, integrando congelamento de alta pressão (HPF) com o método waffle, levantamento por feixe de íons de foco criogênico (crio-FIB) e aquisição paralela e dose-simétrica, resultando em lamelas uniformemente finas e amostras vitrificadas para análise in situ reprodutível no hipocampo do camundongo.

Fluxo de trabalho de criotomografia eletrônica para tecidos espessos demonstrado em hipocampo de camundongos

Aprenda uma plataforma de criohistologia de alto rendimento para análise de tecidos mineralizados em biologia musculoesquelética. Este método digital e independente de observador permite associar múltiplos sinais moleculares a células específicas de forma eficiente e econômica.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

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