Name: De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda uma plataforma de criohistologia de alto rendimento para análise de tecidos mineralizados em biologia musculoesquelética. Este método digital e independente de observador permite associar múltiplos sinais moleculares a células específicas de forma eficiente e econômica.

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Os autores gostariam de agradecer as seguintes fontes de financiamento: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 e T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui nós apresentamos um protocolo cryohistology detalhada para co-localizar e quantificar várias medidas biológicas, alinhando imagens de várias rodadas de coloração / imagens em uma única seção. O método descrito utilizando o cryotape é especialmente útil uma vez que mantém a morfologia do tecido difícil de secção (por exemplo, osso mineralizado e cartilagem). Além disso, o tecido seccionados é aderida firmemente para a lâmina de vidro, para permitir que vários ciclos de coloração / imagem da mesma secção; Ao...

Pesquisa biológica, muitas vezes requer fenotipagem eficiente, o que é frequentemente associada com algum tipo de análise histológica 1-3. Esta necessidade é ainda mais evidente com os projectos ambiciosos para interromper cada gene no genoma do rato 4. Estas análises histológicas pode variar de avaliar a morfologia celular e / ou características anatómicas a expressão de mapeamento de genes específicos ou proteínas para células individuais. Na verdade, uma das contribuições fundamentais de histologia para o campo da genômica é a capacidade de associar um sinal molecular específica para uma região ou célula tipo específico. Os métodos tradicionais de histologia, especialmente para tecidos músculo-esqueléticas, são muitas vezes demorado e trabalhoso, exigindo, por vezes semanas para corrigir, descalcificação, seção, mancha e imagem do espécime, em seguida, analisar as imagens através da interpretação humana. Análise de múltiplos sinais moleculares, quer seja através de imuno-histoquímica, em hybridizat situion, ou colorações especiais, requer várias seções e até mesmo várias amostras para realizar de forma adequada. Além disso, estas várias respostas não podem ser co-localizadas à mesma célula e, por vezes, pode não ser co-localizados a uma região específica de uma dada amostra. Como o campo da genómica e epigenomics se move para a era digital, o campo histológico também deve seguir o mesmo caminho para fornecer eficiente e de alta taxa de transferência e análise automatizada de uma variedade de sinais moleculares dentro de um único corte histológico. De fato, há uma demanda para melhoria de técnicas histológicas que podem associar vários sinais moleculares às células específicas dentro de uma dada amostra. Recentemente, publicou um novo método cryohistological de alto rendimento para avaliar várias medidas de resposta dentro de um determinado seção de tecido mineralizado 5-14. O processo envolve a estabilização do criocorte com cryotape congelado, fazendo aderir a secção gravado rigidamente a uma lâmina de microscópio, ea realização de várias rodadas de coloração e de imagem em cada seção. Estes ciclos de imagens são então alinhadas manualmente ou através de automação computador antes de análise de imagem (Figura 1). Aqui, apresentamos protocolos detalhados deste processo e fornecer exemplos onde estas técnicas têm melhorado nossa compreensão dos diferentes processos biológicos.

<table><tbody><tr><td>10% de formalina tamponada neutra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Vários fornecedores disponíveis. Tóxico. Pode ser substituído por paraformaldeído a 4%.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>Diferentes tamanhos podem ser usados dependendo do tecido</td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>Pode ser substitituado com outras criometrias. No entanto, as resinas à base de PVA/PEG funcionaram melhor em nossas mãos.</td></tr><tr><td>2-metil-butano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Disco de amostra</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Lâminas de criostato</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Cryotape</td><td>Section Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Microscopy Sciences</td><td>62800-46</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de plástico</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71890-01</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>Pode ser substituído por outras marcas/modelos.</td></tr><tr><td>Adesivo Óptico Norland, 61</td><td>Adesivo Óptico Norland Óptico</td>, <td>61</td><td></td></tr><tr><td>Luz Negra UV</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Microscóferas vermelhas InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas verdes InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp;</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Complexo de alizarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&nbsp;</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Demeclociclina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp;</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>ELF 97 substrato de fosfatase ácida fluorescente amarela</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Vários fornecedores disponíveis. Pode ser substituído por Hoechst 33342 ou outros corantes nucleares.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (contracoloração nuclear Cy5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Acetato de sódio anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>tartarato de sódio dibásico di-hidratado&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Nitrito de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Sal TR Vermelho Rápido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>Vários fornecedores disponíveis. Também pode ser substituído por outros kits de substrato, como Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naftol AS-MX&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>N,N dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Toluidine azul O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>Outros scanners lineares ou lado a lado também podem ser usados.</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>CFP Conjunto de Filtros</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Filtros GFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros YFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros amarelo personalizado (ELF 97)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>costume; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros TRITC</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Conjunto de Filtros</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane Sistema de Transferência</td> de <td>Fita Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>62800-10</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>CryoJane Tape Windows</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>62800-72</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Corrediças Adesivas CryoJane</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>62800-4X</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr></tbody></table>

de alto rendimento, multi-imagem cryohistology de mineralizadas tecidos

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

Há uma necessidade crescente de fenotipagem e histopatologia eficientes de uma variedade de tecidos. Essa necessidade de fenotipagem é evidente com os projetos ambiciosos para interromper todos os genes do genoma do camundongo. A comunidade de pesquisa precisa de meios rápidos e baratos para fenotipar tecidos por meio da histologia. As análises histológicas dos tecidos esqueléticos costumam ser demoradas e, na melhor das hipóteses, semiquantitativas, exigindo regularmente interpretação subjetiva das lâminas de indivíduos treinados. Aqui, apresentamos um paradigma criohistológico para fenotipagem eficiente e barata de tecidos mineralizados. Primeiro, apresentamos um novo método de criossecção estabilizada com fita que preserva a morfologia dos tecidos mineralizados. Essas seções são então aderidas rigidamente a lâminas de vidro e fotografadas repetidamente ao longo de várias rodadas de coloração. As imagens resultantes são então alinhadas manualmente ou por meio de software de computador para produzir pilhas compostas de várias imagens em camadas. O protocolo permite a co-localização de vários sinais moleculares para células específicas dentro de uma determinada seção. Além disso, esses sinais fluorescentes podem ser quantificados objetivamente por meio de software de computador. Este protocolo supera muitas das deficiências associadas à histologia de tecidos mineralizados e pode servir como uma plataforma para a fenotipagem de alto rendimento e alto conteúdo de tecidos musculoesqueléticos no futuro.

Um fluxo de trabalho geral para o Alto Rendimento, Multi-Imagem Cryohistology A Figura 1 representa o fluxo de trabalho geral utilizado para esta técnica. Ele inclui várias etapas de fixação através de várias rodadas de imagem e, finalmente, de alinhamento de imagem / análise. O processo pode demorar tão pouco como uma semana para ir de fixação de amostra através de 4 rodadas de imagem, o que ...

Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma de criohistologia semiautomatizada de alto rendimento para produzir imagens compostas alinhadas de múltiplas medidas de resposta de várias rodadas de imagens fluorescentes em seções congeladas de tecidos mineralizados.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

O objetivo desta tecnologia é fornecer ferramentas histológicas que integrem sistemas modelo complexos de maneira totalmente digital, com alto rendimento, independente do observador, custo-efetiva e significativa para biólogos do sistema músculo-esquelético. A histologia, embora fundamental para a maioria dos pesquisadores biológicos, é frequentemente trabalhosa e não quantitativa. Por isso, há uma necessidade de técnicas histológicas que ofereçam análise eficiente, de alto rendimento e automatizada.Com nossa plataforma de criohistologia, o pesquisador pode associar múltiplos sinais moleculares a células específicas dentro de um determinado espécime por meio da imagens e coloração do mesmo lâmina várias vezes de maneira de alto rendimento. Demonstrarão o procedimento a Doutora Xi Jiang e Li Chen, assistentes de pesquisa em meu laboratório, que foram pioneiras no desenvolvimento e na execução dessas técnicas. Para iniciar este procedimento, remova o espécime da formalina, dissecando qualquer tecido em excesso, e transfira para sacarose a 30%, preparada em PBS 1x.Incube as amostras em sacarose por 12 a 24 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, preencha uma fôrma de criomoldagem co

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

É apresentada uma estratégia para analisar quantitativamente os dados histológicos na medula óssea. A microscopia confocal de células marcadas com fluorescência em seções de tecido resulta em imagens bidimensionais, que são analisadas automaticamente. As análises de co-localização de diferentes tipos de células são comparadas com dados de imagens simuladas, fornecendo informações quantitativas sobre as interações celulares.

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Este trabalho apresenta um novo protocolo de processamento e imagem para análises de seção transversal de tecido grosso e tridimensional que permitem a exploração completa das modalidades de imagem confocal. Este protocolo preserva a antigenicidade e representa um sistema robusto para analisar histologia da pele e potencialmente outros tipos de tecido.

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.

Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos que abrangem as escalas microscópica e macroscópica.

Pipeline para estudo anatômico tridimensional em várias escalas do coração humano

A combinação de multiplexidade iterativa de branqueamento (IBEX) e um ensaio comercial de marcação de nucleotídeos (Click-iT EdU) permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos em seções fixas de tecido murino congelado. Além disso, um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto fornece aquisição e análise de imagens de alto rendimento.

Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Esse protocolo inclui um fluxo de trabalho passo a passo para amostras vasculares calcificadas: manuseio de tecidos, descalcificação, validação de RNA, detecção de níveis de calcificação e estratégias de seleção por região de interesse no Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). O objetivo é apresentar um método abrangente para preservar a morfologia do tecido vascular e o RNA para análise transcriptômica espacial confiável.

Preparação e Processamento de Artérias Calcificadas com Morfologia e RNA Preservados para Perfil Espacial Digital

Esse protocolo padroniza a criotomografia eletrônica (crio-ET) para tecidos espessos, integrando congelamento de alta pressão (HPF) com o método waffle, levantamento por feixe de íons de foco criogênico (crio-FIB) e aquisição paralela e dose-simétrica, resultando em lamelas uniformemente finas e amostras vitrificadas para análise in situ reprodutível no hipocampo do camundongo.

Fluxo de trabalho de criotomografia eletrônica para tecidos espessos demonstrado em hipocampo de camundongos

Aprenda uma plataforma de criohistologia de alto rendimento para análise de tecidos mineralizados em biologia musculoesquelética. Este método digital e independente de observador permite associar múltiplos sinais moleculares a células específicas de forma eficiente e econômica.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

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