Name: Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprenda a fabricar hidrogéis termorresponsivos degradáveis em múltiplas escalas usando química de hidrazona. Este método permite criar microgéis, nanogéis e nanofibras para aplicações em engenharia de tecidos e liberação controlada de fármacos.

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Financiamento de ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC), a criar NSERC-IDEM (projeto integrado de matrizes extracelulares) program, 20/20: NSERC oftálmica Biomaterials Research Network e o Ministério da pesquisa em Ontário e Programa de início pesquisador prêmios de inovação é reconhecido.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Materiais inteligentes têm atraído atenção significativa devido ao seu potencial para reversíveis "on-demand" respostas aos sinais externos e/ou ambientais. Temperatura-responsivo materiais têm atraído interesse particular devido ao seu comportamento de temperatura (LCST) solução crítica inferior, resultando na precipitação temperatura-conduzido em temperaturas T &gt; LCST1,2. No contexto de hidrogel de thermoresponsive, esse comportamento de temperatura crítica da solução inferior é manifestado por reversíveis inchaço/de-swelling eventos que resultam em tamanhos de temperatura-sintonizável em massa (maior no T &lt; LCST)3, o tamanho dos poros (maior em T &lt; LCST)4e propriedades interfaciais (mais hidrofílico na T &lt; LCST)5. Essas transições foram aplicadas extensamente na entrega da droga (para drogas externas ou ambientalmente-triggerable versão4,6,7), engenharia e célula de cultura de tecidos (para a aderência de célula thermoreversible / delaminação8,9,10), separações (para porosidades de membrana comutável e permeabilidades ou termicamente recicláveis diagnóstico suporta11,12, 13), processos de microfluidic (para válvulas on-off regulação fluxo14,15) e modificadores reológicos (para viscosidades temperatura ajustável16). O mais comumente investigados thermoresponsive hidrogel baseiam-se em poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)17, embora o trabalho significativo (e crescente) também tem sido conduzido na poli (metacrilato de glicol oligoethylene) (POEGMA)2 ,18 e poly(vinylcaprolactam) (PVCL)19,20. POEGMA tem atraído particular interesse recente, dada sua biocompatibilidade melhorada antecipado21,22e seu comportamento LCST de fácil-para-melodia, no quais as misturas linearmente previsível de monômeros com diferentes números de unidades de repetição de óxido de etileno em suas cadeias laterais podem alterar a LCST de ~ 20 ° C a &gt; 90 ° C2,23. No entanto, cada um destes polímeros é preparado pela polimerização do radical livre e, portanto, contém um backbone de carbono-carbono, limitando significativamente o potencial utilitário e Traduzibilidade próprios de tais polímeros no contexto das aplicações biomédicas em que degradação (ou pelo menos a capacidade de compensação através de filtração renal) normalmente é uma exigência.
Em resposta a esta limitação, temos recentemente relatado extensivamente sobre a aplicação da química hidrazona (i. e., a reação entre maleica e aldeído-acrescida de pré-polímeros) para preparar degradáveis análogos thermoresponsive hidrogel24,25,26,,27,28,29. A reação rápida e reversível entre grupos maleica e aldeído após mistura dos polímeros funcionalizados precursor30 permite ambos gelificação em situ (permitindo injeção superficial destes materiais sem a necessidade de cirurgia implantação ou qualquer tipo de estímulo externo de polimerização como iniciação de irradiação ou produto químico UV) bem como degradação hidrolítica da rede a uma taxa controlada pela química e densidade dos sites de reticulação. Além disso, ao manter o peso molecular dos pre-polímeros usado para preparar o hidrogel abaixo do limite de filtração renal, hidrogel feito usando esta abordagem degrada volta para os polímeros oligoméricas precursor que podem ser apagados do corpo25 de27, ,28. Juntamente com a baixa citotoxicidade e resposta baixo tecido inflamatório induzido por estes materiais25,26,27, esta abordagem oferece um método potencialmente pode ser convertido para o uso de thermoresponsive hidrogel inteligente na medicina, particularmente se bem controlados análogos degradable tal hidrogel em todas as escalas de comprimento (granel, micro e nano) podem ser fabricados.
Neste protocolo, descrevemos os métodos para fazer thermoresponsive sintético pré-polímeros acrescidos com números controlados de maleica e grupos aldeído bem como métodos para aplicar estes polímeros para criar hidrogel com dimensões bem definidas na várias escalas de comprimento. Em particular, este manuscrito descreve quatro abordagens distintas temos desenvolvido para controlar a mistura do reativa maleica e aldeído-acrescida de pré-polímeros e, assim, criar thermoresponsive redes de hidrogel com geometrias bem definidas e morfologias:
Para criar massa degradáveis hidrogel com tamanhos definidos, uma estratégia de modelagem é descrita pelo qual os reativos pré-polímeros são carregados em barris separadas de uma seringa de cano duplo equipado à saída com um misturador de estática e posteriormente coextrudadas em um molde de silicone com o hidrogel desejada forma e dimensões21,27 (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig1.jpg"> Figura 1 : Esquemática da formação de hidrogel granel. Maleica e soluções de polímero acrescida de aldeído (em água ou tampão aquosa) são carregadas em barris separadas de uma seringa de cano duplo e então Co-extrudado através de um misturador estático em um molde cilíndrico de silicone. Rápida em situ gelificação mediante mistura formas um hidrazona hidrogel de quitosana, que é livre de pé (uma vez que o molde é removido) dentro de segundos a minutos, dependendo da concentração e grupo funcional de densidade dos polímeros precursor. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para criar partículas de gel de degradável na escala mícron, um método de microfluídica reativa é descrito na qual precursor soluções de polímero são simultaneamente misturados e emulsionado usando um projeto de microplaqueta microfluidic litografia-modelado suave, permitindo que o formação de gotículas de polímero reativo misto que posteriormente gel em situ a forma gel de micropartículas com tamanhos modelados pela emulsão (Figura 2)31,32.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig2.jpg"> Figura 2 : Esquemática da formação de micropartículas gel através de microfluídica reativa. (A, B) Maleica e soluções de polímero acrescida de aldeído (em água ou tampão aquosa) são alimentadas por bomba de seringa em reservatórios separados conectados a jusante através de uma série de zig-zag de canais projetado para criar um gradiente de pressão, impedindo o refluxo. Os polímeros são, em seguida, misturados, pouco antes de ser cortado pelo óleo de parafina, fluindo de ambos os lados (também impulsionados por uma bomba de seringa) e forçados através de um bocal, resultando na produção de fluxo-foco de aquosa gotas (solução de polímero), em uma fase de óleo de parafina contínua (Veja uma ilustração da área do bocal e o processo de formação da gota (B)). Um adicional duas entradas de óleo de parafina são posicionados após o bico para mais separado as gotas no canal coleção para permitir a gelificação completa antes da remoção de partículas do fluxo laminar, após o qual o microparticulate resultante geles são coletados num copo magneticamente mexido; (C) imagens do processo de geração da gota para o bocal (note que esse polímero maleica é rotulado como azul para ilustrar a mistura)
Para criar partículas de gel de degradável na escala nanométrica, um termicamente controlado por reativa auto-montagem método é descrito em que uma solução de um dos polímeros reativa precursor (o polímero "semente") é aquecida acima de sua LCST para formar um nanoaggregate estável que é quitosana posteriormente pela adição do polímero precursor reativa complementares (o polímero "reticulação"); o nanogel de quitosana hidrazona resultante tem um tamanho modelo diretamente, o nanoaggregate (Figura 3)28.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig3v2.jpg"> Figura 3 : Esquemático da formação nanogel através de orientado termicamente reativa auto-montagem. Solução aquosa contendo o polímero maleica-acrescida de (thermoresponsive) é aquecida acima de sua mais baixa temperatura crítica solução para criar um nanoaggregate de filmes estável. A seguir, um polímero de aldeído-acrescida é adicionado ao crosslink o nanoaggregate através da formação de hidrazona vínculo e assim estabilizar a partícula nanogel em cima de refrigerar abaixo a LCST. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para criar nanofibras degradáveis, uma técnica reativa eletrofiação é descrita no qual uma seringa de cano duplo, equipada com um misturador de estática à saída (como usado para fazer massa hidrogel) é anexada a uma plataforma de padrão eletrofiação (Figura 4 )33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig4.jpg"> Figura 4 : Esquemática da formação de nanofibras hidrogel através de eletrofiação reativa. Uma seringa de cano duplo com um misturador estático (carregado conforme descrito por hidrogel em massa, mas também incluindo uma fração de alto peso molecular poly(ethylene oxide) como eletrofiação ajuda) é montada em uma bomba de seringa, com a agulha na extremidade da seringa conectada para uma fonte de alimentação de alta tensão. Hidrazona reticulação ocorre durante a fibra girando o processo, para que quando o fluxo atinge o coletor (folha de alumínio ou um disco rotativo de alumínio) a morfologia nanofibrous é mantida. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A aplicação de tais métodos para a criação de redes de hidrogel inteligente degradável é demonstrada no presente protocolo usando PNIPAM ou POEGMA como o polímero de interesse; no entanto, as abordagens básicas descritas podem ser traduzidas para qualquer polímero solúvel em água, embora com ajustamentos adequados para viscosidade e (no caso da auto-montagem nanogel método de fabricação) a estabilidade do pré-polímero na formação da semente nanoaggregate.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,2 - éster dimetílico do ácido azobisisobutírico</td><td>Wako Chemicals</td><td>101138</td><td></td></tr><tr><td>Di(etilenoglicol) éter metílico metacrilato (M(EO)2MA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447927</td><td>188,2 g/mol, n=2 unidades de repetição de óxido de etileno</td></tr><tr><td>Oligo (etilenoglicol) éter metílico metacrilato (OEGMA475)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>475 g/mol, n=8-9 unidades de repetição de óxido de etileno</td></tr><tr><td>Ácido acrílico (AA), 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tioglicólico (TGA), 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3758</td><td></td></tr><tr><td>Dioxano, 99%</td><td>Caledon Labs</td><td>360481</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio, grau UHP</td><td>Air</td><td>Liquide Alphagaz1 765A-44</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrazida de ácido adípico (ADH), 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15119</td><td></td></tr><tr><td>N'-etil-N-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC, x%)</td><td>Carbosynth</td><td>FD05800</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl), 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH), 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacetil aldeído dimetil acetal, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>121967</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy-TEMPO, 97%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de metacriloil, 97%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>523216</td><td></td></tr><tr><td>éter de petróleo, 95%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>32047</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnésio, 99,5%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>éter terc-butílico metílico, >99,0%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>443808</td><td></td></tr><tr><td>solução salina</td> <td>tamponada com fosfatoBioShop</td><td>PBS405.1</td><td>1x, pH 7,3-7,5</td></tr><tr><td>N-isopropilacrilamida, 99%</td> <td>J& K Scientific</td><td>258717</td><td>Recristalizado a partir de 60% de hexanos / 40% de tolueno</td></tr><tr><td>Etanol, álcool comercial anidro</td><td></td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Span 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6760</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de parafina pesado</td><td>Caledon Labs</td><td>1326197</td><td></td></tr><tr><td>Pentano, grau reagente</td><td>Caledon Labs</td><td>1/10/7800</td><td></td></tr><tr><td>Poli (óxido de etileno) média Mv 600.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>Suprimentos essenciais para a síntese e fabricação de hidrogel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Heidolph</td><td>G3</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise (corte de peso molecular de 3500 Da)</td><td>Spectrum Labs</td><td>28170-166</td><td>Vol/length= 6.4mL/cm</td></tr><tr><td>Seringa de barril duplo</td><td>Medmix</td><td>L series</td><td>L série, 2,5 mL, relação de volume 1:1</td></tr><tr><td>Misturador estático</td><td>Medmix</td><td>Série L</td><td>Série L, 2,5 mL, relação de volume 1:1, comprimento de 1,5"</td></tr><tr><td>Folha de borracha de silicone, espessura de 1/16"</td><td>McMaster-Carr</td><td>9010K12, 30A Durómetro (Super Macio)</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS Legato 200</td><td>Infuse Only Bomba de Seringa Dupla</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação de alta tensão</td><td>Spellman</td><td>230-20R</td><td>0 a 20 kV</td></tr><tr><td><forte>Fabricação de Chips Microfluídicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolacha de Silício</td><td>Wafer Universitário</td><td>2080</td><td>D = 76,2 mm; 380 &micro; m de espessura; dopado com P; < Orientação de 100></td></tr><tr><td>SU-8 100</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Desenvolvedor</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Spincoater personalizado de 2,5"</td><td>Alinhador de</td> máscara <td>N/A</td><td></td>interno</tr><tr><td></td><td>KARL SUSS</td><td>MJB3 UV400 (com uma lâmpada de 276 W)</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone Masterflex L/S 13</td><td>Cole Parmer</td><td>OF-96400-13</td><td>Curado</td></tr> <tr><td>com peróxidoBase de Elastômero de Silicone Dow Corning Sygard 184</td><td>Adesivo Ellsworth 4019862</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Sygard 184 Agente de Cura de Elastômero de Silicone&nbsp;</td><td>Adesivos Ellsworth</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Limpeza de Plasma de Alta Potência&nbsp;</td><td>Harrick</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Characterization Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mach 1 testador micromecânico</td><td>Biomomentum</td><td>LB007-EN</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar placa de cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>Inserto de cultura de células para placa de 12 poços</td><td>Corning</td><td>08-771-12</td><td>8 &micro; tamanho dos poros m</td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td></td> Microscópio <td></td><td>óptico Olympus BX51</td></tr><tr><td>Estágio de microscópio controlado por temperatura Linkam</td><td>Scientific</td><td>THMS600</td><td></td></tr><tr><td>Cromatógrafo de permeação em gel (GPC)</td><td>Waters</td><td>590 HPLC Pump</td><td>Waters Colunas de styragel (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7,8 mm (ID); partículas de 5 mm), detector de índice de refração Waters 410</td></tr><tr><td>Espalhamento dinâmico de luz (DLS)</td><td>Analisador de</td><td>Tamanho de Partícula</td><td></td>Brookhaven 90Plus</tr><tr><td>Microscopia eletrônica de transmissão (TEM</td><td>)TEMSCAN</td><td>JEOL 1200EX</td><td>Tensão de aceleração 100 kV</td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica de varredura (SEM)</td><td>Tescan</td><td>Vega II LSU</td><td>Tensão de aceleração 10 kV</td></tr><tr><td>Microsquisher</td><td>CellScale Biomaterials Testing</td><td>MS-50M-01</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricando degradáveis hidrogel de thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Enquanto vários materiais inteligentes tem sido explorados para uma variedade de aplicações biomédicas (por exemplo, entrega de drogas, engenharia de tecidos, bioimaging, etc.), seu último uso clínico tem sido dificultado pela falta de biologicamente relevantes degradação observada para materiais mais inteligentes. Isto é particularmente verdadeiro para temperatura-responsivo hidrogel, que é quase uniformemente à base de polímeros que são funcionalmente não-degradáveis (por exemplo, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) ou poli (metacrilato de glicol oligoethylene) (POEGMA) ). Como tal, para traduzir efetivamente o potencial de hidrogel de thermoresponsive para os desafios de entrega de medicamento telecomandado ou metabolismo-regulado, andaimes com interações de material de células ajustáveis, materiais de theranostic com o potencial da pilha para imagens e entrega da droga e outros tais aplicativos, um método é necessário para processar o hidrogel (se não totalmente degradáveis) pelo menos capaz de afastamento renal após o necessário tempo de vida do material. Para o efeito, este protocolo descreve a preparação do hidrogel hydrolytically degradáveis hidrazona-quitosana em várias escalas de comprimento, baseadas na reação entre maleica e aldeído-acrescida de oligómeros PNIPAM ou POEGMA com molecular pesos abaixo do limite de filtração renal. Especificamente, os métodos para fabricar thermoresponsive degradáveis granel hidrogel (usando uma técnica de seringa de cano duplo), partículas de hidrogel (em ambos a microescala através da utilização de uma plataforma de microfluídica, facilitando a mistura simultânea e emulsificação de polímeros o precursor e a nanoescala através do uso de um termicamente orientado auto-montagem e método de cross-linking), e nanofibras de hidrogel (usando uma estratégia reativa eletrofiação) são descritas. Em cada caso, hidrogel com temperatura-responsivo propriedades semelhantes aos obtidos através do convencional radical livre do cross-linking processos pode ser alcançados, mas a rede reticulado hidrazona pode ser degradada ao longo do tempo para re-formar o oligoméricas polímeros de precursor e habilitar autorização. Como tal, esperamos que esses métodos (que pode ser aplicado genericamente para qualquer sintético polímero solúvel em água, não só inteligente materiais) irão permitir mais fácil tradução de materiais sintéticos de inteligentes para aplicações clínicas.

Hidrogel granel extrudadas de uma seringa de cano duplo em um molde de silicone de acordo com as dimensões do molde e tornar-se independente após a remoção do molde; gelificação ocorre tipicamente segundos a minutos seguinte co-extrusão dependendo de precursores de polímero usado. Caracterização típica através de inchaço (medido por gravimetria usando uma inserção de cultura celular para retirar facilmente o hidrogel da solução inchaço), thermoresponsivity (medido usando a mesma técnica mas ciclismo acima da temperatura de incubação e abaixo da temperatura de transição fase), degradação (medido usando a mesma técnica mas por longos períodos de tempo) e tesoura ou módulo de elasticidade à compressão (medido usando amostras de 2 mm de espessura e 7 mm diâmetro moldada) demonstra o pré-definido do hidrogel respostas, dependendo da química do polímero precursor (especificamente, para POEGMA, a proporção de curto de monômeros de cadeia longa OEGMA usados para preparar o hidrogel), a fração molar de grupos funcionais em polímeros o precursor e a concentração desses precursor de polímeros (Figura 5)27.
Microfluídica leva à formação de micropartículas de gel bem definido na escala de tamanho de 25-100 µm, com o tamanho controlável com base nas taxas de fluxo de óleo e/ou o polímero aquosa combinada de fases (figura 6A)31. Microscopia óptica de estágio quente confirma que as micropartículas de gel de mantenham a natureza thermoresponsive de hidrogel a granel, mostrando reversível dependente da temperatura inchaço-deswelling com apenas uma ligeira histerese no ciclo 1 (atribuível a formação de ligação de hidrogênio irreversível entre vizinhos grupos Amida no estado recolhido34) consistente com a observada em massa PNIPAM hidrogel (Figura 6B)32. Além disso, as gel de micropartículas degradam volta aos seus precursores oligoméricas ao longo do tempo, permitindo a liberação renal (Figura 6)32.
Auto-montagem impulsionado pelo nanoaggregation de um polímero PNIPAM maleica-acrescida em uma solução aquecida seguido de reticulação com uma acrescida de aldeído PNIPAM polímero resulta em altamente monodisperso nanogels (polidispersividade &lt; 0.1) sobre o faixa de tamanho de 180-300 nm, dependendo das condições do processo utilizado (Figura 7A)28. Os nanogels manter o comportamento típico de thermoresponsive de nanogels PNIPAM de quitosana convencional de radicais livres, com graus mais baixos de deswelling térmica observada como polímero mais do cross-linking foi adicionado (Figura 7-B). O nanogels pode ser liofilizado e redispersa sem uma mudança no tamanho de partícula (Figura 7C) e degradar ao longo do tempo através de hidrólise para re-formar os polímeros oligoméricas precursor usados para formular o nanogels (Figura 7D).
Eletrofiação reativa cria um nanofibrous estrutura de hidrogel (Figura 8A), com diâmetros de nanofibras da ordem de ~ 300 nm realizável sem partículas visíveis electrosprayed apresentam33. Embeber as nanofibras baseado em POEGMA em água resulta em rápida hidratação (mais ou menos duas ordens de magnitude mais rápidas do que o alcançado com um gel de volume da mesma composição, Figura 8B), mas mantém a morfologia de nanofibrous mais de 8-10 semanas antes de degradação hidrolítica em condições fisiológicas; degradação mais rápida é observada em ambientes catalisada por ácido, como esperado devido ao potencial de degradação de vínculo catalisada por ácido hidrazona (Figura 8C). As estruturas nanofibrous são também mecanicamente robustas em ambos os Estados secos e inchados ao longo de vários ciclos, permitindo fácil manuseio e repetitivas esticando (Figura 8D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig5v2.jpg"> Figura 5 : Propriedades de in situ -coagulação granel hidrogel degradáveis thermoresponsive. (A) POEGMA representante do gel microestruturas de rede e imagens de hidrogel em massa com tempos de gelificação correspondentes em função da incorporação mole % da OEGMA475 em polímeros do precursor; (B-C) Módulo de armazenamento de hidrogel de100 PO por variável concentração de polímero de precursor (B) e a (C) toupeira % grupo funcional incorporação por polímero precursor; (D-F) Propriedades físico-químicas de hidrogel POEGMA em função da incorporação de % OEGMA475 mole: perfil de degradação de módulo de elasticidade (E) (D) armazenamento em 1 M de HCl e a temperatura de transição de fase (F) volume em resposta à temperatura mudam sobre a faixa de 20-60 ° C. Todas as barras de erro representam o desvio padrão de n = 4 medições de replicar. Adaptado de referência27 com permissão da Elsevier. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig6.jpg"> Figura 6 : Propriedades do gel de degradáveis micropartículas de microfluídica reativa. (A) efeito da taxa de fluxo de óleo de parafina em gel (purificado) tamanho de micropartículas na água; (B) Thermoresponsivity de gel purificada de micropartículas na água após um único ciclo térmico acima e abaixo da temperatura de transição de fase de volume; Avaliação Visual (C) (fotos) e vestígios de cromatografia de permeação gel (gráfico) confirmando a degradação de gel de micropartículas de volta aos seus componentes de polímero precursor (aqui, em 1 M HCl para facilitar a degradação acelerada da escala de tempo da imagem); barra de escala = 100 µm. adaptado de referência32. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig7v2.jpg"> Figura 7 : Propriedades de nanogels degradáveis de reativo auto-montagem. (A) distribuições de tamanho de partícula de nanogels preparado com relações de massa diferentes aldeído: maleica polímero de difusão dinâmica da luz (baixo-relevo: micrografia eletrônica de transmissão confirmando a natureza esférica da nanogels); (B) Thermosensitivity de partículas Self montadas em função da proporção em massa entre polímero aldeído: maleica usado para preparar o nanogels (de difusão dinâmica da luz), com barras de erro, que representa o desvio padrão de n = 4 repetições; Confirmação Visual (C) da falta de agregação nanogel tanto pré e pós-liofilização; (D) visual confirmação da degradação catalisada por ácido de nanogels (aqui em 1 M HCl para consistência com outros estudos acima); (E) gel permeação cromatógrafo vestígios de produtos de degradação nanogel, indicando a sua semelhança com o maleica e polímeros de aldeído-acrescida de precursor. Adaptado com permissão de referência28. Copyright 2015, sociedade americana de química. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig7v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54502/54502fig8v2.jpg"> Figura 8 : Propriedades de nanofibras degradáveis de reativa eletrofiação. (A) microscopia eletrônica imagens de nanofibras no seco (à esquerda), do estado metade mergulhado na água (média, fina película) e totalmente embebidas em água durante a noite (bem, de grosso andaime); (B) inchaço de hidrogel de nanofibrous (vermelho) em relação a um hidrogel de granel (azul) da mesma composição, com barras de erro, que representa o desvio padrão de n = 4 repetições; (C) varredura microscopia eletrônica e (inset) imagens visuais rastreando a degradação catalisada por ácido de nanofibras em 1 M HCl; (D) ciclismo resistência à tração de seco (80 ciclos, 20% de alongamento/ciclo) e inchados (325 ciclos, alongamento/ciclo de 10% em PBS de 10 mM) electrospun nanofibrous de hidrogel. Figura modificada de referência33 e reproduzido com permissão da Real Sociedade de química. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54502/54502fig8v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Os protocolos são descritos para a fabricação de hidrogel degradáveis thermoresponsive baseado no hidrazona cross-linking de oligômeros polímeros na escala a granel, microescala e escala nanométrica, último para preparação do gel de nanopartículas e nanofibras.

Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...

O objetivo geral deste protocolo é fabricar versões degradáveis de hidrogéis termorresponsivos com escalas e geometrias de comprimento controladas. Este método pode ajudar a enfrentar os principais desafios no cenário de materiais biomédicos, como facilitar a administração local de medicamentos minimamente invasivos a longo prazo, criar andaimes responsivos para engenharia de tecidos ou projetar nanoterapêuticos direcionados. A principal vantagem de nossa técnica é uma química reversa rápida da biohidrazona, que nos permite controlar o tamanho e a forma dos hidrogéis degradáveis, alterando a geometria de mistura do precursor do polímero.Essa flexibilidade nos permite fabricar géis fólicos, microgéis, nanogéis e nanofibras, todos com o mesmo material de partida. Primeiro, prepare cerca de dois mililitros de soluções de polímero precursor termorresponsivo funcionalizadas com hidrazida e aldeído com concentrações entre cinco e 40% em peso e solução salina tamponada com fosfato 10 milimolar. Use seringas de barril único para carregar as soluções de polímero precursor em barris separados de uma seringa de barril duplo 1:1 de 2,5 mililitros.Em seguida, conecte um misturador estático de 1,5 polegada a uma seringa de barril duplo 1:1 de 2,5 mililitros. Se desejar, conecte uma agulha de calibre 18 ou 20 calibre 1.5 polegada ao misturador estático. Em seguida, corte de uma folha macia de borracha de silicone com a espessura desejada.Uma peça do tamanho de uma lâmina de microscópio padrão. Use um conjunto de punções para fazer pelo menos um furo da forma desejada na folha de borracha de silicone. Coloque o molde de borracha de silicone em uma lâmina de vidro limpa, garantindo que todos os orifícios sejam apoiados pelo vidro.Pressione suavemente o molde contra a corrediça para fixá-lo no lugar. A folha de borracha de silicone também pode ser usada como suporte para garantir uma boa adesão ao substrato. Co extrude as soluções de polímero funcionalizado hidrazida e aldeído através do misturador estático nos poços do molde até que os poços estejam completamente cheios.Cubra o molde com uma segunda lâmina de vidro limpa e espere a gelificação terminar. Em seguida, remova a lâmina superior e use uma espátula para separar os hidrogéis do molde de borracha de silicone. Levante o molde da lâmina para recuperar os hidrogéis.Antes do procedimento, fabricar um chip microfluídico para a geração de micropartículas. Sintetize poli NIPAM funcionalizado com hidrazida e aldeído. Para começar, prepare dois mililitros cada uma de soluções de poli NIPAM funcionalizado com 6% em peso de hidrazida e aldeído em água deionizada.Carregue as soluções precursoras de polímero em seringas separadas de cinco mililitros. Em seguida, prepare 150 mililitros de uma solução a 1% em peso de monooleato de sorbitano em óleo de parafina pesado. Carregar esta solução em duas seringas padrão de 60 mililitros.Monte as quatro seringas em bombas de seringa de perfusão separadas. Em seguida, conecte um tubo de silício de 45 centímetros de comprimento à saída do chip microfluídico. Coloque a extremidade da tubulação de saída em um recipiente de resíduos.Conecte as seringas de solução de polímero aos canais de entrada de polímero no chip microfluídico com 30 centímetros de comprimento de tubo de silício. Conecte uma seringa de solução de óleo de parafina ao canal de entrada de óleo a montante com tubulação de silicone. Conecte a outra seringa de óleo a ambos os canais de entrada de óleo a jusante usando um tubo de silicone e uma junta de seringa em forma de U.Defina as taxas de fluxo das bombas equipadas com seringas de óleo entre 1,1 e 5,5 mililitros por hora. Passe o óleo pelo chip microfluídico por pelo menos 30 minutos para preparar o chip e confirmar que o chip está livre de defeitos. Em seguida, forneça simultaneamente as duas soluções de polímero ao chip preparado a 03 mL por hora.Deixe o fluxo de polímero e óleo se equilibrar por 30 minutos a uma hora. Para evitar a gelificação prematura dos polímeros precursores no bico microfluídico, é essencial preparar cuidadosamente a tubulação e iniciar o fluxo do polímero exatamente ao mesmo tempo para evitar o refluxo em qualquer reservatório de polímero. Uma vez que micropartículas de gel uniformes estejam se formando no bico do chip microfluídico, colete as partículas em um tubo de centrífuga de plástico com uma barra de agitação magnética ativa.Pare as bombas de seringa e o motor de agitação quando o óleo for consumido. Assim que as micropartículas de gel se depositarem no tubo, transvase o óleo de parafina com uma pipeta. Adicione ao frasco 10 mililitros de pentano para cada 5 mL de micropartículas.Misture vigorosamente o emolumento por cerca de um minuto. Deixar as partículas repousar durante uma ou duas horas antes de decantar o pentano com uma pipeta. Repita esta lavagem de pentano pelo menos cinco vezes.Transfira as micropartículas de gel lavadas para um pequeno frasco de cintilação de vidro. Ressuspenda as partículas em um a dois mililitros de água deionizada. Para iniciar este procedimento, prepare cinco mililitros de cada uma das soluções de 1% de hidrazida e poli NIPAM funcionalizado com aldeído em água deionizada.Aqueça cinco mililitros da solução de poli NIPAM funcionalizada com hidrazida a 70 graus Celsius enquanto mexe. Monitore a solução à medida que ela se torna opaca e confirme se nenhum precipitado visível se forma. Em seguida, adicione 0,25 mililitros da solução de poli NIPAM funcionalizada com aldeído gota a gota à solução de poli NIPAM funcionalizada por hidrazida aquecida ao longo de cinco a 10 segundos.Mexa a mistura por 15 minutos a 70 graus Celsius. Em seguida, remova a mistura do banho de óleo e deixe-a esfriar até a temperatura ambiente durante a noite para obter os nanogéis para purificação. Coloque a mistura de nano gel em uma membrana de diálise cortada com peso molecular de 3500 kilodaltons.Dialise os nanogéis contra água dionizada seis vezes em ciclos de seis horas para remover polímeros não reticulados. Se desejar, liofilize os nanogéis purificados para armazenamento. Para iniciar o procedimento de fabricação de nanofibras de gel, prepare um mililitro de cada uma das soluções de 15% em peso de hidrazida e POEGMA funcionalizada com aldeído em água deionizada.Em seguida, prepare dois mililitros de uma solução a 5% em peso de óxido de polietileno de alto peso moleculor em água deionizada. Combinar cada solução precursora de POEGMA com um mililitro da solução de óxido de polietileno. Carregue as soluções precursoras em cilindros separados da seringa de cilindro duplo.Em seguida, conecte um misturador estático de 1,5 polegada e uma agulha de calibre 18 com ponta romba a uma seringa de cano duplo 1:1 de 2,5 mililitros. Monte a seringa de barril duplo em uma bomba de seringa de infusão. Em seguida, monte um coletor eletrogiratório de disco de alumínio a 10 centímetros da extremidade da agulha.Aterre uma fonte de alimentação de alta tensão no coletor e conecte a fonte de alimentação à agulha. Defina a bomba de seringa para 0,48 mililitros por hora e a fonte de alimentação para 10 quilovolts. Inicie simultaneamente a bomba de seringa e a fonte de alimentação para iniciar a eletrocentrifugação.Continue até que a espessura desejada seja alcançada ou os precursores se esgotem. Após o término da produção de nanofibras, desligue e desconecte o conjunto de eletrofiação. Mergulhe as nanofibras de gel coletadas em água deionizada por 24 horas para remover o óxido de polietileno.A entrega de seringa de barril duplo produziu géis de hidra a granel POEGMA reticulados com hidrazona com uma variedade de mecânicas, tempos de gelificação e transparências, dependendo da concentração do polímero precursor, da densidade do grupo funcional reativo e do número de unidades de repetição de óxido de etileno nos monômeros. As taxas de fluxo das soluções de óleo de parafina e precursor de polímero afetaram os tamanhos das micropartículas de gel de poli NIPAM reticuladas por hidrozona fabricadas com o dispositivo microfluídico. Inchaço reversível dependente da temperatura foi observado com microscopia óptica de estágio quente.As micropartículas de gel se degradaram em seus precursores oligoméricos ao longo do tempo. Os tamanhos dos nanogéis de poli NIPAM reticulados por hidrazona automontados variaram com a relação entre massa e precursor de polímero funcionalizado por aldeído para hidrazida, mas permaneceram altamente monodispersos. À medida que a razão de massa aumentou, menos desinchamento térmico foi observado.Como as micropartículas de gel, os nanogéis se degradaram em precursores oligoméricos ao longo do tempo. Nanofibras de hidrogel POEGMA reticuladas com diâmetros da ordem de 300 nanômetros foram produzidas por eletrofiação reativa. A hidratação das nanofibras foi cerca de duas ordens de magnitude mais rápida do que a hidratação de um gel a granel com a mesma composição de polímero.As nanofibras mantiveram sua morfologia nanofibrosa por mais de oito semanas antes de se degradarem em condições fisiológicas. A degradação mais rápida ocorreu em ambientes ácidos. As nanofibras eram mecanicamente robustas nos estados seco e inchado.Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma boa compreensão de como criar hidrogéis degradáveis e termorresponsivos, controlando a geometria na qual os polímeros precursores de gel são feitos. Lembre-se de garantir que o tempo de gelificação do precursor do polímero corresponda às necessidades de cada partícula. A gelificação muito rápida inibirá a fabricação de microgel e nanofibras.A gelificação muito lenta resultará em morfologias totalmente congeladas. Essas técnicas abrem caminho para pesquisadores nas áreas de administração de medicamentos e engenharia de tecidos. e projetar andaimes de hidrogel bem definidos para controlar a taxa ou localização da liberação do medicamento ou estimular a regeneração do tecido.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Apresentamos um protocolo para sintetizar micro-hidrogéis Janus compostos inteiramente do mesmo material base, poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), com uma estrutura claramente compartimentada baseada na separação de fases de uma solução supersaturada de monômero NIPAAm. Os microhidrogéis Janus sintetizados apresentam propriedades únicas, como termorresponsividade anisotrópica e capacidade de carga organofílica/hidrofílica.

Síntese de Poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels para anisotrópica Thermo-resposta e Organophilic / Carregando Capability hidrofílico

Descrevemos a fabricação de folhas de hidrogel micropadronizadas usando um processo simples, que pode ser montado e manipulado de forma independente. Usando essas folhas modulares de hidrogel, um sistema simples de cultura de células 3D em escala macro pode ser gerado com um microambiente celular controlado.

Construção de Fichas de hidrogel modular para micropadronadas Macro-escalado 3D Cellular Arquitetura

Este protocolo descreve a implementação da degradação de hidrogel baseada em laser guiada por imagem para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incorporadas em hidrogéis de poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA). Esses sistemas microfluídicos biomiméticos podem ser úteis para aplicações de engenharia de tecidos, geração de modelos de doenças in vitro e fabricação de dispositivos avançados "on-a-chip".

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

Desenvolveu-se uma estratégia de fabricação de aditivos para processamento de hidrogel UV-ligado. Esta estratégia permite a montagem de camada por camada de estruturas de hidrogel de microfabricated, bem como a montagem de componentes independentes, produzindo dispositivos integrados contendo componentes móveis que são responsivos a atuação magnética.

Um aditivo fabricação técnica para a preparação fácil e rápida de Micromachines baseada em hidrogel com componentes magneticamente responsivos

Este trabalho descreve métodos simples, adaptáveis e de baixo custo para fabricar microgels com fragmentação de extrusão, processar os microgésis em hidrogéis granulares injetáveis e aplicar os hidrogéis granulares como tintas de impressão extrusão para aplicações biomédicas.

Fragmentando hidrogéis a granel e processando em hidrogéis granulares para aplicações biomédicas

Este artigo descreve protocolos para a fabricação de microgel de metacriloíla de gelatina de alto rendimento usando dispositivos microfluídicos, conversão de microgéis em pó ressuspendível (micro-aerogéis), montagem química de microgéis para formar arcabouços de hidrogel granular e desenvolvimento de biotintas de hidrogel granulares com microporosidade preservada para bioimpressão 3D.

Suportes de hidrogel granular de metacriloíla de gelatina: fabricação de microgel de alto rendimento, liofilização, montagem química e bioimpressão 3D

Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.

Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

Aprenda a fabricar hidrogéis termorresponsivos degradáveis em múltiplas escalas usando química de hidrazona. Este método permite criar microgéis, nanogéis e nanofibras para aplicações em engenharia de tecidos e liberação controlada de fármacos.

Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação (Vídeo) | JoVE Journal

Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

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