Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

O objetivo geral deste protocolo é fabricar versões degradáveis de hidrogéis termorresponsivos com escalas e geometrias de comprimento controladas. Este método pode ajudar a enfrentar os principais desafios no cenário de materiais biomédicos, como facilitar a administração local de medicamentos minimamente invasivos a longo prazo, criar andaimes responsivos para engenharia de tecidos ou projetar nanoterapêuticos direcionados. A principal vantagem de nossa técnica é uma química reversa rápida da biohidrazona, que nos permite controlar o tamanho e a forma dos hidrogéis degradáveis, alterando a geometria de mistura do precursor do polímero.

Essa flexibilidade nos permite fabricar géis fólicos, microgéis, nanogéis e nanofibras, todos com o mesmo material de partida. Primeiro, prepare cerca de dois mililitros de soluções de polímero precursor termorresponsivo funcionalizadas com hidrazida e aldeído com concentrações entre cinco e 40% em peso e solução salina tamponada com fosfato 10 milimolar. Use seringas de barril único para carregar as soluções de polímero precursor em barris separados de uma seringa de barril duplo 1:1 de 2,5 mililitros.

Em seguida, conecte um misturador estático de 1,5 polegada a uma seringa de barril duplo 1:1 de 2,5 mililitros. Se desejar, conecte uma agulha de calibre 18 ou 20 calibre 1.5 polegada ao misturador estático. Em seguida, corte de uma folha macia de borracha de silicone com a espessura desejada.

Uma peça do tamanho de uma lâmina de microscópio padrão. Use um conjunto de punções para fazer pelo menos um furo da forma desejada na folha de borracha de silicone. Coloque o molde de borracha de silicone em uma lâmina de vidro limpa, garantindo que todos os orifícios sejam apoiados pelo vidro.

Pressione suavemente o molde contra a corrediça para fixá-lo no lugar. A folha de borracha de silicone também pode ser usada como suporte para garantir uma boa adesão ao substrato. Co extrude as soluções de polímero funcionalizado hidrazida e aldeído através do misturador estático nos poços do molde até que os poços estejam completamente cheios.

Cubra o molde com uma segunda lâmina de vidro limpa e espere a gelificação terminar. Em seguida, remova a lâmina superior e use uma espátula para separar os hidrogéis do molde de borracha de silicone. Levante o molde da lâmina para recuperar os hidrogéis.

Antes do procedimento, fabricar um chip microfluídico para a geração de micropartículas. Sintetize poli NIPAM funcionalizado com hidrazida e aldeído. Para começar, prepare dois mililitros cada uma de soluções de poli NIPAM funcionalizado com 6% em peso de hidrazida e aldeído em água deionizada.

Carregue as soluções precursoras de polímero em seringas separadas de cinco mililitros. Em seguida, prepare 150 mililitros de uma solução a 1% em peso de monooleato de sorbitano em óleo de parafina pesado. Carregar esta solução em duas seringas padrão de 60 mililitros.

Monte as quatro seringas em bombas de seringa de perfusão separadas. Em seguida, conecte um tubo de silício de 45 centímetros de comprimento à saída do chip microfluídico. Coloque a extremidade da tubulação de saída em um recipiente de resíduos.

Conecte as seringas de solução de polímero aos canais de entrada de polímero no chip microfluídico com 30 centímetros de comprimento de tubo de silício. Conecte uma seringa de solução de óleo de parafina ao canal de entrada de óleo a montante com tubulação de silicone. Conecte a outra seringa de óleo a ambos os canais de entrada de óleo a jusante usando um tubo de silicone e uma junta de seringa em forma de U.

Defina as taxas de fluxo das bombas equipadas com seringas de óleo entre 1,1 e 5,5 mililitros por hora. Passe o óleo pelo chip microfluídico por pelo menos 30 minutos para preparar o chip e confirmar que o chip está livre de defeitos. Em seguida, forneça simultaneamente as duas soluções de polímero ao chip preparado a 03 mL por hora.

Deixe o fluxo de polímero e óleo se equilibrar por 30 minutos a uma hora. Para evitar a gelificação prematura dos polímeros precursores no bico microfluídico, é essencial preparar cuidadosamente a tubulação e iniciar o fluxo do polímero exatamente ao mesmo tempo para evitar o refluxo em qualquer reservatório de polímero. Uma vez que micropartículas de gel uniformes estejam se formando no bico do chip microfluídico, colete as partículas em um tubo de centrífuga de plástico com uma barra de agitação magnética ativa.

Pare as bombas de seringa e o motor de agitação quando o óleo for consumido. Assim que as micropartículas de gel se depositarem no tubo, transvase o óleo de parafina com uma pipeta. Adicione ao frasco 10 mililitros de pentano para cada 5 mL de micropartículas.

Misture vigorosamente o emolumento por cerca de um minuto. Deixar as partículas repousar durante uma ou duas horas antes de decantar o pentano com uma pipeta. Repita esta lavagem de pentano pelo menos cinco vezes.

Transfira as micropartículas de gel lavadas para um pequeno frasco de cintilação de vidro. Ressuspenda as partículas em um a dois mililitros de água deionizada. Para iniciar este procedimento, prepare cinco mililitros de cada uma das soluções de 1% de hidrazida e poli NIPAM funcionalizado com aldeído em água deionizada.

Aqueça cinco mililitros da solução de poli NIPAM funcionalizada com hidrazida a 70 graus Celsius enquanto mexe. Monitore a solução à medida que ela se torna opaca e confirme se nenhum precipitado visível se forma. Em seguida, adicione 0,25 mililitros da solução de poli NIPAM funcionalizada com aldeído gota a gota à solução de poli NIPAM funcionalizada por hidrazida aquecida ao longo de cinco a 10 segundos.

Mexa a mistura por 15 minutos a 70 graus Celsius. Em seguida, remova a mistura do banho de óleo e deixe-a esfriar até a temperatura ambiente durante a noite para obter os nanogéis para purificação. Coloque a mistura de nano gel em uma membrana de diálise cortada com peso molecular de 3500 kilodaltons.

Dialise os nanogéis contra água dionizada seis vezes em ciclos de seis horas para remover polímeros não reticulados. Se desejar, liofilize os nanogéis purificados para armazenamento. Para iniciar o procedimento de fabricação de nanofibras de gel, prepare um mililitro de cada uma das soluções de 15% em peso de hidrazida e POEGMA funcionalizada com aldeído em água deionizada.

Em seguida, prepare dois mililitros de uma solução a 5% em peso de óxido de polietileno de alto peso moleculor em água deionizada. Combinar cada solução precursora de POEGMA com um mililitro da solução de óxido de polietileno. Carregue as soluções precursoras em cilindros separados da seringa de cilindro duplo.

Em seguida, conecte um misturador estático de 1,5 polegada e uma agulha de calibre 18 com ponta romba a uma seringa de cano duplo 1:1 de 2,5 mililitros. Monte a seringa de barril duplo em uma bomba de seringa de infusão. Em seguida, monte um coletor eletrogiratório de disco de alumínio a 10 centímetros da extremidade da agulha.

Aterre uma fonte de alimentação de alta tensão no coletor e conecte a fonte de alimentação à agulha. Defina a bomba de seringa para 0,48 mililitros por hora e a fonte de alimentação para 10 quilovolts. Inicie simultaneamente a bomba de seringa e a fonte de alimentação para iniciar a eletrocentrifugação.

Continue até que a espessura desejada seja alcançada ou os precursores se esgotem. Após o término da produção de nanofibras, desligue e desconecte o conjunto de eletrofiação. Mergulhe as nanofibras de gel coletadas em água deionizada por 24 horas para remover o óxido de polietileno.

A entrega de seringa de barril duplo produziu géis de hidra a granel POEGMA reticulados com hidrazona com uma variedade de mecânicas, tempos de gelificação e transparências, dependendo da concentração do polímero precursor, da densidade do grupo funcional reativo e do número de unidades de repetição de óxido de etileno nos monômeros. As taxas de fluxo das soluções de óleo de parafina e precursor de polímero afetaram os tamanhos das micropartículas de gel de poli NIPAM reticuladas por hidrozona fabricadas com o dispositivo microfluídico. Inchaço reversível dependente da temperatura foi observado com microscopia óptica de estágio quente.

As micropartículas de gel se degradaram em seus precursores oligoméricos ao longo do tempo. Os tamanhos dos nanogéis de poli NIPAM reticulados por hidrazona automontados variaram com a relação entre massa e precursor de polímero funcionalizado por aldeído para hidrazida, mas permaneceram altamente monodispersos. À medida que a razão de massa aumentou, menos desinchamento térmico foi observado.

Como as micropartículas de gel, os nanogéis se degradaram em precursores oligoméricos ao longo do tempo. Nanofibras de hidrogel POEGMA reticuladas com diâmetros da ordem de 300 nanômetros foram produzidas por eletrofiação reativa. A hidratação das nanofibras foi cerca de duas ordens de magnitude mais rápida do que a hidratação de um gel a granel com a mesma composição de polímero.

As nanofibras mantiveram sua morfologia nanofibrosa por mais de oito semanas antes de se degradarem em condições fisiológicas. A degradação mais rápida ocorreu em ambientes ácidos. As nanofibras eram mecanicamente robustas nos estados seco e inchado.

Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma boa compreensão de como criar hidrogéis degradáveis e termorresponsivos, controlando a geometria na qual os polímeros precursores de gel são feitos. Lembre-se de garantir que o tempo de gelificação do precursor do polímero corresponda às necessidades de cada partícula. A gelificação muito rápida inibirá a fabricação de microgel e nanofibras.

A gelificação muito lenta resultará em morfologias totalmente congeladas. Essas técnicas abrem caminho para pesquisadores nas áreas de administração de medicamentos e engenharia de tecidos. e projetar andaimes de hidrogel bem definidos para controlar a taxa ou localização da liberação do medicamento ou estimular a regeneração do tecido.