Detecção da actividade de dependente do pH Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro e In Vivo

O objetivo geral desses ensaios in vivo e in vitro é caracterizar a atividade dependente do pH da chaperona HdeB de Escherichia coli sob condições ácidas de pH. As chaperonas ativadas por ácido têm apenas um trabalho a fazer, elas precisam proteger as proteínas contra o desdobramento e a degradação de proteínas induzidas por ácido. Essa função é particularmente importante para bactérias entéricas, que precisam sobreviver ao ambiente ácido do estômago se quiserem colonizar o intestino com sucesso.

Os métodos que apresentamos aqui permitem identificar e caracterizar chaperonas ativadas por ácido e definir as condições de pH que levam à sua ativação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como caracterizar as chaperonas, como HdeB in vitro e in vivo, o que ajuda a decifrar o mecanismo de sua ativação. Esses métodos foram aplicados com sucesso para outras chaperonas de proteção ácida, como HDA, e podem ser modificados para funcionar com outras chaperonas e/ou condições de estresse.

A influência da HdeB purificada na agregação da malato desidrogenase mitocondrial suína termicamente desidrogenase em diferentes valores de pH é monitorada. MDH dialisado a quatro graus Celsius durante a noite contra quatro litros de tampão C. Em seguida, concentre a proteína em aproximadamente 100 micromolares usando unidades de filtro centrífugo com um corte de peso molecular de 30 kilodaltons. Para remover agregados, centrifugue a proteína por 20 minutos a 20.000 vezes G a quatro graus Celsius.

Determinar a concentração de MDH por absorbância a 280 nanomolares. Em seguida, prepare alíquotas de 50 microlitros de MDH e congele rapidamente as alíquotas para armazenamento. Coloque uma cubeta de quartzo de um mililitro em um espectrofotômetro fluorescente equipado com porta-amostras e agitadores com temperatura controlada.

Defina o comprimento de onda de excitação e admissão para 350 nanômetros. Adicione os volumes apropriados de tampão D pré-aquecido aos valores de pH desejados à cubeta. O volume total é de 1.000 microlitros.

Defina a temperatura no porta-cuvetes para 43 graus Celsius. Adicione 12,5 micromolares de HdeB ao tampão, seguido pela adição de 0,5 micromolar de MDH. Comece a monitorar a dispersão da luz.

Incubar a reação por 360 segundos para permitir o desdobramento suficiente do MDH. Aumente o pH para sete adicionando um volume de 0,16 a 0,34 de fosfato dipotássico não tampolado de dois molares e continue registrando a dispersão de luz por mais 440 segundos. Analise os dados conforme descrito no protocolo de texto.

Transformar o plasmídeo que expressa HdeB ou o controle vetorial MD, PBAD 18, na cepa BB7224 Delta RPOH usando células quimicamente competentes. Esta variedade é sensível à temperatura e deve ser cultivada a 30 graus Celsius. Após 45 segundos de choque térmico a 42 graus Celsius e antes do revestimento, incube as células a 30 graus Celsius e 200 RPM.

Realize uma única colônia de clones positivos e incube durante a noite a 30 graus Celsius. Prepare uma cultura noturna em 50 mililitros de LB com Ampicilina e cultive as células a 200 RPM e 30 graus Celsius. Dilua as culturas durante a noite 40 vezes em 25 mililitros de LB com ampicilina.

Cultive as bactérias na presença de 0,5% de arabinose a 30 graus Celsius e 200 RPM a uma densidade óptica de 600 nanômetros, ou OD 600 igual a 1,0, para induzir a expressão da proteína HDEB. Para os experimentos de mudança de pH, use LB com ampicilina e arabinose para diluir as células a um OD 600 de 0,5. Ajustar os respectivos valores de pH adicionando volumes apropriados de ácido clorídrico de cinco molares.

Após os pontos de tempo indicados, neutralizar as culturas adicionando os volumes apropriados de hidróxido de sódio de cinco molares. Monitore o crescimento das culturas neutralizadas e da cultura líquida por 12 horas a 30 graus Celsius usando medições de OD. Para investigar o pH ótimo da atividade chaperona de HdeB in vitro, o MDH nativo foi diluído em tampão pré-aquecido do pH indicado na presença ou ausência de HdeB.

Após 360 segundos de incubação, a agregação de MDH a 43 graus Celsius foi desencadeada por meio de neutralização. Na presença de HdeB, o sinal de espalhamento de luz é significativamente diminuído após a neutralização do pH quatro, indicando que o HdeB impede a agregação de MDH. As medições de agregação são muito sensíveis a mudanças na temperatura ou no conteúdo do tampão.

Para eliminar resultados falsos positivos, foi investigada a influência do buffer de armazenamento de chaperonas na agregação do cliente. O buffer de armazenamento HdeB não teve efeito na agregação MDH. Para investigar os efeitos do HdeB in vivo, ensaios de sobrevivência dependentes do pH foram conduzidos usando a cepa de deleção RPOH sensível à temperatura.

Esta cepa não possui a maioria das chaperonas e, portanto, é mais suscetível a temperaturas elevadas, pH baixo ou estresse oxidado. A superexpressão do HdeB em condições de pH neutro não mostrou efeito sobre a taxa de crescimento da cepa, que cresceu comparativamente bem à cepa controle que abriga o vetor vazio, PBAD 18. Em contraste, foram encontradas diferenças claras em sua capacidade de retomar o crescimento em tratamentos com pH três ou quatro pés, com a cepa de superexpressão de HdeB mostrando uma recuperação reprodutivelmente melhorada do tratamento com pH baixo em comparação com a cepa controle.

Uma vez dominada, a purificação pode ser feita em três dias, o ensaio de espalhamento in vitro em um dia e os ensaios de sobrevivência in vivo em dois dias, se for realizado corretamente. Ao fazer esses experimentos, certifique-se de considerar seu projeto experimental com cuidado, tanto em relação ao tipo de proteínas clientes, suas concentrações e as condições tampão que você usa. A principal vantagem dessa técnica é que ela ajuda a obter uma compreensão mais detalhada sobre o mecanismo de ativação da chaperona e seus efeitos em um contexto in vivo.

E não se esqueça de que estudar o pH ideal de uma chaperona protetora ácida pode ser bastante desafiador. Isso ocorre porque o comportamento de agregação da proteína cliente que você usa provavelmente também mudará com o pH. Portanto, certifique-se de escolher sistemas tampão adequados tanto para a chaperona quanto para a proteína do cliente.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como ensaios de spin down por página SCS, podem ser realizados na supressão mediada por chaperona autoquantificada da agregação de clientes.