Name: Detecção da actividade de dependente do pH Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro e In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a caracterizar a atividade do chaperona HdeB de Escherichia coli em condições ácidas usando ensaios in vitro e in vivo. Este método ajuda pesquisadores a estudar proteção proteica bacteriana.

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Agradecemos ao Dr. Claudia Cremers para ela conselhos úteis sobre ensaios acompanhante. Ken Wan é reconhecido por sua assistência técnica na purificação HdeB. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Howard Hughes Medical (a JCAB) e os Institutos Nacionais de Saúde concessão RO1 GM102829 para JCAB e ujj-UD é apoiado por uma bolsa de pesquisa de pós-doutorado fornecido pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG).

1. Expressão e purificação de periplásmico HdeB NOTA: HdeB foi expressa em E. células de E. coli que albergam o plasmídeo pTrc- hdeB 10, e purificado a partir do periplasma de lise mediante polimixina. <ol><li> Prepara-se uma cultura durante a noite de E. células de E. coli que albergam o plasmídeo pTrc- hdeB 10 em 30 ml de LB contendo 200 ug / ml de ampicilina (LB AMP). Inocular quatro culturas 1 L de LB Amp e crescê-las a 37 ° C e 200 rpm até OD 600nm de 0,7 seja alcançado. Em seguida, adicionam-se 300 ^ M de IPTG para induzir a expressão de HdeB e diminuir a temperatura de crescimento para 30 ° C. </li><li> Após 5 h de expressão de proteína a 30 ° C, a colheita das células por centrifugação a 8000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lava-se a pelete de células com 100 ml de tampão A (Tris / HCl 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e centrifuga-se novamente as células a 8000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Subsequentemente, ressuspendero sedimento celular em 80 ml de tampão A, contendo 1 mg / ml de sulfato de polimixina. Para perturbações eficiente da membrana externa, agita-se suavemente a suspensão durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Para remover a fracção citoplasmática e os detritos celulares, Centrifugar a suspensão durante 20 min a 15000 xg, a 4 ° C. Isto resulta em ~ 60 ml de sobrenadante contendo o HdeB solúvel. </li><li> Dialisar o sobrenadante contendo o extracto periplasmático durante a noite contra o volume 150 vezes de tampão B (Tris 20 mM / HCl, EDTA 0,5 mM, pH 8,0) utilizando uma membrana de diálise com 6 kDa de PM de. Concentram-se as proteínas para 15 mL utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de exclusão de 3 kDa. Filtra-se a solução de proteína através de um filtro de 0,2 um de poro. </li><li> Aplicar a proteína numa coluna de cromatografia de permuta aniónica (volume de coluna de 5 ml) que tinha sido equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão B com um caudal de 2,5 ml / min. Uma vez que a proteína é carregada sobre a coluna, lava-se a coluna com tampão B durante 10 min aum caudal de 2,5 ml / min. Eluir HdeB com um gradiente linear de NaCl de 0 a 0,5 M em tampão B ao longo de um período de tempo de 50 min com um caudal de 2,5 ml / min 6. </li><li> Identificar fracções contendo HdeB usando um 15% de SDS-PAGE. Misture 20 mL da amostra com 5 mL de 5x reduzida tampão de carga SDS. Carga de 10 ul sobre o gel e executar em tampão de Tris-glicina (14,4 g / l de glicina, 2,9 g / L de Tris, 1 g / L de sulfato de dodecilo de sódio, pH 8,3). Submeter o gel a 150 V até que a banda tenha migrado bromofenol perto do fundo do gel (~ 45 min). </li><li> Piscina todas as fracções HdeB contendo, diálise a 4 ° C durante a noite contra 4 litros de tampão de armazenamento HdeB (50 mM Tris / HCl, 200 mM de NaCl, pH 8,0), e concentra-se a proteína a aproximadamente 300 pM utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de corte de 3 kDa. Determinar a concentração de HdeB a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção ε 280 nm = 15595 M -1 cm -1. Prepare 100 mL alíquotas e sem flashze as alíquotas em nitrogênio líquido. NOTA: HdeB pode ser armazenado a -70 ° C durante pelo menos 6 meses. </li></ol> 2. Chaperone Atividade ensaio utilizando termicamente Unfolding malato desidrogenase (MDH) NOTA: A influência da HdeB purificado sobre a agregação de desdobrar termicamente porcino malato desidrogenase mitocondrial (MDH) a diferentes valores de pH foi monitorizado tal como descrito abaixo. Todas as concentrações de proteína listadas referem-se a concentração de monómero. <ol><li> Para preparar MDH, dialisar MDH a 4 ° C durante a noite contra 4 litros de tampão C (fosfato de potássio 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e concentra-se a proteína a aproximadamente 100 pM utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de corte de 30 kDa. NOTA: diálise cuidadosa de MDH é necessária como MDH é entregue como solução de sulfato de amónio. </li><li> Para remover os agregados, centrifugar a proteína durante 20 minutos a 20000 xg, a 4 ° C. Determinar a concentração MDH por absorvância a 280 nm (ε &lt;sub&gt; 280 nm = 7950 M -1 cm -1). Prepare 50 mL alíquotas de MDH e flash-congelar as alíquotas para armazenamento. </li><li> Coloque 1 ml cuvete de quartzo num espectrofotómetro de fluorescência equipado com suportes de amostras de temperatura controlada e agitador. Definir ex λ / em até 350 nm. </li><li> Adicionar volumes adequados de pré-aquecido (43 ° C) de tampão D (fosfato de potássio 150 mM, NaCl 150 mM) com os valores desejados de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) para a cuvete e conjunto a temperatura no suporte da cuvete a 43 ° C. O volume total é de 1000 jil. </li><li> Adicionar 12,5? M HdeB (ou alternativamente o mesmo volume de tampão de armazenamento HdeB para o controlo tampão) para o tampão, seguido pela adição de 0,5 uM MDH. Começar a monitorar a dispersão da luz. Incubar a mistura reaccional durante 360 ​​segundos para permitir que suficiente desdobramento de MDH. </li><li> Elevar o pH para 7 pela adição de 0,16-0,34 volume de 2 M não tamponada K 2 HPO 4 e continuar regundo a dispersão de luz para a outra 440 seg. </li><li> Definir a extensão da agregação MDH que é gravado na ausência da chaperona em um ponto de tempo definido depois da neutralização (aqui depois de 500 segundos, quando foi observada dispersão da luz máxima de MDH) a 100%. Normalizar a actividade do HdeB ao sinal de dispersão da luz de MDH na ausência de HdeB a cada valor de pH indicado. </li></ol> 3. Detecção de HdeB-LDH Formação do Complexo pela Analytical Ultracentrifugação (AUC) NOTA: Sedimentação experiências de velocidade de HdeB isoladamente ou em complexo com termicamente desdobramento da lactato desidrogenase (LDH) foram realizadas usando uma ultracentrífuga analítica. <ol><li> Para preparar a LDH, dialisar LDH a 4 ° C durante a noite contra 4 litros de tampão C (fosfato de potássio 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5) e concentra-se a proteína a aproximadamente 200 pM utilizando unidades de filtro centrífugo com um peso molecular de corte de 30 kDa. NOTA: diálise cuidadosa da LDH é necessária como LDH é entregue como uma solução de sulfato de amónio. </li><li> Para remover os agregados, centrífuga de LDH durante 20 min a 20000 xg, a 4 ° C. Determinar a concentração de LDH por absorvância a 280 nm (ε 280 nm = 43680 M -1 cm -1). Prepare 50 mL alíquotas de LDH e flash-congelar as alíquotas para armazenamento. </li><li> Incubar 3 LDH uM na presença e ausência de 30 uM HdeB em tampão D (pH 4 e 7, respectivamente) durante 15 min a 41 ° C. NOTA: A incubação da LDH a temperaturas mais elevadas resulta em completa a sua agregação, e nenhum efeito de chaperona HdeB pode ser observada. </li><li> Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente. Em seguida, as amostras de carga em células contendo sector padrão em forma de peças centrais de 2 canais com comprimento de caminho 1,2 cm. Carregar as células na ultracentrífuga e equilibrar a 22 ° C durante pelo menos 1 h antes de sedimentação. </li><li> amostras de rotação a 22 ° C e 167.000 xg no respectivo rotor durante 12 h, e monitorar o sedimentation da proteína continuamente a 280 nm. Como demonstrado anteriormente, a relação sinal-ruído é melhorada quando a intensidade da luz transmitida de cada canal é medido em vez de absorvância. Isto também melhora a qualidade da subsequente ajuste de dados. </li><li> Realizar análise de dados com SEDFIT (versão 15.01b, dezembro de 2015), utilizando a contínua c (s) modelo de distribuição 17. Um tutorial descreve como usar SEDFIT podem ser encontrados na referência 18. <ol><li> Definir o nível de confiança para a regularização ME (Máxima Entropia) a 0,7. </li></ol></li><li> Calcular a densidade de tampão, bem como a viscosidade usando SEDNTERP 19. Para estimar a quantidade de proteína agregada cliente, comparar os integrais de LDH sedimentada em pH 4 a pH 7, como uma referência. NOTA: Integração das parcelas de distribuição de sedimentação pode ser feito diretamente no SEDFIT. Software alternativa para analisar dados de velocidade de sedimentação podem ser encontrados em uma revisão recente 20. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Acompanhamento MDH Inactivação e Reativação na Presença de HdeB NOTA: A influência da HdeB purificado sobre o re-enrolamento de pH-desdobrado MDH foi determinada pela monitorização da actividade MDH mediante neutralização. <ol><li> Incubar 1 uM MDH em tampão D, com os valores desejados de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) durante 1 h a 37 ° C na ausência ou na presença de 25 uM HdeB. Em seguida, deslocar a temperatura a 20 ° C durante 10 min. NOTA: Não MDH redobragem foi observada mesmo na presença de HdeB quando MDH foi incubada a temperaturas superiores a 37 ° C. </li><li> Para iniciar o re-enrolamento de ácido MDH desnaturado, neutralizar as amostras a pH 7 pela adição de 0,13-0,42 volume de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8,0. </li><li> Após incubação durante 2 horas a 20 ° C, determinar a actividade MDH através da monitorização da queda de NADH a 340 nm 9. NOTA: MDH catalisa a redução dependente de NADH de oxaloacetato em L-malato. <ol&gt; <li> Misturar 50 uL da reacção de incubação com 950 ul de tampão de ensaio (fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, 1 mM de oxaloacetato, e 150 ^ M de NADH). NOTA: A concentração final de MDH no tampão de ensaio deve ser de 44 nM. </li><li> Monitorar a variação de absorvância utilizando um espectrofotómetro, equipada com um bloco de controlo de temperatura de Peltier ajustado para 20 ° C. </li><li> Relatar a atividade MDH relativa a 44 nM MDH nativa que foi mantida a pH 7.0. </li></ol></li></ol> 5. Efeito de HdeB A sobre-expressão em E. coli Sobrevivência ao estresse por ácido NOTA: E. coli MG1655 ADN genómico foi isolado utilizando um protocolo publicado a 21. <ol><li> Amplificar hdeB de E. MG1655 coli por PCR usando primers hdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG ATT CAA GTC e hdeB - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT TCA TCA TCT CTC C. </li><li> Defina-se a reacção de PCR em 50 ul da seguinte forma: 10 L de 5x tampão de polimerase, 200 uM de dNTP, 0,5 uM de iniciadores JUD2, 0,5 uM de iniciadores JUD5, 150 ng MG1655 de DNA genómico, 0,5 de polimerase de ADN ul, adicionar ddH2O a 50 ul. </li><li> Efectue a amplificação de hdeB como se segue: Passo 1: 5 min a 95 ° C, 1 ciclo; Etapa 2: 30 seg a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C, 30 seg a 72 ° C, 40 ciclos; Passo 3: 10 min a 72 ° C. </li><li> O clone resultante fragmento de PCR nos sítios EcoR I e BamH I do plasmídeo pBAD18 usando métodos padrão para o sítio de restrição de clonagem. Purifica-se o plasmídeo utilizando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Verifique se o plasmídeo resultante por sequenciamento 10. </li><li> Transformar o plasmídeo expressando HdeB ou os pBAD18 de controle de vetores vazios em BB7224 tensão (Δ rpoH) (genótipo: F -, λ -, e14 -, [araD139] B / r [6; (argFlac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (FIMB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 araD + rpoH :: kan +; 16) usando células quimicamente competentes. NOTA: Esta estirpe é sensível à temperatura. </li><li> Depois de 45 segundos de choque térmico a 42 ° C e antes do plaqueamento, as células incubar a 30 ° C e 200 rpm. Realizar colónias raia-saídas individuais dos clones positivos e incubar durante a noite a 30 ° C. Prepara-se uma cultura durante a noite em 50 ml de LB Amp e cultivar as células a 200 rpm e 30 ° C. </li><li> Dilui-se as culturas durante a noite de 40-vezes em 25 ml de LB Amp e as bactérias crescem na presença de 0,5% de arabinose (Ara) a 30 ° C e 200 rpm para um OD 600 nm = 1,0 para induzir a expressão da proteína HdeB. </li><li> Para as experiências de deslocamento de pH, utilizar LBAmp Ara + para diluir as células a 600 nm de 0,5 OD e ajustar-se os respectivos valores de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0 e pH 4,0) por adição de quantidades apropriadas de HCl a 5 m. </li><li> Após os pontos de tempo indicados (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min, pH 4, 30 min), neutralizar as culturas por adição das quantidades apropriadas de NaOH 5 M. </li><li> Monitorar o crescimento das culturas neutralizados em cultura líquida durante 12 horas a 30 ° C, utilizando medições de densidade óptica. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar

<html> A fim de estudar o mecanismo de activação e função de chaperona de HdeB, grandes quantidades de HdeB tem que ser expresso e purificado. Um número de sistemas de vector de expressão estão disponíveis para a produção de níveis elevados de uma proteína alvo, incluindo vectores pTrc ou pBAD, ambos os quais foram utilizados neste estudo. Os promotores sejam facilmente acessíveis para E. coli RNA polimerase e expressão, assim, permitir fortemente regulada positivamente de HdeB em qualquer E. coli. Este...

Um ambiente natural comum em que agentes patogénicos microbianos experimentar condições de desdobramento da proteína induzida por ácido do estômago de mamífero é (gama de pH 1-4), cujo pH ácido serve como uma barreira eficaz contra agentes patogénicos de origem alimentar 1. Proteína se desdobrar e agregação, que é causada por protonação cadeia lateral de aminoácido, afecta os processos biológicos, danifica as estruturas celulares e, eventualmente, 1,2 provoca a morte celular. Uma vez que o pH do periplasma bacteriano equilibra-se quase instantaneamente com o pH do ambiente devido à livre difusão de protões através da membrana exterior porosa, proteínas da membrana periplasmática e interiores das bactérias Gram-negativas são os componentes celulares mais vulneráveis em condições ácidas com o stress 3. Para proteger sua proteoma periplasmático contra danos mediada pelo ácido rápida, bactérias Gram-negativas utilizar os chaperones periplï¿½micos ativada por ácido HdeA e HdeB. HdeA é um acompanhante condicionalmente desordenada <sup&gt; 4,5: A um pH neutro, HdeA está presente como um dímero dobrado, a chaperona inactivo. Era uma mudança de pH abaixo de pH 3, função de acompanhante de HdeA é rapidamente activado 6,7. Ativação de HdeA requer profundas mudanças estruturais, incluindo a sua dissociação em monómeros, e a parcial desdobramento dos monômeros 6-8. Uma vez activado, HdeA liga-se a proteínas que se desdobram em condições ácidas. Ele evita eficazmente a sua agregação, tanto durante a incubação a pH baixo, bem como mediante a neutralização do pH. Ao retornar para pH 7,0, HdeA facilita a re-enrolamento de suas proteínas clientes de forma ATP-independente e converte de volta em seu dimérica, conformação acompanhá-inativa 9. Da mesma forma, o HdeB chaperona homóloga também é chaperona inactiva a um pH de 7,0. Ao contrário HdeA, no entanto, a atividade acompanhante de HdeB atinge o seu máximo aparente em pH 4,0, as condições sob as quais HdeB é ainda largamente postas e diméricas 10. Além disso, reduzindo ainda mais os caus pHes a inativação de HdeB. Estes resultados sugerem que apesar da sua extensa homologia, e HdeA HdeB diferem no seu modo de activação funcional que lhes permite cobrir uma ampla gama de pH com a sua função acompanhante de protecção. Um outro chaperona que tem sido implicado na resistência aos ácidos dos E. coli é o Hsp31 citoplasmática, que aparece para estabilizar proteínas desdobradas cliente até que as condições neutras são restaurados. O modo de acção exacto de Hsp31, no entanto, manteve-se enigmática 12. Tendo em conta que outras bactérias enteropatogénicas tais como Salmonella falta o operão hdeAB, é muito provável que outros acompanhantes periplásmicos ainda não identificadas podem existir que estão envolvidos na resistência ao ácido destas bactérias 11. Os protocolos aqui apresentados permitem monitorizar a actividade de chaperona dependente do pH de HdeB in vitro e in vivo 10 e pode ser aplicado na investigação de outras chaperonastais como Hsp31. Em alternativa, a rede complexa de factores de transcrição que controlam a expressão de hdeAB pode potencialmente ser investigadas pelo ensaio de stress in vivo. Para caracterizar a função de acompanhante de proteínas in vivo, diferentes configurações experimentais podem ser aplicadas. Um caminho é aplicar condições de estresse desdobramento de proteínas e fenotipicamente caracterizar cepas mutantes que ou sobre-expressam o gene de interesse ou carregam uma deleção do gene. Proteomic estudos podem ser conduzidos para identificar quais as proteínas não agregadas sob condições de stress, quando a chaperona está presente, ou a influência de uma chaperona em uma enzima específica pode ser determinada durante condições de stress, utilizando ensaios enzimáticos 14-16. Neste estudo, optou-se sobre-expressar HdeB em uma cepa rpoH exclusão, que não tem o fator sigma de choque térmico 32. rpoH controla a expressão de todos os principais E. chaperones coli e sua eliminação é conhecido por aumentar sensitivity a condições de stress ambientais que causam a proteína se desdobrar 15. A actividade in vivo de chaperona em HdeB foi determinada através da monitorização da sua capacidade para suprimir a sensibilidade da estirpe Δ rpoH pH. Ao todo, os protocolos aqui apresentados fornecem uma abordagem rápida e directa para caracterizar a actividade de uma chaperona activada por ácido in vitro, assim como no contexto in vivo.

<table><tbody><tr><td>Células NEB10-beta E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Mistura de caldo, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Polimixina B&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>100565</tr><tr><td>0,2 &micro; Filtro de Seringa Estéril de Poros</td><td>M Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td><td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>Malato desidrogenase (MDH)</td><td>Fosfato</td><td>de potássio Roche 10127914001</td><td></td></tr><tr><td>(Monobásico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potássio fosfato (Dibásico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 espectrofotômetro de fluorescência</td><td>Hitachi</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>Oxaloacetato</td><td>Sigma</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>Lactato desidrogenase (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I Ultracentrífuga analítica</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href='https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render& wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/'>392764</a></td><td></td></tr><tr><td>Peça central, 12 mm, Epon</td><td>Beckman Coulter</td> cheio de carvão <td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, Analítico, 8-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep Kit</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>usado para purificação de plasmídeo (Protocolo 5.1)</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de célula de fluorescência</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Clorídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrífuga</td> UFC900324 <td>Millipore</td><td></td><td></td>3K NMWL de 15 ml</tr><tr><td>Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 50 Membrana</td> de Diálise <td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 MWCO: 6</td><td>kDa Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Unidades de Filtro Centrífugo 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclador de 96 Poços</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção da actividade de dependente do ph<em&gt; escherichia coli</em&gt; chaperone hdeb<em&gt; in vitro</em&gt; e<em&gt; in vivo</em

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

As bactérias são freqüentemente expostos a mudanças ambientais, tais como alterações no pH, temperatura, estado redox, a exposição à luz ou força mecânica. Muitas destas condições causar proteína se desdobrar na célula e ter um impacto negativo sobre a sobrevivência do organismo. Um grupo de chaperonas moleculares independentes, específicos de stress têm sido mostrados para desempenhar papéis essenciais na sobrevivência destas condições de stress. Enquanto totalmente dobrado e acompanhante-inativo antes de stress, estas proteínas se desdobram rapidamente e se tornar acompanhante-ativa sob condições de estresse específicos. Uma vez activadas, estas chaperonas condicionalmente desordenados se ligam a um grande número de proteínas de agregação propensas diferentes, impedir a sua agregação e facilitar, quer directamente ou indirectamente, a proteína de redobragem após o regresso a condições não-tensão. A abordagem principal para ganhar uma compreensão mais detalhada sobre o mecanismo da sua activação e cliente reconhecimento envolve a purificação e subsequent caracterização dessas proteínas chaperonas utilizando ensaios in vitro. Follow-up em ensaios de estresse in vivo são absolutamente essenciais para confirmar independentemente o obtido resultados in vitro. Este protocolo descreve in vitro e in vivo em métodos para caracterizar a actividade de chaperona E. coli HdeB, uma chaperona activadas por ácido. Medições de dispersão de luz foram utilizados como uma leitura conveniente limite para a capacidade de HdeB para prevenir a agregação induzida por ácido de uma proteína modelo estabelecido cliente, MDH, in vitro. experimentos ultracentrifugação analítica foram aplicados para revelar formação de complexos entre HdeB e sua LDH proteína cliente, para lançar luz sobre o destino de proteínas clientes após o seu regresso a condições não-estresse. ensaios de actividade enzimática das proteínas de cliente foram conduzidos para monitorizar os efeitos da inactivação HdeB no cliente induzida pelo pH e reactivação. Finalmente, os estudos de sobrevivência foram usadas para monitor a influência da função da chaperona HdeB in vivo.

HdeA HdeB e são homólogas de E. proteínas coli, conhecida para proteger proteínas periplï¿½micos contra condições de estresse ácido 10. O nosso trabalho mostrou que semelhante ao HdeA, HdeB também funciona como um ácido activado de chaperona molecular. No entanto, em contraste com funções HdeA, HdeB a um pH que ainda é potencialmente bactericida, mas significativamente mais elevada do que o óptimo de pH HdeA 6,9,10,22. Para investigar o óptimo de a...

Este estudo descreve técnicas biofísicas, bioquímicos e moleculares que caracterizam a actividade acompanhante de Escherichia coli HdeB sob condições de pH ácido. Estes métodos têm sido aplicados com sucesso para outras chaperonas ácido-protectores, tais como HdeA e pode ser modificado para funcionar com os outros acompanhantes e condições de stress.

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

O objetivo geral desses ensaios de chaperona in vivo e in vitro é caracterizar a atividade dependente de pH da chaperona HdeB de Escherichia coli sob condições de pH ácido. Chaperonas ativadas por ácido têm apenas uma função: precisam proteger proteínas contra o desdobramento e degradação induzidos por ácido. Essa função é particularmente importante para bactérias entéricas, que precisam sobreviver ao ambiente ácido do estômago para colonizar com sucesso o intestino.Os métodos que estamos apresentando aqui permitem identificar e caracterizar chaperonas ativadas por ácido e definir as condições de pH que levam à sua ativação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar as chaperonas, como a HdeB, in vitro e in vivo, o que o ajuda a decifrar o mecanismo de sua ativação. Esses métodos foram aplicados com sucesso em outras chaperonas protetoras contra a acidez, como a HDA, e podem ser ainda modificados para funcionar com outras chaperonas e/ou condições de estresse.Monitora-se a influência da HdeB purificada sobre a agregação da desidrogenase málica mitocondrial de porcino em processo de desdobramento térmico em diferentes valores de pH. Diализa-se a MDH a quatro graus Celsius durante a noite contra quatro litros do tampão C. Em seguida, concentra-se a proteína até aproximadamente 100 micromolares utilizando unidades de filtro centrífugo com corte de peso molecular de 30 kilodaltons. Para remover agregados, centrifuga-se a proteína por 20 minutos a 20.000 vezes G a quatro graus Celsius.Determine a concentração de MDH por absorvância a 280 nanomolar. Em seguida, prepare alíquotas de 50 microlitros de MDH e congele rapidamente as alíquotas para armazenamento. Coloque uma cubeta de quartzo de um mililitro em um espectrofotômetro de fluorescência equipado com suportes de amostra com controle de temperatura e agitadores.Defina o comprimento de onda de excitação e de entrada em 350 nanômetros. Adicione os volumes apropriados do tampão D pré-aquecido nos valores de pH desejados à cubeta. O volume total é de 1.000 microlitros.Defina a temperatura no porta-cubetas como 43 graus Celsius. Adicione 12,5 micromolar de HdeB ao tampão, seguido pela adição de 0,5 micromolar de MDH. Inicie o monitoramento da dispersão da luz.Incube a reação por 360 segundos para permitir a desnaturalização suficiente da MDH. Eleve o pH para sete adicionando um volume de 0,16 a 0,34 de fosfato de dipotássio não tamponado 2 M e continue registrando a dispersão da luz por mais 440 segundos. Analise os dados conforme descrito no protocolo textual.Transforme o plasmídeo que expressa HdeB ou o controle vetorial MD, PBAD 18, na linhagem BB7224 Delta RPOH utilizando células quimicamente competentes. Esta linhagem é sensível à temperatura e deve ser cultivada a 30 graus Celsius. Após 45 segundos de choque térmico a 42 graus Celsius e antes da semeadura, incube as células a 30 graus Celsius e 200 rpm.Realize o estriamento de col&ocirc;nias isoladas de clones positivos e incube durante a noite a 30 graus Celsius. Prepare um cultivo noturno em 50 mililitros de LB com ampicilina e cultive as c&eacute;lulas a 200 RPM e 30 graus Celsius. Dilua os cultivos noturnos 40 vezes em 25 mililitros de LB com ampicilina.Cultive as bactérias na presença de 0,5% de arabinose a 30 graus Celsius e 200 rpm até atingir uma densidade óptica a 600 nanômetros, ou OD 600, igual a 1,0, para induzir a expressão da proteína HDEB. Para os experimentos de mudança de pH, use LB com ampicilina e arabinose para diluir as células até um OD 600 de 0,5. Ajuste para os valores de pH respectivos adicionando volumes apropriados de ácido clorídrico cinco molar.Após os pontos de tempo indicados, neutralize os cultivos pela adição dos volumes apropriados de hidróxido de sódio cinco molar. Monitore o crescimento dos cultivos neutralizados e do cultivo líquido por 12 horas a 30 graus Celsius utilizando medições de OD. Para investigar o pH ótimo da atividade de chaperona de HdeB in vitro, o MDH nativo foi diluído em tampão pré-aquecido do pH indicado na presença ou ausência de HdeB.Após 360 segundos de incubação, a agregação da MDH a 43 graus Celsius foi desencadeada por meio da neutralização. Na presença de HdeB, o sinal de dispersão de luz é significativamente reduzido após a neutralização a partir de pH 4, indicando que HdeB impede a agregação da MDH. As medições de agregação são muito sensíveis a alterações na temperatura ou na composição do tampão.Para eliminar resultados falsos positivos, investigou-se a influência do tampão de armazenamento da chaperona na agregação do cliente. O tampão de armazenamento de HdeB não teve efeito sobre a agregação de MDH. Para investigar os efeitos de HdeB in vivo, ensaios de sobrevivência dependentes de pH foram realizados utilizando a linhagem com deleção sensível à temperatura de RPOH.Esta linhagem carece da maioria das chaperonas e, portanto, é mais suscetível à temperatura elevada, pH baixo ou estresse oxidativo. A superexpressão da HdeB sob condições de pH neutro não mostrou efeito na taxa de crescimento da linhagem, que cresceu igualmente bem em comparação com a linhagem controle que carrega o vetor vazio, PBAD 18. Em contraste, diferenças claras foram observadas em sua capacidade de retomar o crescimento após tratamentos com pH três ou pH quatro, sendo que a linhagem que superexpressa HdeB demonstrou recuperação consistentemente melhor após tratamento com pH baixo em comparação com a linhagem controle.Uma vez dominado, o processo de purificação pode ser realizado em três dias, o ensaio de espalhamento in vitro em um dia e os ensaios de sobrevivência in vivo em dois dias, se for realizado corretamente. Ao realizar esses experimentos, certifique-se de planejar cuidadosamente o seu delineamento experimental, considerando tanto o tipo de proteínas cliente, suas concentrações quanto as condições de tampão utilizadas. A principal vantagem dessa técnica é que ela contribui para obter uma compreensão mais detalhada sobre o mecanismo de ativação da chaperona e seus efeitos em um contexto in vivo.E não se esqueça de que estudar o pH ótimo de uma chaperona protetora contra ácidos pode ser bastante desafiador. Isso porque o comportamento de agregação da proteína cliente que você utilizar provavelmente também mudará com o pH. Portanto, certifique-se de escolher sistemas tampão adequados tanto para a chaperona quanto para a proteína cliente.Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de sedimentação por centrifugação utilizando a página SCS, podem ser realizados na quantificação automática da supressão mediada por chaperonas da agregação de substratos.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Fonte: Dahl, J. et al. Detecção da atividade dependente de pH de Escherichia coli Chaperona HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um ensaio baseado em espectrofotômetro de fluorescência para avaliar a atividade de chaperonas em uma proteína substrato sob estresse ácido e térmico. Ele descreve as etapas para monitorar o desdobramento e agregação do substrato por meio da dispersão da luz, comparando condições com e sem o acompanhante.

Avaliação da atividade bacteriana de chaperona por meio do desdobramento térmico de uma proteína modelo

Fonte: Dahl, J., et al. Detecção da atividade dependente de pH de Escherichia coli Chaperona HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o uso de culturas recombinantes de E. coli para avaliar o efeito protetor de uma acompanhante ativada por ácido durante o estresse ácido. O monitoramento do crescimento bacteriano revela maior sobrevivência em culturas que expressam chaperonas em comparação com os controles, destacando o papel das chaperonas na estabilização proteica sob...

Avaliação do Papel Protetor de uma Chaperona Ativada por Ácido em E. coli sob E. Coli sob Estresse Ácido

O protocolo atual detalha um método para medir a atividade das enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializados modificar covalentemente o enzima e permitir a detecção. Este método tem o potencial para identificar novos alvos terapêuticos.

Método para medir a actividade de enzimas deubiquitinating em linhas celulares e amostras de tecidos

Um protocolo detalhado de um modelo de mouse para enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) colonização usando bactérias bioluminescência-etiquetado é apresentado. A detecção destas bactérias bioluminescentes por um não-invasivo na vivo sistema de animais vivos de imagem pode avançar nossa compreensão atual da colonização de EHEC.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Este protocolo descreve uma bateria de métodos que inclui cromatografia analítica de exclusão de tamanho para estudar a oligomerização e estabilidade da histona chaperona, ensaio pull-down para desvendar interações histona-histona-histona, AUC para analisar a estequiometria dos complexos proteicos e ensaio de chaperoning de histonas para caracterizar funcionalmente uma suposta histona chaperone in vitro.

In vitro Caracterização de Chaperones de Histonas utilizando Ensaios Analíticos, Pull-Down e Chaperoning

Este protocolo demonstra a atividade de chaperona da proteína de choque térmico 70 (Hsp70). As células de E. coli dnaK756 servem de modelo para o ensaio, pois abrigam uma Hsp70 nativa funcionalmente prejudicada, tornando-as suscetíveis ao estresse térmico. A introdução heteróloga de Hsp70 funcional resgata a deficiência de crescimento das células.

Ensaio de Complementação Baseado em Escherichia coli para Estudo da Função Chaperone da Proteína de Choque Térmico 70

Um protocolo para a produção, purificação e uso de vesículas de membrana externa (OMV) empacotadas com enzimas, proporcionando maior estabilidade enzimática para implementação em diversas aplicações, é apresentado.

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

Aprenda a caracterizar a atividade do chaperona HdeB de Escherichia coli em condições ácidas usando ensaios in vitro e in vivo. Este método ajuda pesquisadores a estudar proteção proteica bacteriana.

Detecção da actividade de dependente do pH

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