Extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de Aerobic Granular Sludge
26 de setembro de 2016
O protocolo prevê uma metodologia para solubilizar lodo granular aeróbica, a fim de extrair polímeros extracelulares de alginato-like (ALE).
O objetivo geral do seguinte experimento é demonstrar uma metodologia de extração para obter substâncias poliméricas extracelulares estruturais, ou EPS, a partir de bioespumas, especificamente do lodo granular aeróbio. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do lodo granular, tais como compreender o processo de granulação e analisar a composição do EPS.
A principal vantagem desta técnica é que a presença de polímeros formadores de gel na EPS pode ser testada em pouco tempo. Centrifugue o lodo granular a 4.000 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos e decante o sobrenadante. Colete os grânulos no pellet para a extração.
Pré-aqueça 150 mililitros de água da torneira em um béquer de vidro de 1.000 mililitros sobre um agitador magnético até 80 graus Celsius. Transfira três gramas de grânulos para um frasco erlenmeyer de 250 mililitros com placas defletoras e complete o frasco até 50 mililitros com água desmineralizada. Adicione 0,67 gramas de carbonato de sódio deca-hidratado ao frasco para obter uma concentração de carbonato de sódio de 0,5% peso por volume.
Coloque o frasco contendo a mistura no banho-maria. Cubra o frasco e o béquer separadamente com papel alumínio, para evitar evaporação. Agite a mistura por 35 minutos a 400 RPM e 80 graus Celsius.
Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue o tubo contendo a mistura a 4.000 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Colete o sobrenadante e descarte o pellet.
O passo de diálise é opcional para obter EPS estrutural a partir de lodo granular aeróbio. No entanto, apresenta várias vantagens descritas no protocolo. Pipete o sobrenadante para dentro de uma bolsa de diálise, com corte de peso molecular de 3.500 daltons, e realize a diálise durante 24 horas contra 1000 ml de água ultrapura.
Altere a água da diálise após 12 horas para potencializar o efeito da diálise. Transfira o extrato dialisado para um béquer de vidro de 250 ml e agite lentamente a extração a 100 rpm e temperatura ambiente. Monitore constantemente as alterações de pH com um eletrodo de pH, adicionando ácido clorídrico 1 molar até um pH final de 2,2 ± 0,5 para obter a ale na forma ácida.
Após ajustar o pH para 2,2, transfira o extrato para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugue a 4000 ×g e 4 °C por vinte minutos. Descarte o sobrenadante e colete o pellet com aspecto gelatinoso. O pellet com aspecto gelatinoso é o ácido na forma ácida.
Para obter a forma de sódio do ale, adicione lentamente hidróxido de sódio 0,5 molar ao gel, misturando o gel lentamente com um bastão de vidro manualmente até que o pH 8,5 seja atingido. Usando uma pipeta de Pasteur, goteje lentamente o extrato de ale de sódio em uma solução de cloreto de cálcio. Se o EPS extraído tiver propriedades formadoras de gel hidrogel iônico, serão formadas microesferas em forma de gota.
Alternativamente, se o EPS extraído não apresentar propriedades de formação de gel hidrogel iônico, o extrato se dispersará na solução de cloreto de cálcio. Mantenha as microesferas de hidrogel e a solução de cloreto de cálcio por 30 minutos. Utilize uma colher para retirar as microesferas de hidrogel da solução de cloreto de cálcio e transfira-as para uma solução de EDTA.
Armazene as microesferas de hidrogel em 10 ml de solução de EDTA por três horas a quatro graus Celsius. Este teste demonstra um exemplo dos testes de estabilidade descritos no protocolo. Observe se há desintegração visível das microesferas durante este armazenamento, para avaliar se elas suportam essas condições.
Se a extração foi bem-sucedida, o lodo granular aeróbio será solubilizado após a etapa de extração alcalina, e um pellet será obtido após a acidificação e a centrifugação dos EPS extraídos. Se os EPS extraídos forem EPS estruturais e tiverem a capacidade de formar hidrogéis com íons cálcio, microesferas em gel serão formadas ao gotejar os EPS extraídos na solução de cálcio. Se os EPS extraídos não tiverem essa capacidade de formação de gel, a solução de EPS se dispersará na solução de cálcio.
Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de realizar a extração de EPS estrutural do lodo granular aeróbio. Além disso, deverá ser capaz de testar a capacidade de formação de gel dos EPS obtidos com íons cálcio. Optamos por mostrar esta metodologia de extração para ilustrar o impacto da técnica de extração nos EPS obtidos a partir de lodo granular aeróbio.
Além disso, queríamos mostrar que nenhuma técnica de extração de EPS é universalmente aplicável.
Visão Geral
Este protocolo descreve uma metodologia para extração de polímeros extracelulares semelhantes à alginato (ALE) a partir de lodo granular aeróbio. O processo de extração foi desenvolvido para aprimorar a compreensão da composição e propriedades das substâncias poliméricas extracelulares (EPS).
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biotecnologia
- Ciência Ambiental
Contexto
- As substâncias poliméricas extracelulares (EPS) desempenham um papel crucial na formação e estabilidade de biofilmes.
- O lodo granular aeróbio é uma tecnologia promissora para o tratamento de águas residuais.
- Compreender a composição das EPS pode fornecer informações sobre o processo de granulação.
- Testar as propriedades formadoras de gel das EPS pode ter implicações para diversas aplicações.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma metodologia confiável de extração de EPS a partir de lodo granular aeróbio.
- Analisar as propriedades estruturais dos EPS extraídos.
- Avaliar a capacidade de formação de gel dos EPS extraídos com íons cálcio.
Métodos Utilizados
- Centrifugação de lodo granular para separar sobrenadante e pellet.
- Extração alcalina utilizando carbonato de sódio para solubilizar EPS.
- Dialise para purificar os EPS extraídos.
- Ajuste de pH para obter formas semelhantes à alginato dos EPS.
Resultados Principais
- Extração bem-sucedida de pelotas com aspecto gelatinoso indicando a presença de ALE.
- Demonstração das propriedades formadoras de gel quando o EPS é misturado com cloreto de cálcio.
- Avaliação da estabilidade de microesferas de hidrogel sob diversas condições.
- Informações sobre o impacto da técnica de extração nas propriedades do EPS.
Conclusões
- A metodologia desenvolvida extrai efetivamente o EPS do lodo granular aeróbio.
- Compreender as propriedades do EPS pode orientar pesquisas futuras no tratamento de águas residuais.
- São necessários estudos adicionais para explorar a aplicabilidade dessa técnica de extração.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A extração e caracterização de substâncias poliméricas extracelulares estruturais (EPS) do lodo granular aeróbio permite a investigação precisa dos componentes da matriz do biofilme relevantes para bioprocessos e biotecnologia ambiental. A capacidade de isolar polímeros semelhantes à alginato com propriedades gelificantes (ALE) apoia a redução de riscos mecanicistas em fluxos de trabalho onde a composição das EPS influencia a estabilidade do processo e as propriedades dos materiais. Esta metodologia orienta a validação inicial de alvos e a padronização para o desenvolvimento de ensaios subsequentes em processos de biofármacos e biotecnologia industrial.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a análise direta da composição de EPS para esclarecer as vias estruturais do biofilme.
- Apoia a validação funcional de polímeros formadores de gel essenciais para a integridade do biofilme.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de protocolos de extração para matrizes biológicas complexas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece extratos padronizados de EPS para ensaios subsequentes reprodutíveis.
- Permite a avaliação quantitativa da capacidade de formação de gel por meio da formação de microesferas induzida por cálcio.
- Apóia a escalabilidade do ensaio e a reutilização da plataforma ao definir parâmetros de extração.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados da extração com modelos de biofilme relevantes para a doença ou para o processo, quando aplicável.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo a caracterização consistente do EPS.
- Reduz a ambiguidade mecanicista em intervenções direcionadas ao biofilme.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de extração posiciona o isolamento de EPS na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, apoiando fluxos de trabalho desde a testagem de hipóteses até a validação de modelos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Esclarece o papel do EPS estrutural na formação e estabilidade de biofilmes.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis de formação de gel para análise comparativa.
- Análises: Oferece resultados mensuráveis, como estabilidade de microesferas e limiares de solubilização.
- Pesquisa Translacional: Permite alinhar a extração de EPS com modelos relevantes de biofilmes ou materiais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade padronizada de extração para diversas aplicações de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade em estudos de biofilmes relacionados à EPS.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização em fluxos de trabalho de extração e ensaio.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não em desenvolvimentos de processos direcionados a biofilmes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de iniciativas de P&D focadas em biofilmes e EPS.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em biologia de biofilmes e técnicas de extração de polímeros.
- Necessita de acesso a instrumentação para centrifugação, controle de pH e diálise.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de extração e testes de estabilidade.
- Pode exigir adaptação para diferentes sistemas de lodo ou biofilmes com base na composição da matriz.
- A eficácia da extração e a avaliação da formação de gel dependem do método e não são universalmente transferíveis.
