Name: Extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de Aerobic Granular Sludge (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda a extrair substâncias poliméricas extracelulares estruturais de lodo granular aeróbio usando extração alcalina e diálise. Este método permite testar rapidamente as propriedades de formação de hidrogel dos polímeros extraídos.

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Esta pesquisa foi financiada pelo SIAM Gravitation Grant 024.002.002, pela Organização Holandesa para Pesquisa Científica e pela Fundação Holandesa de Tecnologia (STW - Simon Stevin Meester 2013). Os autores querem agradecer a Mario Pronk por fornecer as amostras de lodo granular.

NOTA: AGS foi recolhida a partir do reator piloto Nereda na estação de tratamento de águas residuais Utrecht, na Holanda. O reactor foi alimentado com esgoto municipal. O lodo granular tinha um índice de volume de lodo (SVI 5min) de 59,5 ml / g VSS. A lama foi amostrado em abril, no final de um ciclo aeróbio. Depois da amostragem, a lama foi imediatamente transportada para o laboratório, peneirado e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. 1. EPS Extração NOTA: Centrífuga lamas granulares a 4.000 x g e 4 ° C durante 20 minutos, e decanta-se o sobrenadante. Recolher o sedimento em grânulos para as extracções. Os sólidos totais (TS) e sólidos voláteis (VS) dos grânulos foram determinados pelos métodos padrão 23. O factor de conversão entre grânulo peso húmido - peso dos grânulos obtidos directamente a partir do sedimento - e TS foi determinada antes da extracção. Todas as extracções foram realizadas em triplicado. NOTA: 3 g g molhadaranules foram usadas para cada método de extracção. Os valores de TS e VS (0,39 g TS e 0,34 g VS), medido em triplicado, foram utilizados para calcular o rendimento de extracção. <ol><li> Extração de centrifugação 11 <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos para um tubo de centrifugação e encher-se o tubo de centrifugação de 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Ligeiramente agitar o tubo de centrifugação com a mão. </li><li> Centrifugar o tubo de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Extração de sonicação 10 <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos para um tubo de centrifugação e encher-se o tubo de centrifugação de 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Aplicar ultra-sons pulsada no gelo durante 2,5 minutos a 40 W para a mistura. </li><li> Centrifugar a centrifugaçãotubo contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) extracção 11 <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos dentro de uma garrafa de vidro de 100 ml e encher-se o frasco a 50 ml com 2% (w / v) de solução de EDTA. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e armazená-lo na geladeira a 4 ° C durante 3 horas. </li><li> Transferir a mistura para um tubo de centrifugação de 50 ml. </li><li> Centrifugar o tubo de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Formamida - extracção de hidróxido de sódio (NaOH) 13 <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos em um 100garrafa de vidro ml e encher a garrafa para 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Adicionar 0,3 ml de 99% de formamida. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e armazená-lo na geladeira a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Adiciona-se 20 mL de NaOH 1 M até a suspensão do grânulo. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e armazená-lo na geladeira a 4 ° C durante 3 horas. </li><li> Transferir a mistura uniformemente em dois 50 ml tubo de centrifugação. </li><li> Centrifugar os tubos de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Extracção de NaOH a 11 - formaldeído <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos dentro de uma garrafa de vidro de 100 ml e encher-se o frasco a 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Adicionar 0,3 ml de formaldeído a 37%. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e loja-la no frigorífico a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Adiciona-se 20 mL de NaOH 1 M até a suspensão do grânulo. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e armazená-lo na geladeira a 4 ° C durante 3 horas. </li><li> Transferir a mistura uniformemente em dois 50 ml tubo de centrifugação. </li><li> Centrifugar os tubos de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Alta temperatura - extracção de carbonato de sódio (Na 2 CO 3) 9,22,24 <ol><li> Pré-aquecimento de 150 ml de água da torneira numa proveta de vidro de 1000 ml com um agitador magnético a 80 ° C. </li><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos de 250 ml com deflectores balão e encher-se o balão para 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Adicionar 0,25 g de Na 2 CO 3 anidro ou 0,67 g de Na 2 CO 3 • 10H <sUB&gt; 2 O para dentro do frasco para obter uma solução a 0,5% (w / v) de Na 2 CO 3 a concentração. </li><li> Colocar o frasco contendo a mistura no banho de água. Cobrir o frasco e a proveta de vidro separadamente com folha de alumínio para evitar a evaporação. </li><li> Agita-se a mistura durante 35 min a 400 rpm e 80 ° C. </li><li> Transferir a mistura para um tubo de centrifugação de 50 ml. </li><li> Centrifugar o tubo de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolher o sobrenadante e descartar o pellet. </li></ol></li><li> TS e VS medição de todos os extractos de acordo com os métodos padrão 23. <ol><li> Leve o sobrenadante e diálise-lo por 24 horas contra 1,000 ml água ultrapura (saco de diálise com 3500 Da de peso molecular de corte (MWCO)) 11,12. Mudar a água de diálise após 12 h para aumentar o efeito da diálise. </li><li> Transferir uma fracção razoável (cerca de 1/3) do sobrenadante dialisado paraum prato de alumínio para TS e VS medição 23. NOTA: Secar a amostra durante a noite a 105 ° C. A diferença de peso do prato de alumínio vazia eo prato de alumínio que contém a amostra seca é o conteúdo TS. Em seguida, gravar o mesmo prato de alumínio que contém a amostra a 550 ° C durante 2 h. A diferença de peso entre o prato de alumínio vazia e o prato de alumínio que contém a amostra é queimado o teor de cinzas. A diferença entre o teor de TS e cinzas é o conteúdo VS. </li><li> Para cada extracto, transferir a fracção residual do sobrenadante dialisado a 10 ml provetas de vidro. Engrossar o sobrenadante durante 2 dias a 60 ° C até um volume final de 1-2 ml a aumentar a concentração do polímero no sobrenadante. </li></ol></li></ol> 2. O alginato-like Extracelular Polymer (ALE) Extração <ol><li> Diálise do extracto obtido no passo 1.6.8 acordo com o passo 1.7.1. </li><li> Transferir o extracto dialisado contra 250 ml de uma proveta de vidro. LentoLY agita-se a extracção, a 100 rpm e temperatura ambiente. Constantemente monitorizar as alterações de pH com um eléctrodo de pH, enquanto que a adição de ácido clorídrico 1 M (HCl) a um pH final de 2,2 ± 0,05 para obter ALE sob a forma ácida. </li><li> Depois de ajustar o pH para 2,2, o extracto transferir para um tubo de centrifugação de 50 ml e centrifugar a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e recolher o sedimento tipo gel. O sedimento tipo gel é ALE sob a forma ácida. </li><li> Para obter a forma de ALE de sódio (ou potássio), adiciona-se lentamente NaOH a 0,5 M (ou hidróxido de potássio 0,5 M) para o gel obtido no passo 2.4, enquanto se mistura lentamente o gel com uma vara de vidro com as mãos até pH 8,5 é atingida. </li></ol> Teste de Formação 3. Ionic Hidrogel NOTA: A fim de verificar se os EPS extraídos tinha propriedades de formação de hidrogel iônicos, um teste de formação do grânulo com Ca 2+ foi utilizado 25. <ol><li> Depois de espessamento do extracto no passo 1.7.3 paraum volume de 1-2 ml, agita-se a mistura lentamente com uma vara de vidro e ajustar o seu pH para 8,5 com NaOH 0,5 M. </li><li> Aqui o extracto do passo 3.1 ou o ALE de sódio do passo 2.5 e escorrer lentamente o extracto com uma pipeta de Pasteur, para um 2.5% (w / v) de cloreto de cálcio a solução (CaCl 2). NOTA: Se o EPS extraído tem gel de hidrogel iônica propriedades de formação, em forma de gota (esféricas) grânulos será formada. Se o EPS extraída tem nenhum gel hidrogel iónico propriedades de formação, o extracto se dispersa na solução de CaCl2. </li></ol> 4. Teste de Estabilidade da iónico Hidrogel NOTA: Para compreender melhor o papel do hidrogel EPS iónicos na estrutura de formação AGS, testes de estabilidade foram realizados sobre as pérolas de hidrogel iónicos do Na 2 CO 3, extracção recolhidas no passo 3.2. <ol><li> Manter as pérolas de hidrogel durante 30 minutos na solução de CaCl2. </li><li> Use uma colher para retirar as pérolas de hidrogel do CaCl2 </sub&gt; solução e dividir as contas em quatro fracções iguais. </li><li> fracção da loja 1 em 10 ml de água desmineralizada, durante 4 h a 4 ° C. Os seguintes testes de estabilidade foram realizados da mesma maneira como descrito nos métodos de extracção de 1,3 - 1,5. </li><li> fracção da loja 2 em 10 ml de 2% (w / v) de solução de EDTA durante 3 horas a 4 ° C. </li><li> fracção 3 da loja em 7,15 ml de água desmineralizada com 60 ul de formamida a 99% durante 1 hora a 4 ° C. Em seguida, adicionar 2,85 ml de NaOH 1 M e armazenar fracção 3 durante 3 h a 4 ° C. </li><li> fracção de loja 4, em 7,15 ml de água desmineralizada com 60 ul de 37% de formaldeído, durante 1 hora a 4 ° C. Em seguida, adicionar 2,85 ml de NaOH 1 M e armazenamento correspondente a 4 durante 3 horas a 4 ° C. </li><li> Monitor, se há desintegração visível dos grânulos durante o armazenamento sob as condições descritas no 4,3-4,6 para avaliar se os grânulos de suportar as condições de extracção. </li></ol>

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<li>Liang, Z., Li, W., Yang, S., Du, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+structural+characteristics+of+extracellular+polymeric+substances+%28EPS%29%2C+pellets+in+autotrophic+nitrifying+biofilm+and+activated+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Extraction and structural characteristics of extracellular polymeric substances (EPS), pellets in autotrophic nitrifying biofilm and activated sludge.</a> Chemosphere. 81 (5), 626-632 (2010).</li>
<li>Guo, X., Liu, J., Xiao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+damage+of+cell+wall+and+cell+membrane+for+various+extracellular+polymeric+substance+extractions+of+activated+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the damage of cell wall and cell membrane for various extracellular polymeric substance extractions of activated sludge.</a> J. Biotechnol. 188, 130-135 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Observações para a seção de protocolo A extracção de EPS / ALE é descrito para um volume de 50 ml e 3 g de grânulos. Estes valores são apenas orientações. Extrações com concentrações mais elevadas do grânulo pode diminuir o rendimento dos EPS extraídos. Durante a extracção de ALE a temperatura deve ser mantida constante a 80 ° C durante 30 min. O tempo necessário para a mistura a aquecer-se (cerca de 5 min) está incluído no protocolo. Além disso, a eficácia de extracção é melhorada usando uma barra de agitação magnética com o mesmo tamanho que o diâmetro do fundo do frasco. Isto irá resultar em boas propriedades de mistura e efeitos de fresagem, promovendo a extracção de EPS. Mais tarde, na seção de protocolo, são determinados TS e VS rendimentos de todas as extrações (sobrenadante recolhidos em passos 1.1-1.6). A diálise deve ser realizada antes da TS e VS medição para diminuir possíveis erros, devido à presença de produtos químicos utilizados para a extracção. UMAMWCO de 3500 Da é recomendado para remover estes produtos químicos, mantendo as macromoléculas EPS dentro do saco de diálise. O saco de diálise deve ter um volume maior do que o volume do extracto. Isto é necessário, porque o volume do extracto irá aumentar durante a diálise (por exemplo, para extracção de EDTA até aumento de volume de 40%). A extensão da remoção química por diálise pode ser determinada medindo o pH na amostra antes e após a diálise. Alternativamente, as medições de condutividade da água de diálise mostrar a extensão da remoção de iões. Para obter ALE total extraído a partir dos EPS (passos 1.6 e 2) o passo de diálise é opcional. No entanto, a diálise tem três vantagens: reduz a quantidade de HCl necessário para a precipitação, que melhora a transferência de massa de ácido no extracto e diminui o teor de cinzas do ALE obtido. Para a precipitação do ALE é recomendado o uso de um copo de vidro com um volume muito maior do que a extract. Na 2 CO 3 é normalmente administrado em doses a extracção. O HCl adicionado vai reagir primeiro com o Na 2 CO 3 a esquerda no extracto, resultando na formação de dióxido de carbono e, se a amostra não foi dializada antes, na formação de espuma. Durante a adição de HCl, o extracto deve ser agitada lentamente com uma barra de agitação magnética com o mesmo tamanho que o fundo do copo. Uma barra de agitação deste tamanho e a agitação lenta irá resultar em uma mistura uniforme sem quebrar a estrutura do precipitado. Se grumos de gel de ácidos são formados no extracto, a taça deve ser rodado ligeiramente à mão. A precipitação é realizada com uma concentração de ácido de 1 M para evitar um grande aumento de volume do extracto, enquanto ainda se obtém uma distribuição homogénea do ácido na amostra. Maiores concentrações de ácido pode resultar numa formação de diminuição do pH regional e grumos de gel ácidas. Um pH inferior a 2,0 diminui a quantidade de ALE que pode ser recuperada, provavelmente devido a alterações estruturaisdos polímeros a um pH mais baixo. Por conseguinte, é importante manter o pH final de 2,20 ± 0,05. limitações O método de extracção ALE pretende extrair polímeros extracelulares estruturais do RPE de AGS ou biofilmes em geral e não se destina a extrair todas EPS presentes. Para extrair todos os EPS, uma combinação de mais de um método de extracção é necessária. Além disso, como mostrado com o aumento do rendimento VS EPS por aplicação de uma extracção dupla e quádrupla, uma única extracção não irá extrair todos os EPS estruturais. extracção ALE é um método de extracção de EPS dura, combinando mistura constante com as condições de calor e alcalino-terrosos. Por este motivo, é possível que algum material intracelular é extraído juntamente com o EPS. Embora a lise das células pode ser causado por técnicas de extracção química e física (sonicação 31,32, 31,32 NaOH, EDTA 11,32, CER 32, 32 de calor e elevada tensão de corte por taxas mixing 19), a presença de material intracelular em EPS recuperados ainda precisa de ser verificada. A propriedade iônica de formação de gel das EPS extraídos é o foco principal desta pesquisa, se o EPS recuperado contém material intracelular não foi analisada. A pesquisa futura incidirá sobre a identificação de material intracelular nas EPS extraídos. De solubilização da matriz de hidrogel de AGS é crucial para extrair EPS estruturais EPS forma uma matriz de hidrogel denso e compacto em AGS. Embora EPS contém diversas classes de macromoléculas orgânicas, tais como polissacáridos, não proteínas, ácidos nucleicos, (fosfo) lípidos, substâncias húmicas e alguns polímeros intercelulares 7,5,8, todos eles formam um gel. Apenas esses polímeros formadores de gel são aqui considerados como polímeros estruturais em EPS. O objetivo do EPS extrações é a primeira a solubilizar EPS e, em seguida, para recolher os EPS solubilizados. Se os EPS estruturais (ou seja, tele EPS formando um hidrogel) é o alvo de extracção, a matriz de gel de AGS tem de ser solubilizada em primeiro lugar. Apenas os métodos que podem solubilizar a matriz de gel são capazes de extrair EPS estruturais. Nesta pesquisa, alguns usados frequentemente EPS métodos de extração, como a centrifugação de 10 - 15, ultra-sons 10,14,15, EDTA 10 - 12,14,15, formaldeído + NaOH 10 - 15 e formamida + NaOH 13 não poderia de forma eficiente isolar o estrutural EPS. Isto é devido ao facto de a matriz de hidrogel dos grânulos aeróbicas não foi solubilizado por estes métodos. Por esta razão, os testes de estabilidade na secção 4 só foram realizadas com as condições presentes em EDTA, formamida + NaOH e formaldeído + extração de NaOH. Estes três extracções não foram capazes de isolar EPS estruturais, mas ainda obtido o maior rendimento VS EPS além de Na 2 CO 3 a extracção. condições Sf o Na 2 CO 3 a extracção não foram aplicadas como este método de extracção claramente solubilizado a matriz AGS. Daí as condições aplicadas durante o teste de estabilidade foram consideradas representativas. Extração com resina de troca catiônica (CER), um outro método de extração EPS usado com freqüência, não foi considerado para esta comparação, como os estudos anteriores sobre EPS extracção com CER não deu melhores resultados do que as extrações químicas utilizadas aqui. Gel de formação de EPS em AGS EPS formador de gel são considerados como os EPS estruturais na matriz de hidrogel de AGS. É importante ressaltar que existem vários tipos de hidrogéis tais como géis iônicos, géis induzidas pela temperatura e géis induzidas pH. Este estudo incide apenas sobre EPS que formam géis iônicos. No que diz respeito à grande fracção de material de gel estrutural extraída, isto é provável que seja o EPS estruturais dominantes. Existem, certamente, possibilidades que outros tipos de EPSque forma diferentes tipos de hidrogéis (por exemplo, o pH do gel induzida 28) existem no mesmo ou em outro tipo de grânulos aeróbias. No entanto, não importa que tipo de hidrogel é alvo, solubilização da matriz de gel EPS é o passo mais importante para extrair EPS de formação de gel. Atualmente, pouca pesquisa foi feita em EPS estruturais de lodo granular. A extracção ALE descrito neste protocolo é capaz de extrair EPS formadores de gel de AGS e será utilizado em estudos futuros para caracterizar EPS estruturais. Mais pesquisa precisa ser feito na AGS, EPS estruturais e EPS não-estruturais para compreender melhor o processo e função de granulação e EPS. Especialmente os seguintes três pontos precisam ser investigados: por microorganismos produzem uma quantidade tão grande de EPS, qual é a composição exata do EPS e como é a composição do EPS modificada dependendo das mudanças ambientais. Detecção e análise de todos os compostos envolvidos e suas interactions irá ajudar a compreender biofilmes e como usá-los a nosso favor.

Nos últimos anos o processo aeróbio lodo granular (AGS) tornou-se um processo de tratamento biológico de águas residuais popular, aplicado com sucesso em vários de grande escala estações de tratamento de águas residuais 1. Em contraste com o processo convencional de lamas activadas, nas AGS processar os microrganismos formar grânulos, em vez de flocos 2. Estes grânulos têm melhor sedimentabilidade, são capazes de suportar cargas orgânicas mais elevadas e têm maior tolerância à toxicidade de flocos de lamas activadas 3. Ao contrário de biofilmes, AGS é formada espontaneamente, sem o envolvimento de qualquer material de suporte 4. Em AGS, como em biofilmes, microorganismos produzem uma quantidade significativa de substâncias poliméricas extracelulares altamente hidratados (EPS) 5 para formar uma matriz de hidrogel no qual eles são auto-imobilizada 4-6. EPS são uma mistura complexa, que consiste em polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos, (phospho) lipídios, substâncias húmicas e alguns polímeros intercelulares 5,7,8. Estas substâncias poliméricas interagir um com o outro por meio de forças electrostáticas, ligações de hidrogénio, forças iónicas atractivas e / ou as reacções bioquímicas, etc. 5, formando uma estrutura terciária rede densa e compacta. Os polímeros em EPS, que são capazes de formar hidrogéis 4,9 e contribuem para a formação da estrutura da rede terciária são a este respeito considerado como EPS estruturais, um subconjunto do total de EPS. EPS são responsáveis pela estrutura química e propriedades físicas de grânulos 5. Portanto, é crucial para entender a função de cada composto EPS. Várias abordagens são aplicados para extrair EPS 10-15. No entanto, devido à sua extrema complexidade, que é quase impossível para extrair todos os componentes EPS por um método único. Até à data, não existe um &quot;one size fits all&quot; método de extracção EPS. A escolha do método de extracção influencia não só a quantidade total, mas também a composição dos polímeros recuperados 13,16 - 20. Dependendo do tipo de lamas e o RPE de interesse métodos diferentes são necessários. Extraindo polímeros formadores de gel, caracterizar as suas propriedades e investigar as suas interacções com o outro e com EPS não-formadores de gel vai ajudar a revelar o papel de EPS na formação de lodo aeróbico granular. Além disso, os polímeros formadores de gel também são biopolímeros útil em aplicações industriais. Uma aplicação possível já foi demonstrada por utilização de polímeros formadores de gel de AGS como um material de revestimento para aumentar a resistência à água do papel 21. Portanto, são necessários métodos de extracção, específicos para EPS de formação de gel. O objetivo deste estudo é desenvolver uma metodologia para extrair EPS de formação de gel da AGS. Seis métodos de extração 10-15,22, que são frequentemente utilizados na literatura, foram selecionados para extrair EPS da AGS. O montante total e da propriedade de formação de gel das EPS extraídos foram comparados para cada metodologia.

<table><tbody><tr><td>Balão defletor de 250 ml</td><td>Kimble</td><td>25630-250</td><td></td></tr><tr><td>Copo de vidro de 1.000 ml</td><td>VWR</td><td>213-1128</td><td></td></tr><tr><td>RCT básico, agitador magnético com termómetro</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td></td></tr><tr><td>carbonato de sódio decahidratado</td><td>Merck KGaA</td><td>1063911000</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrifugação de 50 ml</td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1 S-R, centrífuga</td><td>Heraeus/Thermo</td> <td>Scientific-ácido</td><td></td></tr> <tr><td>clorídrico, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1L-GL-D</td><td></td></tr><tr><td>250 ml copo de vidro</td><td>VWR</td><td>213-1124</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Merck KGaA</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipeta Pasteur</td><td>Copan</td><td>201C</td><td></td></tr></tbody></table>

extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de aerobic granular sludge

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Com o objetivo de avaliar e desenvolver metodologias para a extração de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) gelificantes, o EPS de lodo granular aeróbio (AGS) foi extraído utilizando seis métodos diferentes (centrifugação, sonicação, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), formamida com hidróxido de sódio (NaOH), formaldeído com NaOH e carbonato de sódio (Na2CO3) com calor e mistura constante). O AGS foi coletado de um reator piloto de tratamento de águas residuais. A propriedade de formação de gel iônico do EPS extraído dos seis diferentes métodos de extração foi testada com íons de cálcio (Ca2+). Dos seis métodos de extração utilizados, apenas a extração de Na2CO3 foi capaz de solubilizar a matriz hidrogel do AGS. Os polímeros extracelulares (ALE) semelhantes a alginato recuperados com este método formaram grânulos de gel iônicos com Ca2+. Os grânulos de Ca2+-ALE foram estáveis em EDTA, formamida com NaOH e formaldeído com NaOH, indicando que os ALE são uma parte dos polímeros estruturais em EPS. Recomenda-se o uso de um método de extração que combine tratamento físico e químico para solubilizar AGS e extrair EPS estrutural.

extração de EPS A aparência dos grânulos após a aplicação de processos de extracção diferentes EPS é mostrado na Figura 1. A forma e estrutura de gel de grânulos estavam intactos após a centrifugação (Figura 1a) e de extracção de EDTA (Figura 1C). Os grânulos foram divididos em fragmentos de diferentes tamanhos por sonicação. A turbidez na fase líquida pode ser devido a suspensão de fragmentos pequenos (Figura 1B) como a turbidez altamente diminuída após a centrifugação. Formamida e formaldeído por si só não teve nenhum impacto sobre como alterar a forma do grânulo e a sua estrutura de gel (dados não mostrados). Após a adição de NaOH, a fase líquida virou amarelado. Algum material macio foi isolada a partir da superfície dos grânulos e formou uma camada na parte superior dos grânulos constante (Figura 1d e 1e). Ainda, a forma dogrânulos não foi alterada. A adição de NaOH aparentemente melhorada EPS solubilização, mas não pode danificar a estrutura de matriz de gel. Em comparação, grânulos desapareceu completamente após Na 2 CO 3 de extracção (Figura 1F). Em vez de uma mistura de partículas gelatinoso líquidos e pequenas como SOL-se formaram, mostrando a matriz de gel de grânulos foi efectivamente solubilizados. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig1.jpg" /> Figura 1. aeróbicas lamas granulares EPS extracções. Para uma melhor visualização do impacto de cada método de extracção sobre os grânulos, os experimentos foram realizados em 25 ml de frascos de vidro. Após o procedimento de extracção, os extractos foram mantidas durante 1 hora à temperatura ambiente para permitir que a matéria suspensa para resolver. (A) extracção de centrifugação, (b) extracção de ultra-sons, (c) extracção de EDTA, (d) formamida - NaOH adicionalction, (e) Formaldeído - Extração de NaOH, (f) Alta temperatura -. Na 2 CO 3 a extração <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54534/54534fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Rendimento de EPS com respeito à fracção VS para cada método é ilustrado na Figura 2. O rendimento é apresentado em mg por g de EPS VS VS inicial do grânulo. A quantidade de formaldeído por EPS obtidos + NaOH, formamida + NaOH e Na 2 CO 3 + calor + mistura foi maior do que a de centrifugação, sonicação e extracção de EDTA. Resultados semelhantes para estas técnicas de extração também foram mostrados em estudos anteriores 11 - 13,15, indicando que as condições alcalinas melhorar EPS solubilidade 26,27. A quantidade de EPS recuperado por Na 2 CO 3<html> era a mais elevada, mais do que 20 vezes da obtida apenas por centrifugação. Além disso, o rendimento total do EPS Na 2 CO 3 a extracção pode ser melhorada por múltiplas extracções. Uma segunda extracção usando o sedimento descartado no passo 1.6.8 (secção protocolo) da primeira extracção aumentou o rendimento total de 28%, a extracção de um quádruplo mesmo aumentado o rendimento total de 46%. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig2.jpg" /> Figura 2. Os resultados de todos os métodos de extração com relação ao rendimento VS e teor de cinzas. Para cada extracção, a primeira barra representa o rendimento VS em mg VS EPS por g inicial VS grânulo. A segunda barra representa o percentual de peso de cinzas nas TS extraídos. As barras de erro mostram o desvio padrão de três extracções realizadas para cada técnica de extracção.&quot;_blank&quot;&gt; Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Alginato-como polímero extracelular (ALE) extracção Depois de o pH do EPS extraídos pela extracção de Na 2 CO 3 foi ajustado para 2,2, 63% do VS total foi precipitado. O precipitado é ALE 25 ácida. A fracção residual foi provavelmente EPS que pode ser solubilizado sob condições de extracção, mas não pode formar-se um precipitado a um pH de 2,2. Teste de formação hidrogel Ionic grânulos aeróbicas têm sido descritos como sendo semelhante a um hidrogel. O processo de granulação foi considerada como um fenómeno de formação de gel com glicósidos como o agente de gelificação 4,9,25,28. Normalmente, Ca2 + é um dos catiões mais comuns nas águas residuais. Além disso, ela facilmente se liga com polissacáridos acídicos (por exemplo,alginatos e ácido poli-galacturónico), presumivelmente como um contra-ião para mediar a gelificação 29. Assim, resultando em um hidrogel ionicamente reticulado. Observou-se que a adição de iões de Ca2 + pode acelerar lodo aeróbico granulação 30. Portanto, Ca2 + do EPS (hidrogel iônica) poderia desempenhar um papel importante na construção da estrutura de matriz de gel no lodo granular aeróbico. A este respeito, se os EPS extraídos forma um hidrogel iónica com iões Ca2 + poderia ser utilizada como um teste para verificar se o EPS extraída é um polímero estrutural contribuindo para a formação da matriz de gel em forma granular lamas 9 aeróbia. Nesta pesquisa, para os EPS extraídos de AGS (Figura 3a) por vários métodos, apenas os EPS extraídos por Na 2 CO 3 realizada a forma de uma gotícula em 2,5% (w / v) de solução de CaCl 2 e formada pérolas de hidrogel iónicos estáveis .Além disso, a ALE de sódio obtido a partir deste EPS por etapas adicionais (extração de polímero ALE, Figura 3B) exibiu a mesma propriedade também. A cor e a morfologia das contas de gel de Ca 2+ -ALE (Figura 3C) são semelhantes aos das lamas granulares aeróbia (Figura 3a). Aparentemente, o EPS extraídos pelo método de Na 2 CO 3 contribui para a formação da matriz de gel em lamas granulares aeróbia. ALE, que é um componente principal do presente EPS são polímeros estruturais, capazes de formar um hidrogel iónico. Teste de estabilidade do hidrogel iónico Foi observado que durante a extracção EPS, grânulos aeróbias mantido a sua forma esférica em EDTA, formaldeído + NaOH e formamida + NaOH (Figura 1). A fim de entender se os polímeros extraídos estruturais desempenham um papel na estabilidade dos grânulos, os grânulos de Ca 2+ foram -ALEtratada exactamente da mesma maneira como grânulos aeróbias durante a extracção. Curiosamente, Ca2 + apresentada grânulos -ALE as estabilidades semelhantes como a de AGS (Figura 3D - 3-F), isto é, Ca 2+ -ALE esferas foram extremamente estáveis em EDTA. Havia pouca quantidade de ALE isolada a partir da superfície de grânulos de Ca 2+ (-ALE pequena flocos acastanhados na Figura 3e e 3f), quando os grânulos de Ca 2+ -ALE tinha sido embebido em formaldeído + NaOH e formamida + NaOH durante três horas , respectivamente. Esta semelhança em termos de estabilidade entre o Ca 2+ -ALE grânulos e grânulos aeróbicas indica que uma ALE são parte dos polímeros estruturais importantes que formam a matriz de gel de AGS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig3.jpg" /> Figura 3. grânulos aeróbicos e ALE extraído. (A) grânulos no pr água desmineralizadaextração ior. (B) Ácido ALE (extraída de acordo com os parágrafos 1.6 e 2) após centrifugação a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. Os resultados do teste de estabilidade do hidrogel iónico. (C) de Ca 2+ -ALE-grânulos armazenadas em água desmineralizada durante 4 horas a 4 ° C. (D) de Ca2 + -ALE-grânulos armazenados em 2% de EDTA, durante 3 horas a 4 ° C. (E) de Ca 2+ -ALE-grânulos armazenados em formamida + NaOH durante 4 horas a 4 ° C. (F) Ca 2+ -ALE-grânulos armazenados em formol + NaOH durante 4 horas a 4 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54534/54534fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O protocolo prevê uma metodologia para solubilizar lodo granular aeróbica, a fim de extrair polímeros extracelulares de alginato-like (ALE).

Extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de Aerobic Granular Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

O objetivo geral do seguinte experimento é demonstrar uma metodologia de extração para obter substâncias poliméricas extracelulares estruturais, ou EPS, a partir de bioespumas, especificamente do lodo granular aeróbio. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do lodo granular, tais como compreender o processo de granulação e analisar a composição do EPS.A principal vantagem desta técnica é que a presença de polímeros formadores de gel na EPS pode ser testada em pouco tempo. Centrifugue o lodo granular a 4.000 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos e decante o sobrenadante. Colete os grânulos no pellet para a extração.Pré-aqueça 150 mililitros de água da torneira em um béquer de vidro de 1.000 mililitros sobre um agitador magnético até 80 graus Celsius. Transfira três gramas de grânulos para um frasco erlenmeyer de 250 mililitros com placas defletoras e complete o frasco até 50 mililitros com água desmineralizada. Adicione 0,67 gramas de carbonato de sódio deca-hidratado ao frasco para obter uma concentração de carbonato de sódio de 0,5% peso por volume.Coloque o frasco contendo a mistura no banho-maria. Cubra o frasco e o béquer separadamente com papel alumínio, para evitar evaporação. Agite a mistura por 35 minutos a 400 RPM e 80 graus Celsius.Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue o tubo contendo a mistura a 4.000 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Colete o sobrenadante e descarte o pellet.O passo de diálise é opcional para obter EPS estrutural a partir de lodo granular aeróbio. No entanto, apresenta várias vantagens descritas no protocolo. Pipete o sobrenadante para dentro de uma bolsa de diálise, com corte de peso molecular de 3.500 daltons, e realize a diálise durante 24 horas contra 1000 ml de água ultrapura.Altere a água da diálise após 12 horas para potencializar o efeito da diálise. Transfira o extrato dialisado para um béquer de vidro de 250 ml e agite lentamente a extração a 100 rpm e temperatura ambiente. Monitore constantemente as alterações de pH com um eletrodo de pH, adicionando ácido clorídrico 1 molar até um pH final de 2,2 ± 0,5 para obter a ale na forma ácida.Após ajustar o pH para 2,2, transfira o extrato para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugue a 4000 ×g e 4 °C por vinte minutos. Descarte o sobrenadante e colete o pellet com aspecto gelatinoso. O pellet com aspecto gelatinoso é o ácido na forma ácida.Para obter a forma de sódio do ale, adicione lentamente hidróxido de sódio 0,5 molar ao gel, misturando o gel lentamente com um bastão de vidro manualmente até que o pH 8,5 seja atingido. Usando uma pipeta de Pasteur, goteje lentamente o extrato de ale de sódio em uma solução de cloreto de cálcio. Se o EPS extraído tiver propriedades formadoras de gel hidrogel iônico, serão formadas microesferas em forma de gota.Alternativamente, se o EPS extraído não apresentar propriedades de formação de gel hidrogel iônico, o extrato se dispersará na solução de cloreto de cálcio. Mantenha as microesferas de hidrogel e a solução de cloreto de cálcio por 30 minutos. Utilize uma colher para retirar as microesferas de hidrogel da solução de cloreto de cálcio e transfira-as para uma solução de EDTA.Armazene as microesferas de hidrogel em 10 ml de solução de EDTA por três horas a quatro graus Celsius. Este teste demonstra um exemplo dos testes de estabilidade descritos no protocolo. Observe se há desintegração visível das microesferas durante este armazenamento, para avaliar se elas suportam essas condições.Se a extração foi bem-sucedida, o lodo granular aeróbio será solubilizado após a etapa de extração alcalina, e um pellet será obtido após a acidificação e a centrifugação dos EPS extraídos. Se os EPS extraídos forem EPS estruturais e tiverem a capacidade de formar hidrogéis com íons cálcio, microesferas em gel serão formadas ao gotejar os EPS extraídos na solução de cálcio. Se os EPS extraídos não tiverem essa capacidade de formação de gel, a solução de EPS se dispersará na solução de cálcio.Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de realizar a extração de EPS estrutural do lodo granular aeróbio. Além disso, deverá ser capaz de testar a capacidade de formação de gel dos EPS obtidos com íons cálcio. Optamos por mostrar esta metodologia de extração para ilustrar o impacto da técnica de extração nos EPS obtidos a partir de lodo granular aeróbio.Além disso, queríamos mostrar que nenhuma técnica de extração de EPS é universalmente aplicável.

extraction-structural-extracellular-polymeric-substances-from-aerobic

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Ambiente

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Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

Para obter informações básicas sobre a sorção e reciclagem de ouro de sistemas aquosos foi investigada a interação de nanopartículas de Au(III) e Au(0) em proteínas da camada S. A sorção de polímeros proteicos foi investigada por ICP-MS e a de monocamadas proteicas por QCM-D. O AFM subsequente permite a imagem latente das nanoestruturas.

Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, o ICP-MS e AFM como Ferramentas para Estudos biomolécula metal-

O objetivo do presente protocolo é a produção de fibras da matriz extracelular toda alvejado para reparação da ferida que são apropriados para avaliação pré-clínicos como parte de um implante de andaime regenerativa. Estas fibras são produzidas pela cultura de fibroblastos nas membranas de fibra oca e extraídas por dissolução das membranas.

Produção de fibras da matriz extracelular através de cultura de células de membrana de fibra oca Sacrificial

Aqui, os protocolos para o isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e isolamento de seus exoproteomes são descritos. Ambos os procedimentos incorporam etapas-chave para obter polímeros ou proteínas com graus de alta pureza que podem ser usados para posterior análise ou aplicações. Eles também podem ser facilmente adaptados de acordo com as necessidades específicas do usuário.

Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

Um protocolo é descrito para a preparação de um ecossistema modelo simples que recria o contragradiente metano-oxigênio encontrado no habitat natural de bactérias oxidantes aeróbicas de metano, permitindo o estudo de sua fisiologia em um contexto espacialmente resolvido. Modificações em ensaios bioquímicos comuns para uso com o ecossistema modelo baseado em agarose também são descritas.

Ecossistema modelo baseado em agarose para cultivo de metanotróficos em um gradiente de contador de metano-oxigênio

Este protocolo apresenta um método escalável para converter resíduos alimentares em bioplásticos biodegradáveis de polihidroxialcanoato (PHA). Ele utiliza digestão anaeróbica parada para pré-tratamento de resíduos alimentares, fermentação microbiana halofílica para biossíntese de PHA e um processo downstream livre de produtos químicos para recuperação de PHA.

Abordagem escalável passo a passo da produção sustentável de bioplástico a partir de resíduos alimentares

Aprenda a extrair substâncias poliméricas extracelulares estruturais de lodo granular aeróbio usando extração alcalina e diálise. Este método permite testar rapidamente as propriedades de formação de hidrogel dos polímeros extraídos.

Extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de Aerobic Granular Sludge

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