A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado

O objetivo geral deste método é quantificar de forma rápida e acessível vários biomarcadores no líquido cefalorraquidiano, ou LCR, para avaliar seu uso para o diagnóstico e monitoramento do tratamento. Este é um novo ensaio que nos permite medir biomarcadores que antes não eram possíveis de medir. E achamos que isso pode ser usado para fins de diagnóstico e também para diferenciar entre diferentes doenças neurodegenerativas e, potencialmente, também fornecer informações prognósticas.

A principal vantagem dessa técnica é que ela foi projetada para ser rápida, simples na preparação de amostras, altamente específica e econômica para tradução para o laboratório clínico. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico, pois esse teste de alto rendimento pode ser usado em futuros ensaios clínicos para novas terapias em neurodegeneração. Essa metodologia também pode ser aplicada a outras doenças e tecidos, como urina para distúrbios renais, plasma para cardiomiopatia e células para pluripotência.

Para iniciar este procedimento, ressuspenda os peptídeos sintéticos desejados a uma concentração de estoque de um miligrama por mililitro, de acordo com as instruções do fabricante. Prepare uma em cada 10 diluições do peptídeo a partir da concentração de estoque e agrupe 1.000 picomoles de cada peptídeo em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação. Seque a amostra de peptídeo agrupada em um concentrador SpeedVac.

Quando terminar, armazene a amostra a menos 20 graus Celsius. Em seguida, alíquota de 100 microlitros de LCR em tubos de microcentrífuga de baixa ligação. Liofilizar as amostras de LCR.

Ressuspender uma alíquota da amostra de peptídeo agrupada no tampão de digestão para obter concentrações de 10 e um picomole por microlitro. Agora, coloque a amostra de peptídeo agrupada nas alíquotas liofilizadas de 100 microlitros de LCR, em concentrações de zero, um, dois, cinco, 10 e 15 picomolares. Em seguida, adicione 20 nanogramas de proteína intacta não relacionada para atuar como um padrão interno e controlar a eficiência da digestão da tripsina.

Adicionar tampão de digestão às alíquotas do LCR até obter um volume final de 20 microlitros e vortex das amostras. Em seguida, digerir as amostras de acordo com o protocolo padrão, adicionando 1,5 microlitros de ditiotreitol e agitando à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, adicione três microlitros de iodoacetamida às amostras e agite em temperatura ambiente por 45 minutos no escuro.

Em seguida, adicione 165 microlitros de água bidestilada Adicione 10 microlitros de uma solução de tripsina modificada de grau sequencial de 0,1 micrograma por microlitro, ressuspensa em tampão de bicarbonato de amônio de 50 milimolares às amostras. Incube as amostras em banho-maria a 37 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, pare a digestão congelando as amostras. Depois de descongelar o LCR digerido no gelo, centrifugue a 16.000 vezes g por 10 minutos. Quando terminar, transfira 60 microlitros de cada digestão para um inserto de vidro de 300 microlitros.

Usando um sistema LC-MS, equipado com uma coluna C18 UPLC, injete a concentração mais alta do ponto da curva padrão usando um gradiente linear de 10 minutos, de um a 40% de acetonitrila. Quando a execução estiver concluída, abra o cromatograma resultante no software e observe o tempo de retenção e as duas principais transições mais intensas por peptídeo. Com base nessas informações, atualize um método de monitoramento de reação múltipla ou MRM criado anteriormente com canais cronometrados para medir peptídeos.

Para manter a sensibilidade, mantenha cada canal com pontos por pico maiores que oito e tempo de permanência maior que 0,01 segundos por pelo menos uma transição para cada peptídeo. Inclua atrasos de solvente no método MRM selecionando atrasos de solvente em eventos de método no arquivo de método MS. É fundamental corresponder corretamente o pico correto em um método de HPLC curto.

Isso pode ser feito usando os peptídeos enriquecidos na matriz que são usados para uma curva padrão e observando as múltiplas transições durante o desenvolvimento do método. Por fim, revise manualmente a anotação de dados para garantir a precisão. Analise cada peptídeo e proporção para um padrão interno marcado com isótopo estável apropriado.

Um cromatograma dos marcadores peptídicos significativos do ensaio de LCR de alto rendimento é mostrado aqui. Os dados fornecem proporções padronizadas para o padrão interno marcado com isótopos estáveis relevante, que pode ser usado para determinar as concentrações absolutas de LCR e analisado estatisticamente para alterações em amostras clínicas. A quantificação dos 74 peptídeos incluídos neste ensaio de LCR revelou que 25 foram alterados significativamente no LCR de pacientes com demência, e os resultados dos marcadores de demência pró-orexina e proteína semelhante à quitinase-3 YKL são exibidos aqui.

A ApoE4 é um fator de risco conhecido para a doença de Alzheimer, e a detecção de isoformas de ApoE é baseada na detecção dos peptídeos correspondentes para as alterações de aminoácidos para as isoformas E2 e E4. O padrão de pico esperado para cada combinação de isoforma é mostrado aqui. Uma vez que o método é configurado, o ensaio pode ser feito em um dia se for realizado corretamente. Após o desenvolvimento deste método, foi possível medir um novo conjunto de biomarcadores com alta sensibilidade e especificidade analítica, o que possibilitará aos pesquisadores avaliar doenças neurodegenerativas de uma nova maneira.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e otimizar um ensaio MRM para sensibilidade e especificidade. Não se esqueça de que trabalhar com DTE, cupins, ácido fórmico e tecido humano pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de luvas, devem ser aplicadas durante este procedimento.