Rotulagem de anticorpos com corantes fluorescentes utilizando proteína Magnetic A e esferas de proteína G

O objetivo geral deste método é rotular anticorpos com corantes fluorescentes a partir de amostras purificadas ou diretamente do meio celular, utilizando esferas magnéticas de proteína A ou G. Este método pode ser usado para otimizar a química de marcação, mesmo de pequenas quantidades de anticorpos presentes no meio celular, resultando em melhores aplicações downstream dos anticorpos.

As principais vantagens desta técnica são que os anticorpos não requerem purificação, pode-se utilizar química de amina ou de tiol, e o método pode ser automatizado ou realizado manualmente. Comece por ressuspender uniformemente as esferas com agitação suave. Em seguida, adicione 50 microlitros de esferas a um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.

Em seguida, coloque o tubo em um suporte magnético. Após 10 segundos, substitua cuidadosamente o tampão de armazenamento por 250 microlitros de tampão de ligação de anticorpo e misture bem as esferas. Após mais 10 segundos, substitua cuidadosamente o tampão de ligação por um mililitro do anticorpo de interesse.

E misture a amostra por 60 minutos em temperatura ambiente. Ao final da incubação, coloque os tubos no ímã e remova o sobrenadante quando as microesferas tiverem migrado para as laterais do tubo. Em seguida, lave a mistura de microesferas e anticorpo com duas lavagens de 10 segundos cada, utilizando 250 microlitros de tampão de lavagem para ligação de anticorpos por lavagem.

Para marcar os anticorpos utilizando química de amina, após a segunda lavagem, substitua o tampão de lavagem por 100 microlitros de tampão de conjugação de amina e adicione 2,5 microlitros de corante reativo a amina recém-preparado por 100 microgramas de anticorpo. Vortexe a amostra durante 60 minutos à temperatura ambiente para manter as microesferas em suspensão durante a marcação. Em seguida, retorne o tubo ao ímã por 10 segundos e remova o sobrenadante.

Lave as microesferas duas vezes com o tampão de lavagem para ligação de anticorpos, conforme acabou de ser demonstrado. Em seguida, substitua o tampão de lavagem por 50 microlitros de tampão de eluição e misture as microesferas por cinco minutos. Retorne o tubo ao ímã por 10 segundos e transfira o anticorpo eluído para um novo tubo de microcentrífuga contendo cinco microlitros de tampão de neutralização.

Elua o anticorpo mais uma vez, conforme acabou de ser demonstrado, coletando as amostras eluídas. Em seguida, meça a absorbância do conjugado anticorpo-corante a 280 nanômetros e no lambda máximo do corante. Para marcar os anticorpos utilizando química de tióis, após a segunda lavagem, substitua o tampão de lavagem por 250 microlitros de tampão de conjugação de tióis e misture as esferas com pipetagem suave.

Após 10 segundos, lave as microesferas duas vezes com o tampão de lavagem para ligação de anticorpos. Em seguida, substitua o tampão de lavagem por 100 microlitros de tampão de conjugação de tiol e adicione DTT até uma concentração final de 2,5 milimolar. Incube as microesferas por mais 60 minutos sob agitação.

Em seguida, retorne as microesferas ao ímã por 10 segundos e descarte o tampão. A seguir, adicione 250 microlitros de tampão de conjugação com tiol às microesferas com mistura suave. Após 10 segundos, lave as microesferas duas vezes com tampão de lavagem para ligação de anticorpos, substituindo a segunda lavagem por 100 microlitros de tampão de conjugação com tiol fresco.

Agora, adicione 2,5 µL de corante reativo a tióis recém-preparado por 100 µg de anticorpo e misture as microesferas por 60 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, coloque o tubo no ímã por 10 segundos e substitua o sobrenadante por 250 µL de tampão fresco de conjugação com tióis, com mistura suave.

Após 10 segundos, lave as microesferas duas vezes. Em seguida, substitua o tampão de lavagem por 50 microlitros de tampão de eluição e elua o anticorpo conjugado duas vezes, conforme acabou de ser demonstrado. Depois, meça a absorbância do conjugado anticorpo-corante a 280 nanômetros e no lambda máximo para o corante.

A forte afinidade entre os anticorpos e a Proteína G, a afinidade robusta do ímã pelas microesferas e a otimização do método antes da purificação com microesferas resultam conjuntamente em uma perda nominal de anticorpo durante a reação de marcação, conforme evidenciado pela recuperação eficiente de três isotipos diferentes de anticorpos de camundongo após a dilabelação fluorescente em comparação com a purificação simples. Essa recuperação também é evidente em géis de Coomassie, onde as baixas propriedades de ligação não específica das microesferas magnéticas de Proteína G resultam na presença de cadeias pesadas e leves altamente purificadas e dilabeladas com fluorescência. A marcação em microesferas com microesferas magnéticas de Proteína A também é compatível com múltiplos corantes fluorescentes, resultando em alta recuperação e boas relações de corante por anticorpo.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em duas a três horas, se realizada corretamente. Permite que múltiplas amostras sejam manipuladas manualmente ou em uma plataforma automatizada para maior produtividade. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as microesferas magnéticas sempre em suspensão.

Escolha o volume apropriado de microesferas magnéticas para a amostra. E otimize a quantidade de corante fluorescente para o anticorpo de interesse. Após este procedimento, os anticorpos marcados devem ser testados para determinar a funcionalidade utilizando ensaios biológicos relevantes, como ELISA, citometria de fluxo ou ensaios baseados em células.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como marcar anticorpos purificados e não purificados com marcadores fluorescentes ou outras moléculas pequenas, como biotina ou fármacos citotóxicos, utilizando esferas magnéticas de Proteína A ou G.