Name: Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a detectar E. coli com um teste de tornassol modificado usando DNAzima específica e urease. Este método colorimétrico rápido permite identificação visual da bactéria em poucos minutos.

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O financiamento para este projeto de pesquisa foi fornecido pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) por meio de uma Bolsa de Descoberta para YL.

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<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
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<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
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<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
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<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A tradução da acção da actividade de clivagem de ARN de uma ADNzima bactéria responde a um teste decisivo é tornada possível através da utilização de urease e separação magnética, como ilustrado pela Figura 1. Embora a manifestação do teste decisivo modificado para detecção de bactérias é feito com uma E. coli dependente de RNA-clivagem ADNzima, 5,19,20 o projeto pode ser estendido geralmente para qualquer ADNzima de clivagem de RNA. Dada a grande disponibilidade de DNAzymes de cliva...

Os patógenos bacterianos são uma das principais causas de morbidade e mortalidade global. Surtos de infecções hospitalares, patógenos transmitidos por alimentos e contaminantes bacterianos no meio ambiente representam ameaças sérias e contínuas à saúde e segurança públicas. Para prevenir esses surtos, são necessárias ferramentas eficazes que permitam a detecção de patógenos em tempo hábil em uma variedade de configurações. Testes simples, mas ainda eficazes, portáteis e econômicos, são muito cobiçados, especialmente em regiões suscetíveis a surtos, mas que não podem pagar por instalações de teste caras. 1-3 Embora exista uma infinidade de métodos para detectar bactérias, muitos deles não são adequados como ferramentas de triagem ou teste no local porque exigem longos tempos de teste, instrumentos caros e procedimentos de teste complicados. 
Os testes colorimétricos são particularmente atraentes para aplicações de campo ou de ponto de atendimento, pois as mudanças de cor podem ser facilmente detectadas a olho nu. O teste decisivo para pH é simples, rápido e eficaz. Embora seja uma tecnologia muito antiga, ainda hoje é amplamente utilizada devido à sua simplicidade e eficácia. Surpreendentemente, este teste simples nunca havia sido modificado para alcançar a detecção de outros analitos antes de desenvolvermos recentemente uma abordagem de modificação deste teste para testes de E. coli. 4
O teste de tornassol expandido para E. coli emprega três componentes adicionais: um DNAzyme de clivagem de RNA ativado por E. coli (EC1), 5 urease e esferas magnéticas. DNAzymes referem-se a moléculas sintéticas de DNA de fita simples com atividade catalítica. 6 Eles podem ser isolados de pools de DNA de sequência aleatória usando seleção in vitro. 7,8 Eles são altamente estáveis e podem ser produzidos de forma econômica usando síntese automatizada de DNA de alta eficiência. 9 Por essas razões, as DNAzimas, particularmente as DNAzimas de clivagem de RNA, foram amplamente examinadas para aplicações de biossensores. 6,10,11 Sensores DNAzyme de clivagem de RNA foram desenvolvidos para detectar íons metálicos,12-16 pequenas moléculas,17,18 patógenos bacterianos5,19-21 e células cancerígenas. 22 Dada a grande disponibilidade de DNAzimas de clivagem de RNA induzidas por alvo, qualquer ensaio que utilize uma DNAzima pode ser potencialmente expandido para detectar uma gama diversificada de analitos.
A urease é escolhida por sua capacidade de hidrolisar a ureia em amônia,23,24 resultando em um aumento de pH. A urease também é altamente eficiente, estável e passível de conjugação com outras biomoléculas. Portanto, postulamos que um conjugado de um DNAzyme de clivagem de RNA com urease permitiria o uso do teste decisivo para a detecção de outros alvos. 5
A ação da DNAzima de clivagem de RNA é retransmitida para o aumento do pH mediado pela urease através do uso de esferas magnéticas que são imobilizadas com o conjugado DNAzyme-urease. Como a atividade do DNAzyme sob investigação é estritamente dependente de E. coli, a presença dessa bactéria na solução de teste resultará na liberação de urease dos grânulos magnéticos para a solução, que é então retirada e usada para hidrolisar a ureia em uma solução repórter que contém um corante sensível ao pH. O resultado final deste procedimento é uma mudança de cor que pode ser convenientemente relatada pelo corante ou papel de pH.

<table><tbody><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acrilamida/bisacrilamida a 40% (29:1)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop Canadá inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>xilenecyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% de dodecil sulfato de sódio</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (II) hexahidratado</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina Trifospahte (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio trihidratado (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Álcoois Comerciais</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilenoetilenodiamina (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% de persulfato de amônio (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0,04% de vermelho de fenol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 tampão de reação de polinucleotídeo quinase</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 tampão de reação de DNA ligase T4</td> Bio <td>Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase (5 U/&#956; l)</td> <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Caldo</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleotídeo quinase (10 U/&#956; l)</td> <td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Placas de vidro</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>espaçadores de 0,75 mm de espessura</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>pente de 12 poços</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada UV</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro (NanoVue)</td> <td>GE Healthcare</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de metal</td><td>CBS scientific</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese em gel</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO filtros centrífugos</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Rack de Separação Magnética</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa (0.22 &#956; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de cultura de 14 ml</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Limpador ultrassónico</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Há uma demanda crescente por métodos simples, mas ainda eficazes, que possam ser usados para detectar patógenos específicos para aplicações no local de atendimento ou em campo. Esses métodos precisam ser fáceis de usar e produzir resultados confiáveis que possam ser facilmente interpretados por especialistas e não profissionais. O teste decisivo para pH é simples, rápido e eficaz, pois relata o pH de uma amostra de teste por meio de uma simples mudança de cor. Desenvolvemos uma abordagem para aproveitar o teste decisivo para detecção bacteriana. O método explora uma DNAzyme de clivagem de RNA específica da bactéria para realizar duas funções: reconhecer uma bactéria de interesse e fornecer um mecanismo para controlar a atividade da urease. Através do uso de esferas magnéticas imobilizadas com um conjugado DNAzyme-urease, a presença de bactérias em uma amostra de teste é transmitida para a liberação da urease das esferas para a solução. A urease liberada é transferida para uma solução de teste para hidrolisar a ureia em amônia, resultando em um aumento de pH que pode ser visualizado usando o teste decisivo clássico.

O princípio do teste decisivo bacteriana é explicado na Figura 1 O ensaio utiliza três materiais principais:. Uma ADNzima de clivagem de ARN que é activado por uma bactéria específica, urease e esferas magnéticas. A ADNzima é utilizado como o elemento de reconhecimento molecular para alcançar a detecção altamente específica de uma bactéria de interesse. A urease e esferas magnéticas são usados ​​para alcançar transdução de sinal da actividade ARN-clivagem da ADNzima. Ist...

Descrevemos um protocolo para detecção colorimétrica de E. coli usando um teste decisivo modificado que aproveita uma DNAzima, urease e esferas magnéticas de clivagem de RNA.

Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

O objetivo geral deste experimento é demonstrar um teste de litmus modificado e simples para detecção bacteriana. Este método descreve como uma enzima de DNA clivadora de RNA ativada por E.coli pode ser acoplada a uma plataforma de transdução de sinal baseada em urease para gerar uma mudança de cor em resposta ao E.coli. As duas principais vantagens desta técnica são a simplicidade do teste e sua aplicabilidade a outras enzimas de DNA clivadoras de RNA responsivas a analitos.Quem demonstrará o procedimento serão Seperh Manchehry e Dingran Chang, alunos de pós-graduação do laboratório da Dra. Yingfu Li na Universidade McMaster. Após preparar os reagentes e os tampões de acordo com o protocolo descrito, prepare uma solução estoque de succinimidil 4-cicloexano-1-carboxilato, ou SMCC, dissolvendo um miligrama de SMCC em 676 microlitros de DMSO. Agite em vórtex e coloque no gelo até o uso.Dissolva um miligrama de urease em um mililitro de PBS 1x e coloque também no gelo até o uso. Para sintetizar o DNA de urease, ou UrDNA, adicione 10 microlitros de LD1 100 micromolar a um tubo microcêntrifuga de 2,5 mililitros. Em seguida, adicione 140 microlitros de água bidestilada e 40 microlitros de PBS 10x e vortex.Em seguida, adicione 80,5 microlitros do estoque de SMCC e 159,5 microlitros de DMSO. Depois, vortexie novamente e use uma centrífuga de bancada para fazer uma breve centrifugação. Incube a reação a 37 graus Celsius em um incubador ou bloco térmico por 60 minutos.Após a incubação, adicione 200 microlitros de PBS 1x, 60 microlitros de acetato de sódio três molar e 1,5 mililitro de etanol frio a 100% ao tubo. Misture por vortexagem e incube a reação a menos 20 graus Celsius por 30 minutos. Centrifugue a solução a 20.000 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos.Em seguida, remova o sobrenatante e seque o pellet sob vácuo. Ao pellet seco, adicione 400 microlitros do estoque de urease e incube à temperatura ambiente por 5 horas. Transfira 200 microlitros do conjugado bruto para uma coluna de filtro centrífugo pré-lavada com corte de peso molecular de 100.000.Centrifugue a coluna a 14.000 × g durante cinco minutos. Transfira os 200 microlitros restantes do conjugado bruto para a coluna e centrifugue a 14.000 × g durante cinco minutos. Em seguida, remova a coluna e coloque-a de cabeça para baixo em um novo tubo de coleta microcêntrifuga de dois mililitros.Centrifugue o tubo e a coluna invertidos a 1.000 × g durante dois minutos. Após remover o tubo de coleta, adicione 30 microlitros de PBS 1x à coluna centrífuga para lavar a membrana e obter recuperação adicional dos conjugados. Inverta a coluna novamente e coloque-a de volta no tubo de coleta.Centrifugue a coluna a 1.000 × g durante dois minutos. Remova e descarte a coluna. Armazene o UrDNA a quatro graus Celsius até o uso.Para montar um DNAzyme clivador de RNA ativado por E.coli, ou EC1, e o UrDNA em microesferas magnéticas, agite bem o estoque de microesferas e transfira 100 microlitros da suspensão de microesferas para um tubo microcêntrifuga de 1,5 mililitro. Em seguida, coloque o tubo em um suporte de gradiente magnético para isolamento das microesferas. Remova o sobrenadante por pipetagem e adicione 150 microlitros de tampão de ligação, ou BB, ao tubo.Retire o tubo do suporte e bata cuidadosamente no tubo para ressuspender os grânulos em uma solução homogênea. Após repetir a lavagem com BB mais duas vezes com os grânulos em suspensão com BB, adicione 10 microlitros de EC1 a 10 micromolar. Misture cuidadosamente batendo no tubo.Incube a solução com agitação suave por 30 minutos. Para evitar a agregação das microesferas, bata levemente no tubo a cada dois ou três minutos. Em seguida, coloque o tubo de microcentrífuga novamente no suporte magnético para isolar as microesferas e remova o sobrenadante por pipetagem.Em seguida, utilize 150 microlitros de BB para lavar as microesferas três vezes. Após a conclusão da lavagem, suspenda as microesferas em um volume total de 150 microlitros de BB. A esta solução, adicione 15 microlitros de UrDNA e aqueça a amostra a 45 graus Celsius por dois minutos, depois resfrie a solução até a temperatura ambiente e incube por duas horas. Coloque o tubo de microcentrífuga novamente no suporte magnético para isolar as microesferas e remova o sobrenadante por pipetagem.Adicione 100 microlitros de tampão de reação, ou RB, em seguida remova o tubo do suporte magnético e re-suspenda cuidadosamente as esferas. Após preparar as células de E. coli de acordo com o protocolo descrito, pré-lave um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro adicionando e vortexando 100 microlitros de RB. Em seguida, descarte o tampão. Adicione 15 microlitros do EC1 montado ao tubo lavado, coloque o tubo no suporte magnético e aspire o sobrenadante.Retire o tubo do suporte, adicione 100 microlitros de RB e re-suspenda cuidadosamente as microesferas magnéticas. Após lavar as microesferas com RB mais duas vezes e remover o RB, adicione 10 microlitros da amostra de E.coli ao tubo e misture suavemente o conteúdo batendo levemente no tubo. Em seguida, incube a reação à temperatura ambiente por uma hora.Após a incubação, adicione 90 microlitros de água bidestilada e coloque o tubo na grade magnética. Após cerca de três minutos de separação magnética, transfira cuidadosamente 85 microlitros do sobrenadante para um tubo microfuga de 0,5 mililitro. É muito importante pipetar a solução com cuidado, sem aspirar nenhuma das microesferas magnéticas.Essas esferas são carregadas com urease e gerarão um sinal falso positivo. Adicione 15 microlitros de vermelho de fenol 0,04% e 100 microlitros da solução de substrato. Em seguida, tire fotografias em intervalos de tempo específicos para registrar a mudança de cor.A cor inicial do teste de tornassol deve ser amarela, refletindo um pH da solução abaixo de 5,5. Se necessário, o pH inicial do teste de tornassol pode ser ajustado com um tampão fraco, como tampão de acetato de sódio um milimolar com pH cinco. Esta figura mostra os resultados do teste bacteriano de tornassol, no qual a DNAzima clivadora de RNA ativada por E.coli EC1 foi utilizada como DNAzima e o vermelho de fenol foi utilizado como indicador de pH.Como mostrado pela ausência de mudança de cor na ausência de E.coli, o EC1 é altamente específico e apresenta atividade mínima contra outras bactérias. A intensidade da mudança de cor depende tanto do número de células de E.coli utilizadas na etapa de ativação do DNAzyme quanto do tempo permitido para a etapa de hidrólise da ureia. Um maior número de células de E.coli resulta em uma mudança de cor mais intensa, e um tempo mais longo para a hidrólise da ureia permite a detecção de um número menor de células.Este gráfico mostra a alteração do pH conforme monitorado usando um medidor de pH portátil. A presença de 10 elevado a sete células de E.coli resultou em um aumento gradual do pH de três unidades em 10 minutos. Em contraste, a ausência de E.coli não causou alterações detectáveis do pH nas mesmas condições.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a urease é muito ativa e que uma lavagem inadequada ou contaminação levará a um falso positivo. Após este procedimento, este método pode ser realizado para testar a presença de E. coli em condições mais relevantes, como no teste da qualidade da água ambiental.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão sobre como aproveitar um simples teste de papel de tornassol para a detecção de E. coli. Não se esqueça de que este teste pode ser usado para detectar E. coli patogênica, que é extremamente perigosa. Você precisa fazer treinamento em biossegurança antes de realizar qualquer teste com bactérias patogênicas.

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