Name: Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a detectar E. coli com um teste de tornassol modificado usando DNAzima específica e urease. Este método colorimétrico rápido permite identificação visual da bactéria em poucos minutos.

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O financiamento para este projeto de pesquisa foi fornecido pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) por meio de uma Bolsa de Descoberta para YL.

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<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
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<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A tradução da acção da actividade de clivagem de ARN de uma ADNzima bactéria responde a um teste decisivo é tornada possível através da utilização de urease e separação magnética, como ilustrado pela Figura 1. Embora a manifestação do teste decisivo modificado para detecção de bactérias é feito com uma E. coli dependente de RNA-clivagem ADNzima, 5,19,20 o projeto pode ser estendido geralmente para qualquer ADNzima de clivagem de RNA. Dada a grande disponibilidade de DNAzymes de cliva...

Os patógenos bacterianos são uma das principais causas de morbidade e mortalidade global. Surtos de infecções hospitalares, patógenos transmitidos por alimentos e contaminantes bacterianos no meio ambiente representam ameaças sérias e contínuas à saúde e segurança públicas. Para prevenir esses surtos, são necessárias ferramentas eficazes que permitam a detecção de patógenos em tempo hábil em uma variedade de configurações. Testes simples, mas ainda eficazes, portáteis e econômicos, são muito cobiçados, especialmente em regiões suscetíveis a surtos, mas que não podem pagar por instalações de teste caras. 1-3 Embora exista uma infinidade de métodos para detectar bactérias, muitos deles não são adequados como ferramentas de triagem ou teste no local porque exigem longos tempos de teste, instrumentos caros e procedimentos de teste complicados. 
Os testes colorimétricos são particularmente atraentes para aplicações de campo ou de ponto de atendimento, pois as mudanças de cor podem ser facilmente detectadas a olho nu. O teste decisivo para pH é simples, rápido e eficaz. Embora seja uma tecnologia muito antiga, ainda hoje é amplamente utilizada devido à sua simplicidade e eficácia. Surpreendentemente, este teste simples nunca havia sido modificado para alcançar a detecção de outros analitos antes de desenvolvermos recentemente uma abordagem de modificação deste teste para testes de E. coli. 4
O teste de tornassol expandido para E. coli emprega três componentes adicionais: um DNAzyme de clivagem de RNA ativado por E. coli (EC1), 5 urease e esferas magnéticas. DNAzymes referem-se a moléculas sintéticas de DNA de fita simples com atividade catalítica. 6 Eles podem ser isolados de pools de DNA de sequência aleatória usando seleção in vitro. 7,8 Eles são altamente estáveis e podem ser produzidos de forma econômica usando síntese automatizada de DNA de alta eficiência. 9 Por essas razões, as DNAzimas, particularmente as DNAzimas de clivagem de RNA, foram amplamente examinadas para aplicações de biossensores. 6,10,11 Sensores DNAzyme de clivagem de RNA foram desenvolvidos para detectar íons metálicos,12-16 pequenas moléculas,17,18 patógenos bacterianos5,19-21 e células cancerígenas. 22 Dada a grande disponibilidade de DNAzimas de clivagem de RNA induzidas por alvo, qualquer ensaio que utilize uma DNAzima pode ser potencialmente expandido para detectar uma gama diversificada de analitos.
A urease é escolhida por sua capacidade de hidrolisar a ureia em amônia,23,24 resultando em um aumento de pH. A urease também é altamente eficiente, estável e passível de conjugação com outras biomoléculas. Portanto, postulamos que um conjugado de um DNAzyme de clivagem de RNA com urease permitiria o uso do teste decisivo para a detecção de outros alvos. 5
A ação da DNAzima de clivagem de RNA é retransmitida para o aumento do pH mediado pela urease através do uso de esferas magnéticas que são imobilizadas com o conjugado DNAzyme-urease. Como a atividade do DNAzyme sob investigação é estritamente dependente de E. coli, a presença dessa bactéria na solução de teste resultará na liberação de urease dos grânulos magnéticos para a solução, que é então retirada e usada para hidrolisar a ureia em uma solução repórter que contém um corante sensível ao pH. O resultado final deste procedimento é uma mudança de cor que pode ser convenientemente relatada pelo corante ou papel de pH.

<table><tbody><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acrilamida/bisacrilamida a 40% (29:1)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop Canadá inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>xilenecyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% de dodecil sulfato de sódio</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (II) hexahidratado</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina Trifospahte (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio trihidratado (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Álcoois Comerciais</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilenoetilenodiamina (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% de persulfato de amônio (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0,04% de vermelho de fenol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 tampão de reação de polinucleotídeo quinase</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 tampão de reação de DNA ligase T4</td> Bio <td>Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase (5 U/&#956; l)</td> <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Caldo</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleotídeo quinase (10 U/&#956; l)</td> <td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Placas de vidro</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>espaçadores de 0,75 mm de espessura</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>pente de 12 poços</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada UV</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro (NanoVue)</td> <td>GE Healthcare</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de metal</td><td>CBS scientific</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese em gel</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO filtros centrífugos</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Rack de Separação Magnética</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa (0.22 &#956; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de cultura de 14 ml</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Limpador ultrassónico</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Há uma demanda crescente por métodos simples, mas ainda eficazes, que possam ser usados para detectar patógenos específicos para aplicações no local de atendimento ou em campo. Esses métodos precisam ser fáceis de usar e produzir resultados confiáveis que possam ser facilmente interpretados por especialistas e não profissionais. O teste decisivo para pH é simples, rápido e eficaz, pois relata o pH de uma amostra de teste por meio de uma simples mudança de cor. Desenvolvemos uma abordagem para aproveitar o teste decisivo para detecção bacteriana. O método explora uma DNAzyme de clivagem de RNA específica da bactéria para realizar duas funções: reconhecer uma bactéria de interesse e fornecer um mecanismo para controlar a atividade da urease. Através do uso de esferas magnéticas imobilizadas com um conjugado DNAzyme-urease, a presença de bactérias em uma amostra de teste é transmitida para a liberação da urease das esferas para a solução. A urease liberada é transferida para uma solução de teste para hidrolisar a ureia em amônia, resultando em um aumento de pH que pode ser visualizado usando o teste decisivo clássico.

O princípio do teste decisivo bacteriana é explicado na Figura 1 O ensaio utiliza três materiais principais:. Uma ADNzima de clivagem de ARN que é activado por uma bactéria específica, urease e esferas magnéticas. A ADNzima é utilizado como o elemento de reconhecimento molecular para alcançar a detecção altamente específica de uma bactéria de interesse. A urease e esferas magnéticas são usados ​​para alcançar transdução de sinal da actividade ARN-clivagem da ADNzima. Ist...

Descrevemos um protocolo para detecção colorimétrica de E. coli usando um teste decisivo modificado que aproveita uma DNAzima, urease e esferas magnéticas de clivagem de RNA.

Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

O objetivo geral deste experimento é demonstrar um teste de litmus modificado e simples para detecção bacteriana. Este método descreve como uma enzima de DNA clivadora de RNA ativada por E.coli pode ser acoplada a uma plataforma de transdução de sinal baseada em urease para gerar uma mudança de cor em resposta ao E.coli. As duas principais vantagens desta técnica são a simplicidade do teste e sua aplicabilidade a outras enzimas de DNA clivadoras de RNA responsivas a analitos.Quem demonstrará o procedimento serão Seperh Manchehry e Dingran Chang, alunos de pós-graduação do laboratório da Dra. Yingfu Li na Universidade McMaster. Após preparar os reagentes e os tampões de acordo com o protocolo descrito, prepare uma solução estoque de succinimidil 4-cicloexano-1-carboxilato, ou SMCC, dissolvendo um miligrama de SMCC em 676 microlitros de DMSO. Agite em vórtex e coloque no gelo até o uso.Dissolva um miligrama de urease em um mililitro de PBS 1x e coloque também no gelo até o uso. Para sintetizar o DNA de urease, ou UrDNA, adicione 10 microlitros de LD1 100 micromolar a um tubo microcêntrifuga de 2,5 mililitros. Em seguida, adicione 140 microlitros de água bidestilada e 40 microlitros d

colorimetric-detection-of-bacteria-using-litmus-test

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método simples para a identificação de patógenos bacterianos prioridade é a utilização de fagos repórter geneticamente modificadas. Estes fagos repórter, que são específicas para sua espécie de hospedeiro particular, são capazes de transdução rapidamente uma resposta de sinal bioluminescentes para células hospedeiras. Relata-se o uso de fagos repórter para a detecção...

&quot;Bioluminescent &#39;Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Descreve-se um método de ensaio de sensor electroquímico para a detecção bacteriana rápida e identificação. O ensaio envolve uma matriz de sensores funcionalizada com as sondas de DNA para o RNA de captura de oligonucleótidos (rRNA) sequências específicas das espécies ribossomal. Sandwich de rRNA alvo de hibridação com a sonda de captura e uma sonda detectora de peroxidase de rábano ligada ao oligonucleótido de DNA produz uma corrente mensurável amperométrica.

Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

Este vídeo descreve um ensaio colorimétrico para medição de lactato em lisados celulares usando a enzima lactato desidrogenase. Esta enzima converte lactato em piruvato, juntamente com a conversão de NAD em NADH que reage com corantes de tetrazólio e dá um produto colorido que pode ser medido espectrofotometricamente para quantificar o lactato.

Ensaio Colorimétrico para Quantificação de Lactato em Amostras de Teste

Este vídeo demonstra um método colorimétrico de detecção de E. coli, envolvendo um biomarcador de E. coli ativando um DNAzyme, levando à clivagem da ligação de RNA e ao desprendimento de um conjugado DNAzyme-urease. Um ensaio colorimétrico subsequente detecta o biomarcador E. coli por meio de alterações de pH induzidas por amônia.

Detecção colorimétrica de um biomarcador bacteriano usando um teste decisivo modificado

Este vídeo demonstra a detecção bacteriana quantitativa multiplexada empregando microesferas de poliestireno magnético carboxilado tingidas em conjuntos distintos. O procedimento engloba a formação de complexos de bactérias, separação magnética e análise baseada em fluxo, permitindo a quantificação precisa e simultânea de várias bactérias no mesmo poço de reação.

Detecção Bacteriana Quantitativa Multiplexada usando Microesferas Magnéticas Marcadas com Corante

Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras.

Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos

Ao contrário do que a observada para eucariotos, há uma escassez de estudos que despolarização detalhes membrana e concentração de íons mudanças nas bactérias, principalmente como seu pequeno tamanho faz com que os métodos convencionais de medição difícil. Aqui, os protocolos de detalhe para monitoramento de tais eventos no patógeno Gram-positivo significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescência.

Acompanhamento da evolução das Membrane Polaridade, integridade de membrana e intracelulares Ion concentrações no<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando corantes fluorescentes

Um protocolo envolvendo concentração integrada, enriquecimento e detecção colorimétrica de ponto final de patógenos transmitidos por alimentos em grandes volumes de água agrícola é apresentado aqui.  A água é filtrada através de Swabs de Moore modificados (MMS), enriquecidos com meios seletivos ou não seletivos, e a detecção é realizada usando dispositivos analíticos baseados em papel (μPAD) embutidos com substratos colorimétricos indicativos bacterianos.

Papel colorimétrico à base de Detecção de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; A partir de grandes volumes de água Agrícola

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar motilidade bacteriana baseado em uma reação de cor. As principais vantagens deste método são que é fácil de avaliar e mais preciso, e não requer equipamentos especializados.

Visualizando a motilidade bacteriana com base em uma reação de cor

Aprenda a detectar E. coli com um teste de tornassol modificado usando DNAzima específica e urease. Este método colorimétrico rápido permite identificação visual da bactéria em poucos minutos.

Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

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