Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

O objetivo geral deste experimento é demonstrar um teste de litmus modificado e simples para detecção bacteriana. Este método descreve como uma enzima de DNA clivadora de RNA ativada por E.coli pode ser acoplada a uma plataforma de transdução de sinal baseada em urease para gerar uma mudança de cor em resposta ao E.coli. As duas principais vantagens desta técnica são a simplicidade do teste e sua aplicabilidade a outras enzimas de DNA clivadoras de RNA responsivas a analitos.

Quem demonstrará o procedimento serão Seperh Manchehry e Dingran Chang, alunos de pós-graduação do laboratório da Dra. Yingfu Li na Universidade McMaster. Após preparar os reagentes e os tampões de acordo com o protocolo descrito, prepare uma solução estoque de succinimidil 4-cicloexano-1-carboxilato, ou SMCC, dissolvendo um miligrama de SMCC em 676 microlitros de DMSO. Agite em vórtex e coloque no gelo até o uso.

Dissolva um miligrama de urease em um mililitro de PBS 1x e coloque também no gelo até o uso. Para sintetizar o DNA de urease, ou UrDNA, adicione 10 microlitros de LD1 100 micromolar a um tubo microcêntrifuga de 2,5 mililitros. Em seguida, adicione 140 microlitros de água bidestilada e 40 microlitros de PBS 10x e vortex.

Em seguida, adicione 80,5 microlitros do estoque de SMCC e 159,5 microlitros de DMSO. Depois, vortexie novamente e use uma centrífuga de bancada para fazer uma breve centrifugação. Incube a reação a 37 graus Celsius em um incubador ou bloco térmico por 60 minutos.

Após a incubação, adicione 200 microlitros de PBS 1x, 60 microlitros de acetato de sódio três molar e 1,5 mililitro de etanol frio a 100% ao tubo. Misture por vortexagem e incube a reação a menos 20 graus Celsius por 30 minutos. Centrifugue a solução a 20.000 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, remova o sobrenatante e seque o pellet sob vácuo. Ao pellet seco, adicione 400 microlitros do estoque de urease e incube à temperatura ambiente por 5 horas. Transfira 200 microlitros do conjugado bruto para uma coluna de filtro centrífugo pré-lavada com corte de peso molecular de 100.000.

Centrifugue a coluna a 14.000 × g durante cinco minutos. Transfira os 200 microlitros restantes do conjugado bruto para a coluna e centrifugue a 14.000 × g durante cinco minutos. Em seguida, remova a coluna e coloque-a de cabeça para baixo em um novo tubo de coleta microcêntrifuga de dois mililitros.

Centrifugue o tubo e a coluna invertidos a 1.000 × g durante dois minutos. Após remover o tubo de coleta, adicione 30 microlitros de PBS 1x à coluna centrífuga para lavar a membrana e obter recuperação adicional dos conjugados. Inverta a coluna novamente e coloque-a de volta no tubo de coleta.

Centrifugue a coluna a 1.000 × g durante dois minutos. Remova e descarte a coluna. Armazene o UrDNA a quatro graus Celsius até o uso.

Para montar um DNAzyme clivador de RNA ativado por E.coli, ou EC1, e o UrDNA em microesferas magnéticas, agite bem o estoque de microesferas e transfira 100 microlitros da suspensão de microesferas para um tubo microcêntrifuga de 1,5 mililitro. Em seguida, coloque o tubo em um suporte de gradiente magnético para isolamento das microesferas. Remova o sobrenadante por pipetagem e adicione 150 microlitros de tampão de ligação, ou BB, ao tubo.

Retire o tubo do suporte e bata cuidadosamente no tubo para ressuspender os grânulos em uma solução homogênea. Após repetir a lavagem com BB mais duas vezes com os grânulos em suspensão com BB, adicione 10 microlitros de EC1 a 10 micromolar. Misture cuidadosamente batendo no tubo.

Incube a solução com agitação suave por 30 minutos. Para evitar a agregação das microesferas, bata levemente no tubo a cada dois ou três minutos. Em seguida, coloque o tubo de microcentrífuga novamente no suporte magnético para isolar as microesferas e remova o sobrenadante por pipetagem.

Em seguida, utilize 150 microlitros de BB para lavar as microesferas três vezes. Após a conclusão da lavagem, suspenda as microesferas em um volume total de 150 microlitros de BB. A esta solução, adicione 15 microlitros de UrDNA e aqueça a amostra a 45 graus Celsius por dois minutos, depois resfrie a solução até a temperatura ambiente e incube por duas horas. Coloque o tubo de microcentrífuga novamente no suporte magnético para isolar as microesferas e remova o sobrenadante por pipetagem.

Adicione 100 microlitros de tampão de reação, ou RB, em seguida remova o tubo do suporte magnético e re-suspenda cuidadosamente as esferas. Após preparar as células de E. coli de acordo com o protocolo descrito, pré-lave um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro adicionando e vortexando 100 microlitros de RB. Em seguida, descarte o tampão. Adicione 15 microlitros do EC1 montado ao tubo lavado, coloque o tubo no suporte magnético e aspire o sobrenadante.

Retire o tubo do suporte, adicione 100 microlitros de RB e re-suspenda cuidadosamente as microesferas magnéticas. Após lavar as microesferas com RB mais duas vezes e remover o RB, adicione 10 microlitros da amostra de E.coli ao tubo e misture suavemente o conteúdo batendo levemente no tubo. Em seguida, incube a reação à temperatura ambiente por uma hora.

Após a incubação, adicione 90 microlitros de água bidestilada e coloque o tubo na grade magnética. Após cerca de três minutos de separação magnética, transfira cuidadosamente 85 microlitros do sobrenadante para um tubo microfuga de 0,5 mililitro. É muito importante pipetar a solução com cuidado, sem aspirar nenhuma das microesferas magnéticas.

Essas esferas são carregadas com urease e gerarão um sinal falso positivo. Adicione 15 microlitros de vermelho de fenol 0,04% e 100 microlitros da solução de substrato. Em seguida, tire fotografias em intervalos de tempo específicos para registrar a mudança de cor.

A cor inicial do teste de tornassol deve ser amarela, refletindo um pH da solução abaixo de 5,5. Se necessário, o pH inicial do teste de tornassol pode ser ajustado com um tampão fraco, como tampão de acetato de sódio um milimolar com pH cinco. Esta figura mostra os resultados do teste bacteriano de tornassol, no qual a DNAzima clivadora de RNA ativada por E.coli EC1 foi utilizada como DNAzima e o vermelho de fenol foi utilizado como indicador de pH.

Como mostrado pela ausência de mudança de cor na ausência de E.coli, o EC1 é altamente específico e apresenta atividade mínima contra outras bactérias. A intensidade da mudança de cor depende tanto do número de células de E.coli utilizadas na etapa de ativação do DNAzyme quanto do tempo permitido para a etapa de hidrólise da ureia. Um maior número de células de E.coli resulta em uma mudança de cor mais intensa, e um tempo mais longo para a hidrólise da ureia permite a detecção de um número menor de células.

Este gráfico mostra a alteração do pH conforme monitorado usando um medidor de pH portátil. A presença de 10 elevado a sete células de E.coli resultou em um aumento gradual do pH de três unidades em 10 minutos. Em contraste, a ausência de E.coli não causou alterações detectáveis do pH nas mesmas condições.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a urease é muito ativa e que uma lavagem inadequada ou contaminação levará a um falso positivo. Após este procedimento, este método pode ser realizado para testar a presença de E. coli em condições mais relevantes, como no teste da qualidade da água ambiental.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão sobre como aproveitar um simples teste de papel de tornassol para a detecção de E. coli. Não se esqueça de que este teste pode ser usado para detectar E. coli patogênica, que é extremamente perigosa. Você precisa fazer treinamento em biossegurança antes de realizar qualquer teste com bactérias patogênicas.