Name: A In Vitro Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprenda a usar espectroscopia de impedância para estudar interações entre células T ativadas e endoteliais em modelo murino da barreira hematoencefálica. Este método permite avaliação em tempo real da integridade celular e permeabilidade.

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Somos gratos a Annika Engbers e Frank Kurth pelo seu excelente apoio técnico e Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) para discussões úteis sobre medições TEER. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projeto A03 para HW e LK, CRC TR128, projeta A08; Z1 e B01 para LK e número de concessão HW, e do Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (Faculdade de Medicina de Münster) KL2 / 2015/14 para LK.

Para todas as experiências, os ratinhos foram criados e mantidos sob condições específicas isentas de agentes patogénicos em instalações para animais Central da Universidade de Munster, de acordo com as directrizes alemães para cuidados animais. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações do comitê de animais ética experimental e aprovado pelas autoridades locais de North Rhine-Westphalia, Alemanha (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217). 1. MBMEC Isolamento e Cultura NOTA: Isolar MBMECs como previamente descrito em detalhe 14 com as seguintes modificações: <ol><li> Sacrificar 20 adultos C57BL 6 ratos / (6-8 semanas de idade) por inalação de CO 2 e confirmar a sua morte por determinação parada cardíaca e respiratória. </li><li> Lavar o rato com 70% de etanol e decapitá-lo com uma tesoura; remover o couro cabeludo usando uma pinça e tesouras. Fazer incisões no lado esquerdo e direito do crânio, a partir do forame magno. Levante o crânio do seu lado caudal e takde e para fora do cérebro com uma pinça. </li><li> Dentro de uma câmara de fluxo laminar, utilizar uma pinça estéril para colocar o cérebro em uma placa de Petri e remover o tronco cerebral, cerebelo e tálamo, mantendo apenas o córtex. NOTA: O uso de um microscópio não é necessária para qualquer um destes passos. </li><li> Coloque o córtex sobre um pedaço de papel Western blot estéril e enrolá-lo suavemente com uma pinça até meninges não são mais visíveis. </li><li> Após a digestão enzimática e mecânica (seguindo o protocolo 14), recolher as células endoteliais a partir do gradiente de densidade usando, uma agulha estéril de comprimento e um êmbolo 5 ml. As células endoteliais aparecer como uma camada escura acima do anel vermelho com eritrócitos. Transferência de 20-25 ml desta camada para um novo tubo de 50 ml de centrifugação; encher o tubo com DMEM. </li><li> Após dois ciclos de lavagem 14, ressuspender as células em 6 ml de meio contendo puromicina MBMEC (4 ug / ml) e semear-los para seis cavidades de uma placa de 24 poços; deixá-los em um tecidoincubador de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 (referido como &#39;incubadora&#39; daqui em diante) durante três dias. NOTA: Para mais informações sobre solução de revestimento MBMEC, consulte a Tabela de Materiais. </li><li> Alterar a forma através da adição de 1 ml a cada poço de meio fresco sem MBMEC puromicina; colocar a placa de volta a 37 ° C e 5% de CO 2 durante mais dois dias. </li></ol> 2. A colheita MBMECs <ol><li> No dia cinco após isolamento MBMEC, pré-revestimento com inserções permeáveis MBMEC solução de revestimento de: adicionar 80 ul de solução por pastilha e deixá-los a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 h. </li><li> Cuidadosamente pipeta a solução de revestimento e deixar o inserções de ar seco durante 30 minutos. Adicionar 2 ml de temperatura ambiente (TA) de PBS a cada poço da placa, utilizando MBMECs para lavar a forma; repita este passo. Adicionar 0,05% de tripsina-EDTA (300 uL por poço) e deixar a placa na incubadora durante 5-10 min. </li><li> Adicionar 2 ml de meio MBMEC a cada poço para parartripsinização. Transferir as células recolhidas para um tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a 700 xg los durante 8 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio MBMEC sem puromicina. </li><li> Contar as células; misturar 10 ul de suspensão celular com 90 ul de 0,04% de Azul de Tripano (10X de diluição de células). Pipetar 10 ul desta mistura entre a cobertura de vidro e a câmara de contagem de células (hemocitômetro). Contagem de células tripano azul-livre em todos os quatro quadrantes da câmara (N) e determinar o número médio de células contadas (N &#39;) como se segue: N&#39; = N / 4. </li><li> Calcula-se a concentração celular (em 10 6 células / ml), utilizando a seguinte fórmula: C = N &#39;x 10 4 x 10, em que 10 4 é dada pelas dimensões do hemocitómetro e 10 é o factor de diluição do passo 2.4. </li><li> Semente de 2 x 10 4 células num volume de 260 ul por pastilha. Adicionar 810 ul de meio MBMEC para o compartimento inferior de cada poço. Coloque a placa com inserções na incubadora até que esteja pronto para prosseguir com o ponto 4. NOTA: Os volumes para o compartimento superior e inferior são de inserção específica e não funcionam para todos os formatos de 24 poços. </li></ol> 3. CD4 + T e isolamento das células Estimulação <ol><li> T CD4 + de isolamento de células <ol><li> Sacrificar um rato adulto (6-8 semanas de idade) por inalação de CO 2 e confirmar a sua morte por determinação parada cardíaca e respiratória. </li><li> Posicione o mouse sobre as suas costas em uma placa de dissecação limpa e lave-o com 70% de etanol; usar tesouras e pinças esterilizadas para abrir o peritônio e remover os baço e linfonodos (inguinal, axilar, braquial e cervical); Finalmente, a transferência do tecido para um tubo de centrifugação de 15 ml contendo 5 ml de PBS em gelo. </li><li> Sob a câmara de fluxo laminar, transferir o tecido por decantação PBS com o tecido em um tubo de centrifugação de 50 ml com um filtro celular de 70 uM no topo; homogeneizaro tecido, pressionando-o com um êmbolo de 1 ml através do filtro. </li><li> Adicionar 30 ml de tampão de SCAF e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de tampão de FACS. Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 40 mm, adicionar mais 20 mL de tampão de FACS para o tubo. </li><li> Centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS. </li><li> Adicionar 20 ul de rato CD4 microesferas magnéticas, misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C. Adicionar 25 ml de tampão de SCAF e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Enquanto isso, coloque uma coluna de separação LS para o ímã e lave-o com 3 ml de tampão FACS. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de tampão de FACS. </li><li> Adicionar células para a coluna. Lavar a coluna com 3 ml de tampão de SCAF três vezes. Remova a coluna do ímã e colocá-lo em um novo 15 ml centritubo fugation. Adicionar 5 ml de tampão de FACS, lavar as células marcadas com o êmbolo coluna e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de meio de células T. Contar as células tal como descrito em 2.4 e sementes de 1 x 10 5 células em 100 ul de meio por poço. </li></ol></li><li> Estimulação de células CD4 + T <ol><li> A estimulação das células T CD4 + policlonal <ol><li> Pré-revestimento de uma placa de 96 poços de fundo redondo com anticorpo purificado anti-rato CD3 (clone 145-2C11) em PBS, a uma concentração final desejada. Por exemplo, para pré-revestir a placa completamente com α-CD3 a 1 ug / mL, misturar 10 mL do anticorpo (concentração estoque = 0,5 mg / ml) com 5 ml de PBS, vortex e adicionar 50 uL da mistura para cada poço com uma pipeta multicanal. </li><li> Deixar a placa na incubadora durante 3 h. Depois de isolar as células T, lavar a placa pré-revestido duas vezes com PBS. Adicionar anticorpos anti-CD28 purificada (clone37,51) para as células T isoladas a uma concentração final desejado (por exemplo, a 1 ug / ml); misture bem. Semear as células T e deixá-los na incubadora por dois a três dias. </li></ol></li><li> Estimulação de células específicas de antigénio de células T CD4 + com células dendríticas (DC) NOTA: Se DCs são usadas como células apresentadoras de antigénio (APCs), seguir o protocolo para o isolamento de células T, com as seguintes excepções: <ol><li> Antes de se homogeneizar o baço, injectá-la com 1 ml de colagenase de tipo IA em PBS a 0,5 mg / ml e transferi-lo para um tubo de centrifugação de 15 ml. </li><li> Incubar em banho-maria a 37 ° C durante 15 min. Após lavagem com PBS, ressuspender o sedimento em tampão de FACS e adicionar 20 ul de rato CD11c microesferas magnéticas, em vez de microesferas de CD4. </li><li> Usar uma coluna de separação de MS e os volumes apropriados: lavar a coluna com 1 ml de tampão de SCAF; Ressuspender as células em 1 ml de tampão de SCAF e lava-se a coluna com 1 ml de tampão de SCAF três vezes. </li><li> de Anúnciosd antigénio de escolha para DC (por exemplo, glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) AA 35-55 a 20 ug / ml), misturar bem e semente 5 x 10 4 células em 100 ul de meio de cultura de células T por 96-round-bottom bem. </li><li> Adicionar 1 x 10 5 células T em 100 ul de meio de cultura de células T por 96 de fundo redondo de cavidades, com o fim, tal como descrito no protocolo para o isolamento de células T. </li></ol></li><li> A estimulação das células T CD4 + específicas para o antigénio com as células B NOTA: Se as células B são usados ​​como APCs, seguir o protocolo para o isolamento de células T, com as seguintes exceções: <ol><li> Use baços de ratinhos transgénicos, cujas células B são específicas do antigénio (por exemplo, ratinhos, IgH MOG (Th), cujas células B reconhecem especificamente MOG 35-55). </li><li> Utilização de células T específicas do antigénio (por exemplo, a partir de TCR MOG (2D2) ratinhos). Adicionar 20 l de rato CD19 microesferas magnéticas em vez de microesferas de CD4. </li><li> Adicionar o antigénio de escolha para o cel BLS (por exemplo, MOG 35-55 em 20 ug / ml), misturar bem e semente de 5 x 10 4 células em 100 ul de meio de cultura de células B por 96 de fundo redondo de poços. </li><li> Adicionar 1 x 10 5 células T em 100 ul de meio de cultura de células T por 96 de fundo redondo de poços, como descrito no protocolo para o isolamento de células T. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Configuração e Execução de Medição TEER <ol><li> Colocar o módulo de 24 poços do instrumento TEER sob a câmara de fluxo laminar. Retire as tampas e inserções lugar com MBMECs no instrumento usando uma pinça. </li><li> Pipetar 810 l de meio fresco para o compartimento inferior das cavidades do módulo: adicioná-lo cuidadosamente entre a pastilha e a parede do módulo bem. </li><li> Fechar as tampas e coloque o instrumento na incubadora. Conecte o instrumento ao seu computador; ligar o controlador de instrumento e abrir o software. </li><li> Selecione &quot;nova medição&quot; na janela pop-up. Check &#39;show TEER &quot;e caixas de&#39; show Ccl &#39;; em seguida, pressione &#39;start&#39;. Depois de completar a primeira medição, selecione &#39;check todos os poços&#39; no separador &#39;Resultados&#39; para ver todos os valores TEER e Ccl. </li><li> Salve o arquivo: Arquivo&gt; Salvar como&gt; &#39;o nome do seu arquivo&#39;. NOTA: Como TEER e Ccl são continuamente medido de forma automatizada, monitorar seus valores durante um período de três a cinco dias. Mudando a forma não é necessário, a menos que a viabilidade celular é sub-óptima, como visualizado por uma ausência de aumento na TEER. </li><li> Escolha o ponto de tempo para co-cultura MBMECs com células T quando Ccl é estável e inferior a 1 uF / cm 2 e TEER atingiu o seu nível máximo. </li><li> inspecione cuidadosamente valores absolutos TEER e Ccl e excluir os poços nos quais MBMECs não desenvolveram monocamadas confluentes suficientes desmarcando tais poços. </li><li> Grupo do resto dos poços: clique com o botão direito sobre um bem e selecionar &quot;adicionar bem ao novo poço média&quot;. Namenviar um e-lo na janela pop-up; fazer o mesmo para todos os poços individuais a serem agrupados. </li><li> Verificar todos os poços médios para confirmar que todos eles têm as mesmas condições iniciais antes da co-cultura. Se alguns têm significativamente diferentes valores absolutos TEER ou TEER encostas, ou os erros padrão são muito grandes, refazer o agrupamento. NOTA: O agrupamento ideal de poços fornece uma variação mínima em valores TEER, dentro e entre os grupos experimentais. </li><li> Na aba &quot;experimento&quot;, pressione &quot;pausa&quot;, desligue o instrumento e levá-la para fora da incubadora. Retirar as tampas sob a câmara de fluxo laminar. </li><li> Prepare pré-ativado e / ou células T naive, com ou sem citocinas específicas, anticorpos ou outras substâncias, como desejado: Por exemplo: Mistura purificado rato NA / LE anticorpo anti-rato IFN-γ (XGM1.2 clone) com T preparado as células, a 20 ug / ml por poço do instrumento TEER. NOTA: Se as substâncias, tais como inibidor de granzima B são usados, eles são umdded à cultura de células T no início da estimulação das células T: por exemplo, granzima B Inhibitor II (Calbiochem) é misturado com as células T isoladas a uma concentração final de 10 uM em DMSO. Ver Materiais e Equipamentos para mais detalhes. </li><li> Remover parte do meio da inserção (o compartimento bem superior): por exemplo, cuidadosamente pipeta 150 uL (removendo toda a forma deve ser evitado, uma vez que poderiam perturbar a monocamada MBMEC). </li><li> Adicionar células T para MBMECs pipetando cuidadosamente 150 ul de meio contendo 2 x 10 5 células / inserção. NOTA: Quando a colheita de células T pré-ativado, contar apenas explodir, células Trypan Blue-livres. </li><li> Fechar as tampas e coloque o instrumento de volta para a incubadora. Volte a ligar o instrumento e pressione &#39;medição currículo&#39;. Depois de 24 horas, pressione &#39;stop&#39; no separador &#39;experimento&#39; e salve o arquivo (Arquivo&gt; Salvar). </li></ol> 5. Data Export e Análise Estatística <ol><li>Exportar os resultados escolhendo Arquivo&gt; Exportar. </li><li> Na guia &quot;Configurações&quot; da janela pop-up, selecione &quot;.dot&quot; na opção &quot;separador decimal&quot; e &quot;tabulator&quot; na opção &quot;delimitador de campo&quot;. </li><li> Na aba &quot;resultados de exportação&quot;, o nome do arquivo, verifique todos os poços a serem exportados, e marque a opção &quot;TEER&quot; e caixas &quot;Ccl&quot; na &quot;escolha de dados&quot; opção. </li><li> Pressione &quot;exportar dados,&quot; abrir o arquivo exportado, e copiar os dados para uma planilha. </li><li> Normalizar os dados exportados (classificado por cada repetição, com valores TEER e Ccl dadas para cada execução (medição)): valores Set TEER e Ccl do último ponto de tempo antes que a co-cultura para 100% e mudar de acordo com os valores para todos os outros runs, em relação ao run &#39;100%&#39;. </li><li> Copiar os dados normalizados para um software de escolha para gerar um gráfico, usando poços individuais e exibindo o erro padrão da média para cada grupo de tratamento. </li><li> Perform dois sentidos teste estatístico ANOVA com correção de Bonferroni para comparações múltiplas, utilizando o software estatístico de escolha. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl e L. Klotz não têm nada a divulgar. H.-J. Galla é consultor científico da nanoAnalytics GmbH, fabricante do monitor de células automatizado.

Vários passos do protocolo descrito são essenciais para uma experiência de sucesso. Durante o isolamento e cultura MBMEC inicial, é crucial que o trabalho é executado sob condições estéreis, tanto quanto possível, para evitar a contaminação da cultura de células com esporos de fungos ou bactérias. A fim de se obter uma cultura pura de células endoteliais, é recomendado o uso de um meio contendo puromicina para os três primeiros dias, o que permite que a sobrevivência das células endoteliais, mas não outros tipos de célu...

A barreira sangue-cérebro separa a circulação sistémica a partir do sistema nervoso central (SNC) 1-3. Ele fornece uma barreira física que inibe a livre circulação das células e à difusão de moléculas solúveis em água e protege o cérebro de agentes patogênicos e substâncias potencialmente nocivas. Para além da sua função de barreira, o BBB permite o fornecimento de oxigénio e nutrientes para o parênquima cerebral, o que assegura o bom funcionamento do tecido neuronal. As propriedades funcionais da certificação são altamente regulados pelos seus componentes celulares e acelulares, com ECs altamente especializada sendo o seu principal elemento estrutural. CEs da certificação são caracterizados pela presença de junção estanque (TJ) complexos, falta de fenestrações, extremamente baixa actividade pinocytic, e mecanismos de transporte permanentemente activas. Outros componentes da certificação da membrana basal CE, pericitos incorporação do endotélio, pés terminais astrocíticos e = par associadomembrana basal enchymal também contribuir para o desenvolvimento, manutenção e função da BHE 2,4 - 6 e, em conjunto com os neurónios e microglia, formam a unidade neurovascular (NVU), que permite o bom funcionamento do SNC 7-9. Numa variedade de doenças neurológicas, tais como neurodegenerativas, doenças inflamatórias ou infecciosas, a função da BHE está comprometida 2,5,10. A desregulação de TJ e complexos mecanismos de transporte moleculares leva ao aumento da permeabilidade a certificação, o extravasamento de leucócitos, a inflamação e dano neuronal. A fim de estudar as propriedades de BBB sob tais condições fisiopatológicas, vários modelos in vitro da BBB foram estabelecidas 9,11,12. Juntos, eles têm fornecido informações valiosas sobre as mudanças da integridade da barreira, a permeabilidade, bem como mecanismos de transporte. Estes modelos utilizam células endoteliais de origem humana, de ratinho, rato, porcino ou bovina 13-18; células endoteliais primárias ou linhas celulares são cultivadas quer como uma monocultura ou em conjunto com os pericitos e / ou astrócitos para imitar mais de perto a certificação in vivo 19-25. Nos últimos anos, a medição da resistência eléctrica transendotelial (TEER) tornou-se uma ferramenta amplamente aceito para avaliar as propriedades de barreira endotelial 26,27. TEER reflecte a impedância ao fluxo de iões através da monocamada de células e a sua redução proporciona uma medida sensível da integridade da barreira endotelial comprometida e, por conseguinte, aumento da permeabilidade. Vários sistemas de medição TEER têm sido desenvolvidos, incluindo epitelial Voltohmmeter (Evom), Cell-substrato Eléctrica Impedância de detecção (ECIS), e análise de células em tempo real 15,28 - 30. TEER reflecte a resistência ao fluxo de iões entre CEs adjacentes (via paracelular) e é directamente proporcional àa integridade da barreira. Em espectroscopia de impedância 27,31, impedância total complexo de (Z) é medida, que fornece informações adicionais sobre a integridade da barreira medindo Ccl. Ccl relaciona-se com a corrente capacitiva através da membrana celular (via transcelular): a camada de células actua como um condensador no circuito eléctrico equivalente, que separa as cargas em ambos os lados da membrana e é inversamente proporcional à integridade da barreira. Quando cultivadas em inserções permeáveis, ECs aderir, proliferar e espalhar sobre a membrana microporosa. Isto resiste a corrente capacitiva fundo da inserção (que por sua vez actua como um condensador) e leva a uma diminuição na capacitância até que atinge o seu nível mínimo. Isso é seguido pelo estabelecimento de TJ complexos que vedar o espaço entre as células endoteliais adjacentes. Isso restringe o fluxo de iões através da via paracelular, e TEER aumenta até atingir o planalto. Sob condições inflamatórias, no entanto, o endotheliai barreira está comprometida: TEER diminui à medida que TJ complexos são interrompidos e Ccl aumenta à medida que o componente capacitivo da inserção sobe novamente. Nossa medição TEER usa o sistema automatizado de monitorização das células 32: segue-se o princípio da espectroscopia de impedância e estende suas aplicações anteriores. Aqui, nós descrevemos um modelo in vitro a certificação que permite o estudo das propriedades de barreira, incluindo a interacção de endotélio cerebral com células do sistema imune; em particular células T activadas. Tais condições fisiopatológicas são observadas em doenças auto-imunes do sistema nervoso central, tais como a esclerose múltipla e o seu modelo animal experimental de encefalomielite auto-imune 33-37. Aqui, um passo crucial é a transmigração de células T encefalitogénicas, específicos de mielina em todo o BBB. Isto é seguido pela sua reactivação no espaço perivascular e entrada dentro do parênquima do cérebro, onde se recrutar outras células do sistema imunológico e meinflamação diate e subsequente desmielinização 1,35,38. No entanto, os mecanismos moleculares da interacção entre estas células T e as células endoteliais, os principais constituintes da BBB, não são bem compreendidos. Nosso protocolo visa preencher esta lacuna e dar novos insights sobre as consequências sobre as células endoteliais (ou seja, a integridade da barreira e permeabilidade) mediante o seu contacto directo e complexa interação com as células T ativadas. O protocolo aqui descrito faz uso de células endoteliais microvasculares cerebrais de rato primária, cultivadas como uma monocamada em inserções permeáveis ​​com membranas microporosas. As células endoteliais são co-cultivadas com células T CD4 +, que podem ser pré-activados quer policlonal ou de um modo específico do antigénio. Co-cultura de células T com MBMECs pré-activado, mas não ingénuos induz uma diminuição da TEER e um aumento em CCL, a qual fornece uma medida quantitativa da disfunção e barreira perturbação MBMEC. a técnicaé não-invasivo: ele usa built-in em vez de eletrodos pauzinho, que impedem a grande perturbação da monocamada CE; ele pode ser utilizado para monitorizar a função de barreira, sem a utilização de marcadores de células. Faz medições contínuas em uma forma automatizada e permite uma avaliação independente dos dois parâmetros de barreira (TEER e CCL), simultaneamente, ao longo do tempo. O método também é suficientemente sensível para distinguir entre diferentes níveis de activação de células T e os efeitos de tais células T na ECS. Ele pode ser usado numa grande variedade de ensaios funcionais diferentes: as citocinas e / ou quimiocinas implicados em processos inflamatórios podem ser adicionadas à co-cultura de células T e MBMECs; anticorpos bloqueadores contra moléculas de adesão celular em ambos o lado CE ou de células T pode ser utilizado; e inibidores de marcadores de activação das células T ou de suas propriedades citolíticas pode ser adicionado durante a iniciação de células T ou a sua co-cultura com células endoteliais. O ensaio é também útil para a transmigração de células Tensaios, uma vez que pode servir como um controlo da integridade monocamada MBMEC antes da adição de células T qualidade. Tudo isto torna este método uma ferramenta versátil e fiável para estudar a certificação in vitro, com um foco no efeito de células T activadas na integridade monocamada CE. Isto é de particular importância para a compreensão dos mecanismos de certificação da interrupção na patogénese de doenças auto-imunes, como a esclerose múltipla e o seu modelo animal de EAE, em que, as células T auto-reactivas encefalitogénicas atravessar a BHE e causar inflamação e dano neuronal.

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>incluindo: Módulo de célula de 24 poços, controlador, PC com software cellZscope v2.2.2&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; para</td></tr><tr><td>citômetro de fluxo</td> de isolamento MBMEC <td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>para análise de transmigração de células T</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5 software</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>para análise de transmigração de células T</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Oak Ridge, PC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; para isolamento MBMEC</td></tr><tr><td>Inserções de membrana Transwell - tamanho do poro 0,4 &micro; m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>para medição TEER como leitura principal</td></tr><tr><td>Inserções de membrana Transwell - tamanho de poro 3 &micro; m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>para medição TEER como controle de qualidade antes do ensaio de transmigração de células T</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>de fundo plano; para cultura MBMEC</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 96 poços</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>de fundo redondo; para cultura de células imunes</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>para isolamento de células T e células B; suporta Colunas MACS LS</td></tr><tr><td>OctoMACS Separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>para isolamento de células dendríticas; suporta colunas MACS MS</td></tr><tr><td>Câmara de contagem Neubauer</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>para contagem de células</td></tr><tr><td>Filtro de células, 70 &micro; m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>para isolamento de células imunes</td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 &micro; m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>para isolamento de células imunes</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>para isolamento de células</td></tr><tr><td>imunes Colunas de separação MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>para isolamento de células T e células B</td></tr><tr><td>Colunas de separação MACS MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>para isolamento de células dendríticas</td></tr><tr><td>Mouse CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>para isolamento de células T CD4+</td></tr><tr><td>MicroBeads de camundongo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>para isolamento de células B</td></tr><tr><td>MicroBeads de camundongo CD11c</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>para isolamento de células dendríticas</td></tr><tr><td>Colágeno tipo IV da placenta humana</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>para solução de revestimento MBMEC</td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>para solução de revestimento MBMEC</td></tr><tr><td>Colagenase 2 (CSL2)</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>para isolamento MBMEC</td></tr><tr><td>Colagenase/Dispase (C/D)</td><td></td><td>Roche 11097113001</td><td>para isolamento</td></tr><tr><td>MBMEC DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>para isolamento MBMEC</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>para isolamento MBMEC</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>para isolamento MBMEC</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>para isolamento MBMEC</td></tr><tr><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>para isolamento MBMEC e meio de cultura MBMEC</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>para isolamento MBMEC e meio de cultura MBMEC</td></tr><tr><td>tamponado com fosfato Solução salina (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>D8537</td><td>para MBMEC e isolamento de células imunes</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>para meio de cultura MBMEC</td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos básicos humanos (bFGF)</td> <td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>para meio de cultura MBMEC</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>para meio de cultura MBMEC; apenas nos primeiros três dias</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>para colheita de MBMECs</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>para isolamento de células dendríticas</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>para contagem de células</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td>Sigma E5134</td><td>para isolamento de células imunes</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>para meio de cultura de células T</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>proteger da luz; para meio de cultura de células B</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>para meio de cultura de células B</td></tr><tr><td>L-Glutamina (100x Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>para meio de cultura de células B</td></tr><tr><td>camundongo MOG35&mdash; 55 peptídeo</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>para ativação de células T antígeno-específicas</td></tr><tr><td>purificadas anti-camundongo CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>clone 145-2C11; para ativação de células T policlonais</td></tr><tr><td>purificadas NA/LE anti-camundongo CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>clone 37.51; para ativação de células T policlonais</td></tr><tr><td>IFN-&gama murino recombinante;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>para ensaios de transmigração de células T</td></tr><tr><td>TNF murino recombinante-&alfa;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>para ensaios de transmigração de células T</td></tr><tr><td>NA/LE anti-camundongo purificado IFN-&gama; anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>clone XMG1.2; concentração final recomendada: 20 &micro; g / ml</td></tr><tr><td>Granzyme B Inhibitor II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>concentração final recomendada: 10 &micro; Anticorpo</td></tr><tr><td>M PE anti-camundongo CD4</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>clone RM4-4; para análise da transmigração de células T</td></tr></tbody></table>

a<em&gt; in vitro</em&gt; modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: um foco na interação celular t cell-endotelial

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

A quebra da barreira hematoencefálica (BHE) é uma etapa crítica no desenvolvimento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla (EM) e seu modelo animal de encefalomielite autoimune experimental (EAE). Esse processo é caracterizado pela transmigração de células T ativadas através das células endoteliais cerebrais (CEs), os principais constituintes da BHE. No entanto, as consequências na função do EC cerebral após a interação com essas células T são amplamente desconhecidas. Aqui descrevemos um ensaio que permite a avaliação da função microvascular microvascular do cérebro primário do camundongo (MBMEC) e da integridade da barreira durante a interação com as células T ao longo do tempo. O ensaio faz uso de espectroscopia de células de impedância, uma ferramenta poderosa para estudar a integridade e permeabilidade da monocamada de EC, medindo mudanças na resistência elétrica transendotelial (TEER) e capacitância da camada celular (Ccl). Em contato direto com CEs, células T estimuladas, mas não ingênuas, são capazes de induzir disfunção de monocamada de CE, conforme visualizado por uma diminuição no TEER e um aumento no Ccl. O ensaio registra mudanças na integridade da monocamada EC de forma contínua e automatizada. É sensível o suficiente para distinguir entre diferentes intensidades de estímulos e níveis de ativação de células T e permite a investigação das consequências de uma modulação direcionada da interação célula T-EC usando uma ampla gama de substâncias, como anticorpos, reagentes farmacológicos e citocinas. A técnica também pode ser usada como controle de qualidade para integridade de CE em ensaios de transmigração de células T in vitro. Essas aplicações o tornam uma ferramenta versátil para estudar as propriedades do BBB em condições fisiológicas e fisiopatológicas.

A Figura 1 fornece uma visão geral do modelo de certificação in vitro utilizado para estudar a interação entre células T e células endoteliais. O experimento consiste em três etapas principais. O primeiro passo é o isolamento de MBMECs primárias a partir de córtices cerebrais, e a sua cultura durante cinco dias. Quando atingem confluência na placa de cultura celular, MBMECs são tripsinizadas e re-semeadas em inserções permeáveis, os quais são, então, colocados n...

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

O objetivo geral deste experimento é estudar as consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com linfócitos T ativados. Este método ajuda a responder perguntas fundamentais na área de neuroimunologia, como, por exemplo, de que maneira a interação direta entre linfócitos T e células endoteliais afeta a integridade e a permeabilidade da barreira hematoencefálica. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a avaliação automatizada e em tempo real da função da barreira mediante modulação direcionada da interação entre linfócitos T e células endoteliais.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de distúrbios autoimunes do SNC, pois proporcionam uma compreensão sobre a ruptura da barreira hematoencefálica mediada por linfócitos T, uma etapa crucial na patogênese dessas doenças. Este método concentra-se nas propriedades da barreira hematoencefálica em modelos marinhos durante a EAE. No entanto, também pode ser aplicado a modelos de barreira hematoencefálica de roedores ou humanos, bem como a estudos de outras doenças autoimunes do SNC.Em geral, indivíduos novos neste método podem enfrentar dificuldades devido a possíveis problemas com o tempo ideal para o cultivo combinado de células endoteliais primárias e ativação de células T. Desenvolvemos inicialmente este método quando iniciamos a investigação dos efeitos de diferentes níveis de ativação de células T sobre as propriedades da barreira hematoencefálica durante a EAE, um modelo animal da esclerose múltipla. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o estabelecimento de cultivos co-culturais de células T e células endoteliais é difícil de aprender, já que variações iniciais nas células T entre poços podem levar posteriormente a representações incorretas dos resultados.Para iniciar este procedimento, no quinto dia após o isolamento de MBMEC, revista os inserts permeáveis com 80 microlitros de solução de revestimento de MBMEC por insert. Incube-os a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas. Após remover a solução de revestimento de MBMEC dos inserts, lave os MBMECs adicionando dois mililitros de PBS à temperatura ambiente em cada poço, aspire após um minuto e repita este procedimento mais uma vez.Em seguida, adicione tripsina-EDTA 0,05% na quantidade de 300 microlitros por poço e incube por cinco a dez minutos. Posteriormente, adicione dois mililitros de meio MBMEC a cada poço para interromper a tripsinização. Então, transfira as células coletadas para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue a amostra a 700 ×g durante oito minutos a quatro graus Celsius.Após oito minutos, descarte o sobrenatante e ressuspenda as células em um mililitro de meio MBMEC sem puromicina. Para contar as células, misture 90 microlitros de azul de tripano 0,04% com 10 microlitros de suspensão celular; pipete 10 microlitros da mistura entre a lamínula de vidro e a câmara de hemocitometria.Em seguida, semeie duas vezes 10 à quarta células por inserto. Adicione 810 microlitros de meio MBMEC ao compartimento inferior de cada poço e coloque a placa com os insertos no incubador até o momento de realizar a medida de TEER. Para estimular as células T positivas para CD4, revista uma placa de 96 poços com fundo redondo com anticorpo anti-CD3 de camundongo purificado numa concentração final desejada durante três horas a 37 graus Celsius.Após o isolamento dos linfócitos T, lave a placa pré-revestida duas vezes com PBS. Em seguida, adicione o anticorpo anti-CD28 purificado aos linfócitos T isolados em uma concentração final desejada e misture bem. Depois, incube os linfócitos T e deixe-os a 37 graus Celsius por dois a três dias.Para configurar a medição de TEER, coloque o módulo de 24 poços do instrumento TEER na cabine de fluxo laminar. Remova as tampas e posicione os inserts com MBMECs no instrumento, utilizando pinça. Em seguida, pipete 810 microlitros do meio fresco no compartimento inferior dos poços do módulo, adicionando cuidadosamente entre o insert e a parede do poço do módulo.Em seguida, feche as tampas e coloque o instrumento no incubador. Conecte o instrumento ao computador. Então, ligue o controlador do instrumento e abra o software.Na janela pop-up, selecione Nova Medição, marque as caixas "exibir TER" e "exibir Ccl". Em seguida, pressione iniciar. Após concluir a primeira medição, selecione "marcar todas as poças" na guia Resultados para visualizar todos os valores de TEER e Ccl.Em seguida, salve o arquivo. Depois, escolha o ponto temporal para co-cultivar MBMECs com linfócitos T quando o Ccl estiver estável e abaixo de um microfarad por centímetro quadrado e quando o TEER tiver atingido seu nível máximo. Examine cuidadosamente os valores absolutos de TEER e Ccl e exclua os poços nos quais os MBMECs não desenvolveram monocamadas suficientemente confluentes desmarcando esses poços.Agrupe os demais poços clicando com o botão direito nos poços e selecionando "adicionar poço a novo poço médio". Dê um nome a ele na janela pop-up e faça o mesmo para todos os poços individuais a serem agrupados. Em seguida, verifique todos os poços médios para confirmar que todos possuem as mesmas condições iniciais antes da co-cultura. Na guia do experimento, pressione pausa.Desconecte o instrumento e retire-o da incubadora. Em seguida, remova as tampas na câmara de fluxo laminar. Posteriormente, remova parte do meio do inserto no compartimento do poço superior.Adicione linfócitos T aos MBMECs pipetando cuidadosamente 150 microlitros de meio. Em seguida, reconecte o instrumento e pressione retomar medição. Após 24 horas, pressione parar na guia de experimento e salve o arquivo.Mostradas aqui estão a morfologia em forma de fuso na coloração por imunofluorescência de PECAM-1 e Cldn-5 cinco dias após o isolamento de MBMECs. Aqui estão os valores de TEER e Ccl antes e depois do agrupamento de poços individuais antes da adição de linfócitos T. A curva azul não é utilizada para o experimento, já que MBMECs neste poço não desenvolveram TEER tão alto quanto nos outros poços.Neste experimento, linfócitos T CD4 positivos marcados, entre 35 e 55, foram estimulados de maneira específica ao antígeno por cinco dias. Linfócitos T ingênuos e citocinas pró-inflamatórias, interferon gama e TNF-alfa, serviram como controle negativo e positivo, respectivamente. Aqui, os linfócitos T foram estimulados pela mesma quantidade de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, e os cultivados por três dias exibiram maior propensão para a ruptura da barreira em comparação com os linfócitos T cultivados apenas por dois dias.Os resultados aqui mostram que as células T estimuladas, mas não seus sobrenadantes, causaram um dano substancial às MBMECs, indicando que o contato direto entre as células T e as MBMECs é essencial para a ruptura da barreira. Por outro lado, a adição do inibidor da granzima B dois ao cultivo de células T restaurou a integridade das MBMECs em maior grau, destacando a molécula citolítica como um agente importante no dano às MBMECs e na subsequente redução do TEER. Uma vez dominado, este experimento pode ser realizado em 12 dias, se for executado corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de escolher o ponto de tempo correto para montar o co-cultivo de células T e células endoteliais.Após este procedimento, outros ensaios podem ser empregados, como microscopia por imunofluorescência, citometria de fluxo e ensaios de probabilidade. Para abordar questões adicionais, como: Como essa interação afeta a expressão das moléculas das junções apertadas, a permeabilidade e o grau de transmigração de linfócitos T? Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neuroimunologia explorarem distúrbios autoimunes do SNC em camundongos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como avaliar os efeitos diretos entre linfócitos T ativados e células endoteliais em relação à integridade e permeabilidade da barreira hematoencefálica.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método para avaliar a resistência elétrica transendotelial (TEER) em células endoteliais microvasculares do cérebro de camundongos in vitro. Um valor TEER alto indica junções de células endoteliais intactas, enquanto a adição de células T ativadas reduz o valor TEER, refletindo a ruptura da barreira juncional.

Avaliação da resistência elétrica transendotelial em um modelo de barreira hematoencefálica in vitro

Este vídeo demonstra um modelo in vitro para estudar patógenos que atravessam a barreira hematoencefálica (BBB). As células endoteliais microvasculares, que expressam junções apertadas, formam uma camada endotelial na câmara superior, enquanto neurônios, astrócitos e micróglia representam o parênquima cerebral na câmara inferior, separados por uma membrana porosa. A infecção por vírus no modelo BBB imita o patógeno que passa do sangue para o cérebro. Ao introduzir um vírus neurotrópico, ele...

Um modelo in vitro para estudar o cruzamento de patógenos da barreira hematoencefálica e a infecção de células cerebrais

Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

Aqui, descrevemos um modelo de barreira hematoencefálica humana que permite investigar a transmigração de linfócitos para o sistema nervoso central in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.

Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

Este relatório fornece protocolos para montagem, cultura de células e ensaios na plataforma μSiM para a construção de modelos de barreira hematoencefálica.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

A barreira hematoencefálica (BHE) tem um papel crucial na manutenção de um ambiente cerebral estável e saudável. A disfunção da BHE está associada a muitas doenças neurológicas. Desenvolvemos um modelo 3D, derivado de células-tronco do BBB para investigar a patologia cerebrovascular, a integridade do BBB e como o BBB é alterado pela genética e pela doença.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Este protocolo descreve um modelo in vitro confiável e eficiente da barreira sanguínea cerebral. O método utiliza células endoteliais vasculares cerebrais de camundongos bEnd.3 e mede a resistência elétrica transmembrana.

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

Aqui demonstramos a técnica de uso de biossensores baseados em impedância: ECIS e cellZscope, para medir a força da barreira endotelial cerebral. Detalhamos a preparação e a técnica de adição de vários estímulos a um modelo in vitro do endotélio cerebral. Medimos, registramos e fornecemos uma análise representativa dos resultados.

Medindo mudanças na integridade da barreira endotelial cerebral com dois biossensores baseados em impedância em resposta a células cancerígenas e citocinas

Aprenda a usar espectroscopia de impedância para estudar interações entre células T ativadas e endoteliais em modelo murino da barreira hematoencefálica. Este método permite avaliação em tempo real da integridade celular e permeabilidade.

A In Vitro Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial (Vídeo) | JoVE Journal

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