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O objetivo geral deste experimento é estudar as consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com linfócitos T ativados. Este método ajuda a responder perguntas fundamentais na área de neuroimunologia, como, por exemplo, de que maneira a interação direta entre linfócitos T e células endoteliais afeta a integridade e a permeabilidade da barreira hematoencefálica. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a avaliação automatizada e em tempo real da função da barreira mediante modulação direcionada da interação entre linfócitos T e células endoteliais.

As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de distúrbios autoimunes do SNC, pois proporcionam uma compreensão sobre a ruptura da barreira hematoencefálica mediada por linfócitos T, uma etapa crucial na patogênese dessas doenças. Este método concentra-se nas propriedades da barreira hematoencefálica em modelos marinhos durante a EAE. No entanto, também pode ser aplicado a modelos de barreira hematoencefálica de roedores ou humanos, bem como a estudos de outras doenças autoimunes do SNC.

Em geral, indivíduos novos neste método podem enfrentar dificuldades devido a possíveis problemas com o tempo ideal para o cultivo combinado de células endoteliais primárias e ativação de células T. Desenvolvemos inicialmente este método quando iniciamos a investigação dos efeitos de diferentes níveis de ativação de células T sobre as propriedades da barreira hematoencefálica durante a EAE, um modelo animal da esclerose múltipla. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o estabelecimento de cultivos co-culturais de células T e células endoteliais é difícil de aprender, já que variações iniciais nas células T entre poços podem levar posteriormente a representações incorretas dos resultados.

Para iniciar este procedimento, no quinto dia após o isolamento de MBMEC, revista os inserts permeáveis com 80 microlitros de solução de revestimento de MBMEC por insert. Incube-os a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas. Após remover a solução de revestimento de MBMEC dos inserts, lave os MBMECs adicionando dois mililitros de PBS à temperatura ambiente em cada poço, aspire após um minuto e repita este procedimento mais uma vez.

Em seguida, adicione tripsina-EDTA 0,05% na quantidade de 300 microlitros por poço e incube por cinco a dez minutos. Posteriormente, adicione dois mililitros de meio MBMEC a cada poço para interromper a tripsinização. Então, transfira as células coletadas para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue a amostra a 700 ×g durante oito minutos a quatro graus Celsius.

Após oito minutos, descarte o sobrenatante e ressuspenda as células em um mililitro de meio MBMEC sem puromicina. Para contar as células, misture 90 microlitros de azul de tripano 0,04% com 10 microlitros de suspensão celular; pipete 10 microlitros da mistura entre a lamínula de vidro e a câmara de hemocitometria.

Em seguida, semeie duas vezes 10 à quarta células por inserto. Adicione 810 microlitros de meio MBMEC ao compartimento inferior de cada poço e coloque a placa com os insertos no incubador até o momento de realizar a medida de TEER. Para estimular as células T positivas para CD4, revista uma placa de 96 poços com fundo redondo com anticorpo anti-CD3 de camundongo purificado numa concentração final desejada durante três horas a 37 graus Celsius.

Após o isolamento dos linfócitos T, lave a placa pré-revestida duas vezes com PBS. Em seguida, adicione o anticorpo anti-CD28 purificado aos linfócitos T isolados em uma concentração final desejada e misture bem. Depois, incube os linfócitos T e deixe-os a 37 graus Celsius por dois a três dias.

Para configurar a medição de TEER, coloque o módulo de 24 poços do instrumento TEER na cabine de fluxo laminar. Remova as tampas e posicione os inserts com MBMECs no instrumento, utilizando pinça. Em seguida, pipete 810 microlitros do meio fresco no compartimento inferior dos poços do módulo, adicionando cuidadosamente entre o insert e a parede do poço do módulo.

Em seguida, feche as tampas e coloque o instrumento no incubador. Conecte o instrumento ao computador. Então, ligue o controlador do instrumento e abra o software.

Na janela pop-up, selecione Nova Medição, marque as caixas "exibir TER" e "exibir Ccl". Em seguida, pressione iniciar. Após concluir a primeira medição, selecione "marcar todas as poças" na guia Resultados para visualizar todos os valores de TEER e Ccl.

Em seguida, salve o arquivo. Depois, escolha o ponto temporal para co-cultivar MBMECs com linfócitos T quando o Ccl estiver estável e abaixo de um microfarad por centímetro quadrado e quando o TEER tiver atingido seu nível máximo. Examine cuidadosamente os valores absolutos de TEER e Ccl e exclua os poços nos quais os MBMECs não desenvolveram monocamadas suficientemente confluentes desmarcando esses poços.

Agrupe os demais poços clicando com o botão direito nos poços e selecionando "adicionar poço a novo poço médio". Dê um nome a ele na janela pop-up e faça o mesmo para todos os poços individuais a serem agrupados. Em seguida, verifique todos os poços médios para confirmar que todos possuem as mesmas condições iniciais antes da co-cultura. Na guia do experimento, pressione pausa.

Desconecte o instrumento e retire-o da incubadora. Em seguida, remova as tampas na câmara de fluxo laminar. Posteriormente, remova parte do meio do inserto no compartimento do poço superior.

Adicione linfócitos T aos MBMECs pipetando cuidadosamente 150 microlitros de meio. Em seguida, reconecte o instrumento e pressione retomar medição. Após 24 horas, pressione parar na guia de experimento e salve o arquivo.

Mostradas aqui estão a morfologia em forma de fuso na coloração por imunofluorescência de PECAM-1 e Cldn-5 cinco dias após o isolamento de MBMECs. Aqui estão os valores de TEER e Ccl antes e depois do agrupamento de poços individuais antes da adição de linfócitos T. A curva azul não é utilizada para o experimento, já que MBMECs neste poço não desenvolveram TEER tão alto quanto nos outros poços.

Neste experimento, linfócitos T CD4 positivos marcados, entre 35 e 55, foram estimulados de maneira específica ao antígeno por cinco dias. Linfócitos T ingênuos e citocinas pró-inflamatórias, interferon gama e TNF-alfa, serviram como controle negativo e positivo, respectivamente. Aqui, os linfócitos T foram estimulados pela mesma quantidade de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, e os cultivados por três dias exibiram maior propensão para a ruptura da barreira em comparação com os linfócitos T cultivados apenas por dois dias.

Os resultados aqui mostram que as células T estimuladas, mas não seus sobrenadantes, causaram um dano substancial às MBMECs, indicando que o contato direto entre as células T e as MBMECs é essencial para a ruptura da barreira. Por outro lado, a adição do inibidor da granzima B dois ao cultivo de células T restaurou a integridade das MBMECs em maior grau, destacando a molécula citolítica como um agente importante no dano às MBMECs e na subsequente redução do TEER. Uma vez dominado, este experimento pode ser realizado em 12 dias, se for executado corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de escolher o ponto de tempo correto para montar o co-cultivo de células T e células endoteliais.

Após este procedimento, outros ensaios podem ser empregados, como microscopia por imunofluorescência, citometria de fluxo e ensaios de probabilidade. Para abordar questões adicionais, como: Como essa interação afeta a expressão das moléculas das junções apertadas, a permeabilidade e o grau de transmigração de linfócitos T? Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neuroimunologia explorarem distúrbios autoimunes do SNC em camundongos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como avaliar os efeitos diretos entre linfócitos T ativados e células endoteliais em relação à integridade e permeabilidade da barreira hematoencefálica.