Utilizando os ácidos biliares e multi-fluorados

O objetivo geral deste procedimento é rotular ácidos biliares com flúor natural e não radioativo para a medição de sua concentração na vesícula biliar por meio de ressonância magnética, a fim de avaliar o transporte de ácidos biliares em animais vivos. Essa abordagem tem potencial para identificar indivíduos com diarreia crônica que deveriam ser tratados por má absorção de ácidos biliares. As principais vantagens dessa abordagem são a ausência de exposição à radiação ionizante e seu grande potencial translacional para pesquisa e prática clínicas.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando percebemos que, nos Estados Unidos, não existem testes clínicos práticos para detectar o transporte intestinal de ácidos biliares prejudicado. Comece preenchendo uma seringa de um mililitro com o volume apropriado da solução estoque de ácido biliar marcado com flúor e fixe uma agulha curva para gavagem gástrica com ponta em forma de lâmpada, de 20 polegadas e 1,5 polegada. Em seguida, use o polegar e o indicador para segurar firmemente o camundongo pela pele solta na parte posterior do pescoço e os demais dedos para segurar a pele na região lombar e na cauda.

Mantendo o animal em posição vertical, introduza a agulha de gavagem ao longo do lado e do teto da boca, passando pelo esôfago até o estômago. No ponto final experimental apropriado, faça uma incisão mediana na pele abdominal, do púbis até o processo xifoide, seguida por uma incisão correspondente na camada peritoneal para expor os órgãos abdominais sem perfurar o diafragma. Em seguida, utilize um grampo de cinco polegadas para levantar o processo xifoide, expondo a cavidade abdominal superior.

Usando pinças e um instrumento rombo, dissecar e mover o fígado para o lado para revelar a vescícula biliar. Em seguida, posicionar um grampo de quatro polegadas sobre o ducto biliar comum e seccionar o ligamento que prende o pólo superior da vescícula biliar ao diafragma, permitindo que a vescícula biliar seja movida para o lado direito do abdômen. Ter cuidado e clampar o ducto biliar comum o mais rapidamente possível após a laparotomia para evitar laceração do fígado ou o esvaziamento inadvertido da vescícula biliar.

Após a exsanguinação, transfira o sangue coletado para um tubo heparinizado de 1,5 mililitro para centrifugação. Precipite o plasma com quatro partes de acetonitrila e centrifugue a amostra de sangue novamente. Em seguida, analise o sobrenadante por cromatografia líquida e espectroscopia de massas.

Para liberar a vesícula biliar, realize uma dissecação romba do tecido circundante seguida pela secção do ducto biliar comum abaixo do grampeamento. Pese a vesícula biliar colhida, em seguida coloque o tecido em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e remova o fígado. PARA extrair os tecidos, adicione acetonitrila a 75% e água a 25% e homogeneíze aproximadamente 100 miligramas do fígado e toda a vesícula biliar em homogeneizadores de tecido de vidro 21 de tamanho individual, sobre gelo.

Transfira as amostras para um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro e centrifugue. Em seguida, dilua os extratos conforme apropriado e quantifique o teor de ácidos biliares utilizando cromatografia líquida e espectroscopia de massas. No ponto final experimental apropriado, limpe a parte interna da coxa esquerda do camundongo anestesiado e insira um cateter com agulha de 24 gauge por 0,75 polegada subcutaneamente através da coxa até a cavidade abdominal.

Remova a agulha, deixando o cateter intraperitoneal no lugar. Transfira o camundongo para a maca do animal do scanner de MRI e conecte uma almofada térmica com controle de temperatura. Conecte o cateter a um segmento de 72 polegadas de tubo estéril e conecte o tubo a uma seringa estéril de 1 mililitro para manutenção da anestesia durante todo o procedimento.

Após confirmar que não há metais próximos ao escâner, utilize uma bobina de ressonância magnética volumétrica linear com dupla sintonia para flúor e próton para transmitir e receber os sinais de radiofrequência. Em seguida, utilize uma sequência fast low angle shot para obter imagens do couro cabeludo em três cortes, a fim de calibrar o sistema e verificar a posição do animal. Para iniciar o experimento, clique no botão de semáforo para adquirir imagens de ressonância magnética multiplanares de prótons utilizando a sequência de aquisição rápida com relaxamento e realce na visão transversal da amostra.

Por fim, clique no botão GOP na janela da ferramenta de controle do espectrômetro para adquirir imagens de flúor utilizando uma segunda sequência rápida de ângulo baixo na mesma região. Com este método, pode-se medir uma concentração altamente seletiva de ácido biliar multifluorado, ou MFBA, na vesícula biliar que é mil vezes maior do que os níveis observados no fígado ou no plasma, o que é incompatível com os níveis fisiológicos de ácidos biliares. Como esperado pela fisiologia da circulação entero-hepática dos ácidos biliares, as concentrações máximas de MFBA na vesícula biliar tornam-se evidentes entre quatro e sete horas após a administração oral.

De fato, duas horas e meia a quatro horas após a gavagem oral com MFBA, observam-se sinais de flúor provenientes do que parece ser o ducto biliar comum e um sinal mais intenso proveniente da vesícula biliar. Entre sete e oito horas e meia, o sinal do ducto biliar comum já não é mais detectado e o sinal de flúor na vesícula biliar aumenta até atingir a mesma intensidade do sinal proveniente do fantom de MFBA adjacente. Em camundongos deficientes no transportador apical de ácidos biliares dependente de sódio, que apresentam captação intestinal reduzida de ácidos biliares, ocorre uma redução de aproximadamente 22 vezes na concentração de MFBA em comparação com animais selvagens controlados.

De fato, enquanto um sinal de flúor robusto é detectado nas vesículas biliares de camundongos selvagens, não há sinal de flúor correspondente em animais deficientes no transportador apical de ácidos biliares dependente de sódio, confirmando tanto que os MFBA são processados de maneira semelhante aos ácidos biliares fisiológicos quanto que a ressonância magnética com MFBA pode ser utilizada para detectar a absorção intestinal prejudicada de ácidos biliares. Uma vez dominada e realizada corretamente, a laparotomia, a coleta de sangue e a incisão da vesícula biliar e do fígado podem ser concluídas em até 20 minutos. A aquisição de sinais durante a ressonância magnética levará de uma hora e meia a duas horas.

Após seu desenvolvimento e comercialização, esta técnica tem o potencial de abrir caminho para a exploração do papel do transporte de ácidos biliares intestinais na fisiologia e na doença, tanto em animais pequenos quanto em humanos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como administrar ácidos biliares marcados com substâncias estranhas a animais pequenos e como medir sua captação no fígado e na vesícula biliar por meio de ressonância magnética ou dissecção de órgãos.