Name: A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas de fluido amniótico murino usando um sistema transposon não viral. Este método oferece uma alternativa segura para terapias personalizadas antes do nascimento.

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Este trabalho foi financiado pela Bolsa da Fundação CARIPARO número 13/04 e pela Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Concessão número 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin e Michela Pozzobon são financiadas pela Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin é financiada pela Bolsa da Fundação CARIPARO número 13/04. Paolo De Coppi é financiado pela Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Todos os procedimentos estavam de acordo com a lei italiana. amostras murino AF foram colhidas a partir de ratos grávidas em 13,5 dias post coitum (DPC) de camundongos C57BL / 6-Tg camundongos (UBC-GFP) 30Scha / J chamada GFP. Produção 1. Transposon NOTA: Os vectores de expressão transposões foram gerados utilizando procedimentos de clonagem padrão. O DNA de plasmídeo para a transfecção de células de rato AF foi preparado utilizando-se kits comerciais. <ol><li> Misturar 10 ng de ADN de plasmídeo com 50 uL de bactérias DH5a num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar o tubo de microcentrifugadora em gelo durante 20 min. </li><li> O choque térmico a 42 ° C durante 40 seg. </li><li> Coloque tubo de microcentrifugadora em gelo durante 2 min. </li><li> Adicionar 250 ul de caldo pré-aquecido (37 ° C) caldo lisogenia (LB). Agitar (300 rpm) a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Espalhe 30 ul de cada transformação em placas LB com 0,1 mg / ml de ampicilina. Permitir que as placas para secar e incubar invertida a 37 ° C OVernight. </li><li> No dia seguinte, na parte da tarde, escolher 3 colónias, usando estéreis 200 dicas ul, de cada transformação e transferir para 0,1 mg / ml de LB amp. </li><li> Agitar bactérias (300 rpm) durante a noite a 37 ° C. </li><li> Para a purificação do plasmídeo usar kits comerciais. plasmídeos de Stock a -20 ° C. </li></ol> 2. embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEF) Cultura <ol><li> Revestimento das placas de 6 poços com 0,1% de gelatina <ol><li> revestir placas sob o capô adição de 1 ml de solução estéril de gelatina a 0,1% a cada um dos seis poços. Deixe a gelatina polimerizar na incubadora (37 ° C) durante 1 h. </li><li> Descartar o excesso, e secar as placas durante 1 hr. </li><li> Use parafilme para vedar e armazenar as placas à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Inactivação de MEF com mitomicina C <ol><li> Descongelar um frasco de 4 x 10 6 células MEF usando um banho de 37 ° C. </li><li> Semente MEF na capa em uma placa de Petri (150 mm) com meio MEF. </li><li> Cultivar as células a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> (CUIDADO) Adicionar mitomicina C (5 mg / mL) quando as células estão confluentes. </li><li> Colocar as células em uma incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) durante 3 h. </li><li> Remova o meio de células com mitomicina C. Lavar três vezes com solução salina de tampão fosfato 1x (PBS). </li><li> Adicionar 2 ml de tripsina as células e colocar em comerciais a 37 ° C incubadora durante 5 min. Depois, adicione 18 ml de meio de bloqueio para parar a reacção de tripsina. </li><li> Contar as células utilizando uma câmara de Burker de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> células centrifugar a 145 xg por 5 min. Descartar o sobrenadante. </li><li> Semente 60.000 células / cm 2 de MEF inactivado em placas revestidas com gelatina a 0,1%. </li><li> Cultivar as células durante 24 h a 37 ° C e CO2 a 5%, antes da semeadura AF e / ou células IPS-AF. </li></ol></li></ol> 3. Rato AF isolamento de células <ol><li> Configurar acasalamentos cronometrados e verificar plu vaginalgs após 24 h de co-habitação. </li><li> Observe até 13,5 dpc e sacrificar barragem grávida por deslocamento cervical. </li><li> Limpar a parede abdominal do animal, por meio de 70% de etanol. </li><li> Com uma tesoura, realizar uma laparotomia mediana incisão do comprimento da parede abdominal para ter acesso para a cavidade abdominal. </li><li> Expor o útero usando uma pinça. Remover o útero com uma tesoura e transferir para um prato de 100 milímetros de Petri estéril cheio com PBS 1x colocadas em gelo. </li><li> Use uma lupa para recolher o AF em aumento de 10x. </li><li> Segure o útero com uma pinça e retire a parede uterina com uma tesoura. Tenha cuidado para evitar qualquer dano às membranas fetais e consequente fuga de líquido amniótico. </li><li> Recolha fetos em uma placa de Petri 100 milímetros preenchido com estéril 1x PBS e colocar no gelo. </li><li> Segure a placenta de um feto com uma pinça fina ponto e lugar em um 100 milímetros placa de Petri limpa. </li><li> Retire o saco vitelino usando uma pinça de ponta fina. </li><li&gt; Interromper o âmnio usando uma pinça de ponta fina e recolher 30 ul de AF para cada feto usando uma seringa de insulina em um 15 ml frasco cónico. </li><li> Após a recolha de AF, lavar cada feto com PBS estéril 1x suplementado com 1% de soro fetal de bovino (FBS) e recolher nas tubo de 15 ml contendo o AF. </li><li> Centrifugar AF a 145 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante sob o capô e semear as células AF peletizadas. </li></ol> Cultura de Células 4. Rato AF <ol><li> Semeadura de células de camundongo AF <ol><li> Um dia antes da semeadura, preparar uma solução a 0,1% placa de 6 poços revestidos com gelatina com MEF tratado com mitomicina C. </li><li> Após a coleta AF, semear as células obtidas a partir de uma amniocentese (cerca de 1 x 10 7 células obtidas a partir de 6 fetos) sobre o MEF mitoticamente inactivados utilizando meio de cultura AF. </li><li> Cultivar as células a 37 ° C e 5% de CO 2, mudando o meio todos os outros dias. </li><li> Após 7 dias de cultura, transcélulas fect AF seguintes o procedimento descrito abaixo. </li></ol></li></ol> 5. A transfecção, geração de células iPS-AF e Cultura NOTA: As células de ratinho AF foram transfectadas com o plasmídeo transposão PB-tetO2-IRES-OKMS, em conjunto com um plasmídeo de expressão de transposase (mPBase) e com o transactivador de tetraciclina reversa plasmídeo transposão (PB-CAG-rtTA). Todos os plasmídeos foram fornecidas pelo professor Andras Nagy 33. <ol><li> Misturar 1 ug de PB-tetO2-IRES-OKMS com 0,5 ug de mPBase e 0,5 ^ g de OP-CAG-rtTA (ADN total: 2? G) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Dilui-se o ADN a 100 uL de meio isento de soro (Dulbecco Modified Eagle Médium - DMEM). </li><li> Adiciona-se 8 mL de reagente de transfecção (por exemplo, FuGENE) (na proporção de ADN de plasmídeo: O agente de transfecção de 2 ug (ADN) para o agente de transfecção de 8 uL) contendo o ADN em 1,5 mL tubo de microcentrífuga. </li><li> Incubar mistura reagente / transfecção de DNA durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar gota a gota 100 uL da mistura de reagentes de transfecção / ADN por poço para uma placa de 6 poços com células AF rato e distribuir por uma agitação suave, com um volume final de 2 mL / poço. Deixe por 24 h. </li><li> No dia seguinte, induzirem a expressão de factores do Yamanaka (Oct4, KLF4, cMyc, Sox2), alimentando as células com meio fresco IPS-AF suplementado com 1,5 ug / ml de doxiciclina (2 mL de meio para cada poço). </li><li> Alimentar as células a cada dia, sem passagem, por meio fresco contendo DOX (manter as células em meios suplementados com doxiciclina até que ponto 5.13). </li><li> Observar células no prazo de 24 h para a expressão mCherry e diariamente para a formação de colónias (colônias aparecem normalmente entre 20 e 30 dias após a transfecção). </li><li> Um dia antes da colheita de colónia, preparar uma placa de cultura de tecidos de 96 poços com MEF tratado com mitomicina C. </li><li> Escolha colónias individuais em 50 ul de volume de Utilizanga 200 uL pipeta, e transferi-los sequencialmente para uma placa de 96 poços, em poços individuais. </li><li> No dia seguinte, dissociar cada colónia em células isoladas através da adição de 50 ul de tripsina comercial e incubar durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Pipeta cima e para baixo para desagregar a colônia. </li><li> Transferir 50 uL da tripsina contendo a colónia dissociada em um novo bem com MEF inactivada numa gelatina 0,1% revestidos de 96 poços da placa cheia com 100 uL de meio de IPS-AF fresco suplementado com doxiciclina. </li><li> Quando as células atingem 60-70% de confluência, divididas em um poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Quando as células atingem 60-70% de confluência, divididas 1: 2 a dois poços, uma com a doxiciclina e o outro sem doxiciclina, para verificar se colónias aparecem também na condição sem doxiciclina. </li><li> Continuar a manter clones iPS-AF, doxiciclina independente, em MEF inativada no meio iPS-AF. </li><li> Células a 37 ° C e 5% de CO 2, CH cultivaranging média diária. </li></ol> 6. Coloração de Fosfatase Alcalina <ol><li> Realização da coloração da fosfatase alcalina seguindo o protocolo do fabricante, sempre que haja o aparecimento de células IPS-AF independentes doxiciclina. </li></ol> 7. imunofluorescência <ol><li> Sempre que haja o aparecimento de doxiciclina células independentes IPS-AF, sementes 150.000 células / cm2 em um poço de uma placa de 24 poços com MEF inactivado, e crescer as células durante 48 h a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> (CUIDADO) Fixar as células por adição de 300 ul por poço de 4% de paraformaldeído (PFA) durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 300 uL de 0,1% de NP-40 para permeabilizar as células. </li><li> Lavar as células com 300 uL de 0,1% de PBS-Tween 20. </li><li> Adicionar 300 ul de tampão de bloqueio (soro de cavalo a 10% em 1x PBS) durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Utilize os seguintes anticorpos primários: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), KLF4 (1:80), NANOG (1:100) e SSEA1 (1:80). Diluir SSEA1 com 1% de albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra normal a 10%, 0,3 M de glicina em 0,1% PBS-Tween-20. Dilui-se todos os outros anticorpos com soro de cavalo a 10% em PBS 1x. </li><li> Incubar anticorpos durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar com 300 ul de 0,1% de PBS-Tween-20. </li><li> Use os anticorpos secundários diluídos em soro de cavalo a 10% em PBS 1x: cabra Alexa594-conjugado anti-IgG de ratinho (1: 200), IgG de galinha anti-cabra Alexa594-conjugado (1: 200), Alexa594-conjugado de galinha anti-IgG de coelho (1: 200), Alexa568 de cabra conjugado com anti-rato de IgM (1: 200). Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe com 1x PBS. </li><li> núcleos mancha com solução de Hoechst (1: 10.000) em 1x PBS. </li></ol> 8. In Vitro Cell Differentiation <ol><li> Para formar pendurados gota corpos embrióides (EBS), cultivar gotas individuais (2.000 células / 20 ul) sobre a tampa da placa de Petri, utilizando o meio de diferenciação. </li><li> Incubar os pratos a 37 ° Ce 5% de CO 2 durante 4 dias. </li><li> Transferir EBs em 100 mm pratos de grau bacteriana na cultura em suspensão durante 3 dias em meio de diferenciação. </li><li> EBs prato em 24 poços, placas revestidas com matriz de membrana basal (diluído 1:10 em DMEM) durante mais 14 dias. </li><li> Para as análises de imunofluorescência, usam anticorpos primários: T (1: 100), αfp (1: 200) e Tubb3 (1: 500) 37. </li></ol> 9. Formação In Vivo teratoma <ol><li> Injectar 100 ul de 1x PBS contendo 1 x 10 6 células IPS-AF no músculo do membro posterior de RAG2 - / - yc - / - ratos. </li><li> Sacrificar os ratos por deslocamento cervical 6 semanas após a injeção de células. </li><li> Retirar as massas tumorais, que se distinguem pelo seu tamanho, a partir do membro posterior de ratinhos para as análises seguintes. </li><li> Cortar 7-10 uM secções transversais de espessura de tumor isopentano-congelado utilizando um criostato. </li><li> Para Hematoxilina umd Eosina (HE) Stain: <ol><li> Mancha com HE para avaliar a composição do tecido do tumor, seguindo o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Para Stain imunoperoxidase: <ol><li> Fix secções teratoma com PFA a 4% durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Permeabilizar com 0,1% de Triton X-100. </li></ol></li><li> Incubar com os anticorpos seguintes: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) e αSMA (1: 100) diluída em BSA a 1% em PBS 1x. Incubar durante 1 hora a 37 ° C (para Tubb3) ou durante a noite a 4 ° C (para os outros anticorpos). </li><li> peroxidase de bloco utilizando metanol a 100% durante 20 min. </li><li> Incubar durante 45 min a 37 ° C com anticorpo secundário conjugado com HRP (1: 150) anti-rato. </li><li> Enxágüe com 1x PBS. </li><li> Incubar com peroxidase de substrato (HRP) (Ver Materiais Tabela) durante 5 min. </li><li> Lavar com água da torneira durante 5 min. </li><li> Mancha com Hematoxilina QS para 9 seg. </li><li> Lavar com água da torneira. </li></ol&gt; 10. A extracção de ARN a partir de células <ol><li> Usar um kit de extração de RNA comerciais de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. </li></ol> 11. A extracção de ARN a partir de teratoma <ol><li> Homogeneizar o teratoma usando um pilão e nitrogênio argamassa e líquidos para evitar o descongelamento da amostra. </li><li> Pesar 25 mg de tecido. </li><li> Adicionar 1 ml de reagente comercial para extração de RNA e 200 mL de clorofórmio. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Centrifuga-se a 13000 xg e 4 ° C durante 15 min. </li><li> Transferir o sobrenadante clarificado para um tubo novo. </li><li> Para purificar o ARN utilizar um kit de extração de RNA comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> 12. Transcrição Reversa-polimerase Análise Chain Reaction <ol><li> Sintetizar a primeira cadeia de ADNc utilizando uma transcriptase reversa para a transcrição inversa (RT) -polimerase reacção em cadeia (PCR) e o oligo acor (dT)Ding com o protocolo do fabricante, para se obter 50 ng / uL de ADNc. Dilui-se com ADNc de água isenta de RNase na concentração de 10 ng / mL. </li><li> Realizar RT-PCR utilizando a polimerase de ADN de acordo com o protocolo do fabricante, utilizando 1 ng / uL de ADNc. </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método escolhido para se obter a indução de pluripotência é relevante para segurança clínica célula no que diz respeito ao transplante a longo prazo. Hoje em dia, existem vários métodos adequados para a reprogramação. Entre os métodos de não-integrativos, a viral (SeV) Sendai vector é um vírus de ARN que pode produzir grandes quantidades de proteína, sem integração no núcleo das células infectadas e 40 podia ser uma estratégia para a obtenção de células iPS. vectores SeV poderia ser um candidat...

Diagnóstico pré-natal é uma importante ferramenta clínica para avaliar doenças genéticas (ou seja, aberrações cromossômicas, doenças monogenéticos ou poligenéticos / multifactorial) e malformações congênitas (hérnia diafragmática congênita ou seja, lesões pulmonares císticas, onfalocele, gastrosquise). As células do líquido amniótico (AF) são simples de se obter a partir de procedimentos de rotina programadas durante o segundo trimestre de gravidez (ou seja, a amniocentese e amnioreduction) ou cesarianas 1, 2. A disponibilidade de células pré-natais de FA a partir de pacientes ou de neonatais proporciona a possibilidade de utilizar esta fonte para a medicina regenerativa, e vários investigadores investigaram a possibilidade de tratar diferentes doenças ou danos de tecidos utilizando uma população de células estaminais isolado a partir de AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. A possibilidade de obter facilmente células AF de pacientes doentes, em uma janela de tempo em que a doença é muitas vezes parado, abre o caminho para a idéia de usar esta fonte de células para fins de reprogramação. Na verdade,-tronco pluripotentes induzidas (iPS células) derivadas de células AF poderia ser diferenciadas em células de interesse para testes in vitro de droga ou de abordagens de engenharia de tecidos, a fim de preparar uma terapia adequada e específica no paciente antes do parto. Muitos estudos já demonstraram a capacidade das células AF de ser reprogramado e diferenciadas em uma ampla gama de tipos de células 13, 14, 15, 16, 17 &lt;/ sup&gt;, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. Desde a descoberta por Takahashi e Yamanaka 28 de células somáticas reprogramadas através da expressão forçada de quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, cMyc e KLF4), os progressos têm sido feitos no campo da reprogramação. Considerando os diferentes métodos, pode-se distinguir entre as abordagens virais e não virais. A primeira espera que o uso de vectores virais (retrovírus e lentivírus), que têm alta eficiência, mas geralmente incompleta silenciamento do transgene retroviral, tanto com a consequência de uma linha de células parcialmente reprogramados e o risco deinserção mutagênese 29, 30, 31. O método não-viral utiliza diferentes estratégias: isto é, plasmídeos, vectores, ARNm, proteína, transposões. A derivação de células iPS livres de sequências transgênicas visa contornar os efeitos potencialmente prejudiciais de expressão do transgene gotejante e mutagénese de inserção. Entre todos os mencionados estratégias não-virais acima, a piggyBac (PB) sistema de transposão / transposase requer apenas as repetições terminais invertidas flanqueiam um transgene e a expressão transiente da enzima transposase para catalisar a inserção ou excisão eventos 32. A vantagem na utilização de transposões sobre outros métodos para a geração de células IPS é a possibilidade de obtenção de células iPS livre do vector com uma abordagem de vector não virai, que mostra a mesma eficiência de vectores retrovirais. Isto é possível por excisão-traço inferior da codificação de transposão integrada para a reprogramming factores na sequência de uma nova expressão transitória da transposase nas células iPS 33. Dado que o OP é eficaz em diferentes tipos de células 34, 35, 36, 37, é mais adequado para uma abordagem clínica no que diz respeito aos vectores virais, e permite a produção de células iPS livre de xeno contrariamente aos protocolos de produção virais correntes que usam xenobióticos condições, este sistema é usado para obter as células iPS a partir AF murino. Aqui propomos um protocolo detalhado seguintes trabalhos já publicados para mostrar a produção de clones iPS pluripotentes a partir de células AF rato (células iPS-AF) 38.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri de grau bacteriano de 100 mm&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>Para diferenciação in vitro</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Para AF de camundongo, células iPS-AF e meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Alexa568-conjugado cabra anti-mouse IgM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>Anticorpo secundário (imunofluorescência)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugado com frango anti-cabra IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>Anticorpo secundário (imunofluorescência)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugado frango anti-coelho IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>Anticorpo secundário (imunofluorescência)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugado com cabra anti-camundongo IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>Anticorpo secundário (imunofluorescência)</td></tr><tr><td>Kit de fosfatase alcalina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Fosfatase Alcalina Coloração</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Para seleção bacteriana</td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, para solução de bloqueio. Diluído em PBS 1x</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Para extração de RNA</td></tr><tr><td>DH5&alpha; células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Bactérias para procedimento</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de clonagem <tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>Para MEF, AF de camundongo, células iPS-AF e meio</td></tr> <tr><td>de diferenciaçãoDoxiciclina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>Para expressão de fatores exógenos</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.706</td><td>Para produção de PB</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>Para AF de camundongo, células iPS-AF e meio de diferenciação</td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>Para MEF médio</td></tr><tr><td>Ponta fina fórceps</td><td>F.S.T</td><td>Dumont #5&nbsp;</td><td>Isolamento AF</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>Usado 0,1%, diluído em PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>Para solução de bloqueio. Diluído em PBS 1x</td></tr><tr><td>Hematoxilina QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Detecção de núcleos</td></tr><tr><td>HE&nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Análise histológica do teratoma</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Soro de Detecção</td></tr><tr><td>de Núcleos para Cavalos&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>Para solução de bloqueio</td></tr><tr><td>HRP-conjugado cabra anti-camundongo IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>Anticorpo secundário (imunoperoxidase)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Substrato de peroxidase</td></tr><tr><td>Seringa de insulina com agulha (25 G)</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>Procedimento de amniocentese</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>Coelho policlonal IgG</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>Para AF de camundongo, células iPS-AF e meio de diferenciação</td></tr><tr><td>LB caldo (Lennox)</td> <td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Para crescimento bacteriano</td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>Para células AF de camundongo e iPS-AF médio</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Para diferenciação in vitro. Diluído 1:10 em</td></tr><tr><td>DMEM Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Bloqueio de peroxidase</td></tr><tr><td>MULTIWELL Placa de 24 poços</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>Para diferenciação in vitro Placa</td></tr><tr><td>de 6 poços MULTIWELL</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>Para MEF, AF de camundongo e cultura de células iPS-AF</td></tr><tr><td>Nanog&nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>Coelho policlonal IgG</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>para o AF do rato, as pilhas do iPS-AF e os</td></tr><tr>laboratórios normais <td>S2000</td> do <td>vetor</td><td>do soro da cabra do</td> meio <td>da diferenciação para a solução de obstrução. Diluído em PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>Para permeabilização celular. Diluído em PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>Camundongo monoclonal IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>Para RT-PCR</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (solução)</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, fixador, diluído em PBS</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, livre de Ca2+/Mg2+. Diluído em água estéril para obter PBS 1x</td></tr><tr><td>Penicilina - Estreptomicina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>Para MEF, AF de camundongo, células iPS-AF e meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Placa de Petri (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>Para cultura de MEF, cultura de tecidos</td></tr><tr><td>PiggyBac plasmídeo de expressão de transposase&nbsp;</td><td>Fornecido pelo professor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratório-mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plasmídeo transposon</td><td>Fornecido pelo professor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratório-PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>Para purificação de plasmídeos</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Para purificação de plasmídeos</td></tr><tr><td>Transativador de tetraciclina reversa plasmídeo transposon&nbsp;</td><td>Fornecido pelo professor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratory-rtTA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Para extração de RNA</td></tr><tr><td>Sox2&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>IgG policlonal de cabra</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Camundongo monoclonal IgM</td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptase reversa&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>Para RT-PCR</td></tr><tr><td>T&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>Polimerase de DNA Taq IgG policlonal para coelhos</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Passagem de cultura celular</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>Para permeabilização celular, diluído em PBS 1x</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>Para extração</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de RNA <tr><td>Tubb3&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G712A</td><td>Sigma P1379 monoclonal de camundongo IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td></td><td></td><td>Para permeabilização celular, diluído em PBS 1x</td></tr> <tr><td>e alfa; fp&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td> IgG1<td></td></tr><tr><td>&alfa;SMA&nbsp;</td> monoclonal de camundongo<td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Reagente de Transfecção Monoclonal de IgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de Camundongo <tr><td>(FuGENE HD)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td>Para transfecção de células AF</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>Para realizar amniocentese&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &mu; l dicas</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>70.760012</td><td>Para colher colônias de bactérias</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 inoxidável 25U</td><td>Para realizar amniocentese&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>Para limpar a parede abdominal da mãe grávida</td></tr><tr><td>Placa de Petri para cultura de tecidos (150 mm)&nbsp;</td><td>Falcão BD</td><td>353025</td><td>para expansão MEF</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>Para inativação MEF</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços BD</td><td></td><td>Falcon 353071</td><td>para cultura iPS-AF</td></tr></tbody></table>

a produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido usando um sistema transposon

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são geradas a partir de células somáticas de camundongos e humanos por expressão forçada de fatores de transcrição definidos usando diferentes métodos. Aqui, produzimos células iPS a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus. Todas as linhagens celulares iPS obtidas exibiram características de células pluripotentes, incluindo a capacidade de se diferenciar em direção a derivados de todas as três camadas germinativas in vitro e in vivo. Essa estratégia abre a possibilidade de usar células de fetos doentes para desenvolver novas terapias para defeitos congênitos.

Para avaliar a capacidade de reprogramação, as células do rato AF foram coletados de fetos de ratos GFP. As células foram transfectadas com o plasmídeo circular transposão PB-tetO2-IRES-OKMS, que expressa os factores Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc e KLF4) ligadas à proteína fluorescente mCherry de uma forma indutível doxiciclina, tetraciclina e transactivador reverso (PB- CAG-rtTA) os plasmídeos juntamente com o plasmídeo de expressão de transposase (mPBase). Células de ratinho transfectadas...

Neste estudo, geramos células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e reprogramar células do líquido amniótico murino usando um sistema de transposons. A principal vantagem dessa técnica é que ela é facilmente executada. Em um ambiente terapêutico, células de fetos com doenças humanas podem ser diferenciadas em células de interesse para testes de drogas ou engenharia de tecidos, a fim de preparar de outra forma a terapia específica do paciente antes do parto.Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave de programação. O sistema de transposons é eficiente em diferentes tipos de células. É mais adequado para abordagem clínica em relação a vetores virais e permite a produção de células IPS livres de oxino.Para iniciar o isolamento, limpe a parede abdominal da barragem usando etanol a 70%. Usando uma tesoura, execute uma laparotomia da linha média, incisando o comprimento da parede abdominal para obter acesso à cavidade abdominal. Use uma pinça para expor o útero e, em seguida, excise-o usando uma tesoura.Transfira o útero para um prato de 100 milímetros cheio de 1xPBS estéril e mantenha no gelo. Coloque o prato sob um estereomicroscópio com ampliação de 10X e segure o útero com uma pinça enquanto remove a parede uterina com uma tesoura, tomando cuidado para não danificar as membranas fetais. Reúna os fetos em um prato de 100 milímetros cheio de 1XPBS estéril e coloque no gelo.Segure a placenta de um feto com a pinça de ponta fina e mova-a para um prato limpo de 100 milímetros. Aqui, remova cuidadosamente o saco vitelino. Interrompa o âmnio usando a pinça e usando uma seringa de insulina, colete 30 microlitros de líquido amniótico.Transfira o fluido para um frasco cônico de 15 mililitros. Repita esse processo para cada feto, coletando o fluido no mesmo frasco a cada vez. Em seguida, lave cada feto com 1XPBS estéril suplementado com um por cento de soro bovino fetal e colete-o no tubo cônico de 15 mililitros junto com o líquido amniótico.Centrifugar o tubo a 145 vezes G durante cinco minutos e, em seguida, remover o sobrenadante sob uma capela de fluxo laminar. Ressuspenda as células peletizadas em dois mililitros de meio de cultura de líquido amniótico. Pegue uma placa de seis poços revestida com gelatina de zero vírgula e um por cento contendo fibroblastos embrionários de camundongo tratados com miomicina-C ou MEF e, em seguida, semeie dois mililitros de células na placa.Cultive as células a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono, trocando o meio a cada dois dias. Continue a cultura por sete dias até que as células estejam prontas para a transfecção. Para iniciar a transfecção, em um tubo de microcentrífuga de um vírgula cinco milímetros, misture um micrograma de plasmídeo de transposon com zero vírgula cinco microgramas de plasmídeo de expressão de transposase e zero vírgula cinco microgramas de plasmídeo transativador de tetraciclina reversa.Dilua para 100 microlitros usando d-man. Adicione oito microlitros de reagente de transfecção no tubo de microcentrífuga contendo o DNA. Incube esta mistura por 15 minutos em temperatura ambiente.Tomando a placa de seis poços com células AF de camundongo, adicione gota a gota 100 microlitros da mistura de DNA do agente de transfecção por poço, distribuindo por giro suave com um volume final de dois mililitros por poço. Deixe as células por 24 horas a 37 graus Celsius em cinco por cento de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova o meio de cultura e, em seguida, alimente cada poço de células com dois mililitros de meio iPS AF fresco suplementado com um vírgula cinco microgramas por mililitro de doxiciclina para induzir a expressão dos fatores de Yamanaka.Alimente as células diariamente com meio fresco contendo dox sem passagem deste ponto para a frente. Observe as células sob o microscópio de florescência dentro de 24 horas após o primeiro tratamento com doxicilcina para procurar qualquer expressão de mCherry e diariamente a partir deste ponto para a formação de colônias. Uma vez observada a formação de colônias, escolha colônias individuais em 50 microlitros de meio de cultura de células.Em seguida, transfira-os sequencialmente para poços separados de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços com MEF tratado com mitomicina c. No dia seguinte, adicione 50 microlitros de tripsina a cada poço e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius para dissociar as colônias em células únicas. Após a incubação, pipete o líquido para cima e para baixo para desagregar ainda mais as colônias.Transfira 50 microlitros da mistura de células de tripsina para um novo poço contendo MEF inativado e, em seguida, retorne as células para a incubadora. Quando as células atingirem 60 a 70 por cento de confluência, divida-as em um novo poço de uma placa de 24 poços e continue a incubação à temperatura ambiente. Quando essas células atingirem 60 a 70 por cento de confluência, vire as células de um a dois em dois poços, um contendo doxiciclina e outro sem para verificar se as colônias também crescerão na ausência de doxiciclina.Continuar a manter as colônias IPS AF e o meio independente de doxiciclina em MEF inativado a 37 graus Celsius em cinco por cento de dióxido de carbono. Troque o meio diariamente até que as células estejam prontas para coloração, imagem e extração de RNA. Aqui, as células estáveis independentes de doxiciclina induzidas pleuripotentes GFP amnióticas de camundongo expressam os marcadores de pleuripotência necessários para confirmar a reprogramação bem-sucedida.A análise de RTPCR usando células R1 ES como controle mostrou expressão dos marcadores de pleuripotência induzida na presença ou ausência de doxiciclina. A expressão do gene housekeeping, beta duas microglobulina, também foi observada em todos os três tipos de células. Teratomas isolados de camundongos injetados com as células pleuropotentes induzidas foram imunomarcados.A detecção de proteína alfa fetal, actina de músculo liso alfa e beta três tubulina nas massas confirma a diferenciação celular em todas as três camadas germinativas, ectoderma, mesoderme e endoderme. Além disso, a análise RTPCR de corpos embrióides in vitro e células de teratoma in vivo confirma a expressão de genes marcadores específicos da camada germinativa para o mesoderma, endoderme e ectoderma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e reprogramar células do líquido amniótico murino.Este é um procedimento simples e seguro que pode ser aplicado também a células do líquido amniótico humano a partir de uma amostra obtida de diagnósticos de rotina ou cesarianas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

O fibroblasto embrionário de camundongo pode ser reprogramado em células-tronco pluripotentes induzidas com baixa eficiência pela expressão forçada dos fatores de transcrição Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Os raros intermediários da reação de reprogramação são FACS isolados por meio de marcação com anticorpos contra os fabricantes de superfície celular Thy-1.2, Ssea-1 e Epcam.

Marcador de superfície celular Purificação Mediada de iPS Intermediários celulares a partir de um modelo Reprogramável mouse

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Este protocolo descreve um método detalhado para a geração eficiente de iPSCs livres de integração a partir de células sanguíneas periféricas adultas humanas. Com o uso de quatro vetores epissómicos baseados em oriP/EBNA para expressar os fatores de reprogramação, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 e SOX2, milhares de colônias de iPSC podem ser obtidas a partir de 1 mL de sangue periférico.

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas de fluido amniótico murino usando um sistema transposon não viral. Este método oferece uma alternativa segura para terapias personalizadas antes do nascimento.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

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