A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

O objetivo geral deste procedimento é isolar e reprogramar células do líquido amniótico murino usando um sistema de transposons. A principal vantagem dessa técnica é que ela é facilmente executada. Em um ambiente terapêutico, células de fetos com doenças humanas podem ser diferenciadas em células de interesse para testes de drogas ou engenharia de tecidos, a fim de preparar de outra forma a terapia específica do paciente antes do parto.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave de programação. O sistema de transposons é eficiente em diferentes tipos de células. É mais adequado para abordagem clínica em relação a vetores virais e permite a produção de células IPS livres de oxino.

Para iniciar o isolamento, limpe a parede abdominal da barragem usando etanol a 70%. Usando uma tesoura, execute uma laparotomia da linha média, incisando o comprimento da parede abdominal para obter acesso à cavidade abdominal. Use uma pinça para expor o útero e, em seguida, excise-o usando uma tesoura.

Transfira o útero para um prato de 100 milímetros cheio de 1xPBS estéril e mantenha no gelo. Coloque o prato sob um estereomicroscópio com ampliação de 10X e segure o útero com uma pinça enquanto remove a parede uterina com uma tesoura, tomando cuidado para não danificar as membranas fetais. Reúna os fetos em um prato de 100 milímetros cheio de 1XPBS estéril e coloque no gelo.

Segure a placenta de um feto com a pinça de ponta fina e mova-a para um prato limpo de 100 milímetros. Aqui, remova cuidadosamente o saco vitelino. Interrompa o âmnio usando a pinça e usando uma seringa de insulina, colete 30 microlitros de líquido amniótico.

Transfira o fluido para um frasco cônico de 15 mililitros. Repita esse processo para cada feto, coletando o fluido no mesmo frasco a cada vez. Em seguida, lave cada feto com 1XPBS estéril suplementado com um por cento de soro bovino fetal e colete-o no tubo cônico de 15 mililitros junto com o líquido amniótico.

Centrifugar o tubo a 145 vezes G durante cinco minutos e, em seguida, remover o sobrenadante sob uma capela de fluxo laminar. Ressuspenda as células peletizadas em dois mililitros de meio de cultura de líquido amniótico. Pegue uma placa de seis poços revestida com gelatina de zero vírgula e um por cento contendo fibroblastos embrionários de camundongo tratados com miomicina-C ou MEF e, em seguida, semeie dois mililitros de células na placa.

Cultive as células a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono, trocando o meio a cada dois dias. Continue a cultura por sete dias até que as células estejam prontas para a transfecção. Para iniciar a transfecção, em um tubo de microcentrífuga de um vírgula cinco milímetros, misture um micrograma de plasmídeo de transposon com zero vírgula cinco microgramas de plasmídeo de expressão de transposase e zero vírgula cinco microgramas de plasmídeo transativador de tetraciclina reversa.

Dilua para 100 microlitros usando d-man. Adicione oito microlitros de reagente de transfecção no tubo de microcentrífuga contendo o DNA. Incube esta mistura por 15 minutos em temperatura ambiente.

Tomando a placa de seis poços com células AF de camundongo, adicione gota a gota 100 microlitros da mistura de DNA do agente de transfecção por poço, distribuindo por giro suave com um volume final de dois mililitros por poço. Deixe as células por 24 horas a 37 graus Celsius em cinco por cento de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova o meio de cultura e, em seguida, alimente cada poço de células com dois mililitros de meio iPS AF fresco suplementado com um vírgula cinco microgramas por mililitro de doxiciclina para induzir a expressão dos fatores de Yamanaka.

Alimente as células diariamente com meio fresco contendo dox sem passagem deste ponto para a frente. Observe as células sob o microscópio de florescência dentro de 24 horas após o primeiro tratamento com doxicilcina para procurar qualquer expressão de mCherry e diariamente a partir deste ponto para a formação de colônias. Uma vez observada a formação de colônias, escolha colônias individuais em 50 microlitros de meio de cultura de células.

Em seguida, transfira-os sequencialmente para poços separados de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços com MEF tratado com mitomicina c. No dia seguinte, adicione 50 microlitros de tripsina a cada poço e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius para dissociar as colônias em células únicas. Após a incubação, pipete o líquido para cima e para baixo para desagregar ainda mais as colônias.

Transfira 50 microlitros da mistura de células de tripsina para um novo poço contendo MEF inativado e, em seguida, retorne as células para a incubadora. Quando as células atingirem 60 a 70 por cento de confluência, divida-as em um novo poço de uma placa de 24 poços e continue a incubação à temperatura ambiente. Quando essas células atingirem 60 a 70 por cento de confluência, vire as células de um a dois em dois poços, um contendo doxiciclina e outro sem para verificar se as colônias também crescerão na ausência de doxiciclina.

Continuar a manter as colônias IPS AF e o meio independente de doxiciclina em MEF inativado a 37 graus Celsius em cinco por cento de dióxido de carbono. Troque o meio diariamente até que as células estejam prontas para coloração, imagem e extração de RNA. Aqui, as células estáveis independentes de doxiciclina induzidas pleuripotentes GFP amnióticas de camundongo expressam os marcadores de pleuripotência necessários para confirmar a reprogramação bem-sucedida.

A análise de RTPCR usando células R1 ES como controle mostrou expressão dos marcadores de pleuripotência induzida na presença ou ausência de doxiciclina. A expressão do gene housekeeping, beta duas microglobulina, também foi observada em todos os três tipos de células. Teratomas isolados de camundongos injetados com as células pleuropotentes induzidas foram imunomarcados.

A detecção de proteína alfa fetal, actina de músculo liso alfa e beta três tubulina nas massas confirma a diferenciação celular em todas as três camadas germinativas, ectoderma, mesoderme e endoderme. Além disso, a análise RTPCR de corpos embrióides in vitro e células de teratoma in vivo confirma a expressão de genes marcadores específicos da camada germinativa para o mesoderma, endoderme e ectoderma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e reprogramar células do líquido amniótico murino.

Este é um procedimento simples e seguro que pode ser aplicado também a células do líquido amniótico humano a partir de uma amostra obtida de diagnósticos de rotina ou cesarianas.