De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

O objetivo geral deste método é realizar um imageamento de longa duração, de alta resolução e em nível de célula única do pulmão intacto, utilizando uma janela de imageamento estabilizada a vácuo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa do câncer, como, por exemplo, quais interações se estabelecem entre células estromais e tumorais durante as primeiras etapas da metástase. A principal vantagem desta técnica é que o pulmão vivo e intacto pode ser teoricamente visualizado com resolução de célula única por até 12 horas.

Inicie amarrando um segmento de três polegadas de sutura 2-0 a um cateter traqueal, um quarto de polegada acima do encaixe, com um nó duplo. Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos de um camundongo anestesiado e use creme depilatório para remover os pelos do lado esquerdo do animal, desde a linha média do tórax até um quarto das costas e da axila até logo abaixo da caixa torácica. Limpe qualquer excesso de creme e esterilize a pele exposta com etanol 70%.

Em seguida, entube o animal. E amarre o fio 2-0 ao redor do focinho, sob os dentes da frente. Transfira o animal para a área cirúrgica, tomando cuidado para não deslocar os cateteres, e ligue o ventilador.

Conecte o ventilador ao cateter traqueal. Em seguida, fixe o cateter com fita adesiva no focinho e no membro anterior esquerdo ao cateter. Após confirmar a ausência de resposta ao aperto nos dedos dos pés, use tesoura afiada para remover um centímetro quadrado de pele acima da parede torácica esquerda.

Levante a prega de gordura mamária e cauterize quaisquer vasos sanguíneos expostos. Em seguida, resseque a prega de gordura e remova a camada muscular até a caixa torácica, tomando cuidado para não cortar a veia axilar na base do membro anterior. Use pinça para levantar a sexta costela.

Em seguida, segurando a tesoura afiada em um ângulo raso de cinco graus, corte a costela próxima à borda da abertura na pele. Remova quatro costelas consecutivas para alargar a abertura na parede torácica, expondo todo o lobo pulmonar. Em seguida, transfira cuidadosamente o camundongo para a platina do microscópio de imagem.

Com o vácuo desligado, preencha a câmara interna da janela de vácuo com PBS. Inverta o camundongo e posicione o pulmão exposto sobre a janela de imagem com lamínula de vácuo. Lentamente, ligue o vácuo.

Coloque um arnês de contenção, feito de papel-toalha dobrado ao meio, duas vezes sobre o tórax do camundongo e fixe o arnês na placa da platina com fita adesiva. Em seguida, acople um oxímetro de pulso à pata do animal. Depois, posicione a câmara ambiental sobre a platina e ligue o aquecimento para manter o camundongo em temperatura fisiológica.

Quando o animal estiver posicionado, aproxime a objetiva de abertura numérica 25 por 95 da lamínula. No modo de epifluorescência, visualize o canal fitzy e coloque o tecido pulmonar em foco. Em seguida, carregue uma seringa estéril com 100 microlitros da suspensão de células tumorais, remova a seringa de PBS do cateter da veia caudal e conecte a seringa contendo as células tumorais.

Injete lentamente as células tumorais na veia da cauda. Em seguida, reconecte a seringa de PBS ao cateter da veia da cauda e localize as células tumorais em todo o tecido pulmonar por meio da ocular do microscópio. Agora, substitua a seringa de PBS por uma seringa carregada com 100 microlitros de dextrana de rodamina e injete lentamente a dextrana no camundongo por meio do cateter da cauda.

Após a administração da dextrana, realize uma lavagem com 50 microlitros de PBS estéril. Em seguida, obtenha imagens em cada um dos locais previamente identificados de células tumorais para visualizar o fluxo e a integridade da vasculatura. Vinte e quatro horas após a injeção, é possível visualizar células tumorais isoladas interagindo com macrófagos e monócitos dentro da vasculatura.

A estabilidade da imagem é tal que pilhas Z sequenciais do campo podem ser adquiridas e uma reconstrução tridimensional pode ser gerada. Aqui, é mostrado um mosaico de cinco por cinco campos de imagem, cobrindo um campo de visão de 890 mícrons, durante 200 e cinco minutos, a 15 mícrons abaixo da superfície do pulmão de uma única lesão metastática, 12 dias após a injeção. Apesar do grande campo de visão, a alta resolução dos quadros subjacentes, que compõem o mosaico, permite a captura de eventos subcelulares, como a mitose de uma única célula, evidenciada pela separação cromossômica.

A injeção intravascular de um dextrano de alto peso molecular marcado com fluorescência resulta na marcação da luz vascular; no entanto, eritrócitos e leucócitos circulantes não marcados podem ocluir o dextrano. Nos pequenos capilares do pulmão, essa oclusão resulta em um piscar do sinal do dextrano e na perda de definição dos limites vasculares. A alta estabilidade espacial proporcionada por este protocolo permite a média temporal do canal sanguíneo sem desfoque, restaurando assim as oclusões temporárias.

Os outros canais de sinal podem então ser sobrepostos à vasculatura para fornecer uma visão clara dos limites dos vasos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cerca de uma hora, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado para não cortar nenhum vaso sanguíneo grande sem antes cauterizá-lo e de evitar tocar o tecido pulmonar em qualquer momento.

Após seguir este procedimento, é possível visualizar os estágios iniciais da disseminação e proliferação de células tumorais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a imagem intravital no pulmão intacto com uma janela de imagem estabilizada por vácuo. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.