Name: De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprenda a realizar microscopia intravital de longo prazo no pulmão intacto usando janela de imagem estabilizada por vácuo. Esta técnica permite visualização de alta resolução em células individuais por até 12 horas, auxiliando na pesquisa do câncer.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH-CA100324, P30CA013330 de concessão de apoio ao centro de câncer do Einstein National Cancer Institute, R01CA172451 ao JWP e ao Integrated Imaging Program. Essa tecnologia foi desenvolvida no Centro de Biofotônica Gruss-Lipper e no Programa Integrado de Imagem da Faculdade de Medicina Albert Einstein. Reconhecemos o apoio desses Centros neste trabalho. Os autores agradecem a Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon e Anthony Leggiadro da oficina mecânica Einstein por sua habilidade habilidosa e oportuna, ao laboratório de Matthew Krummel por compartilhar generosamente seus desenhos de design de janelas, Kevin Elicieri e Jeremy Bredfeldt por sua experiência em microscopia e suas recomendações de amplificadores e Allison Harney e Bojana Gligorijevic por discussões informativas.

Os autores não têm nada a divulgar.

Alta resolução em imagiologia óptica vivo combinada com etiquetas marcadas fluorescentemente funcionais, tais como proteínas e anticorpos aumentou dramaticamente a nossa compreensão da cascata metastática. Ele permitiu a visualização directa e quantificação de uma única célula e os parâmetros de sub-celulares em células tumorais, células hospedeiras e o seu microambiente. Esta imagem no interior do tumor primário tem levado, por exemplo, para a descoberta de microambientes discretas que são de suporte ...

Imagens de Alta Resolução óptica intravital tem provado ser essencial para a compreensão de diversos processos biológicos, o que permite de uma única célula e os parâmetros de sub-celular a ser medido e quantificado. Em Cancer Research, imagens intravital de células tumorais e do estroma conduziu à descoberta de diversos interacções microambiente 6-11 que estão presentes apenas no animal intacto. Descobertas sobre microambientes associados com intravasation e disseminação de células tumorais no cancro da mama usando imagens de resolução óptica de uma única célula in vivo levou inclusive a novos marcadores de prognóstico e resposta ao tratamento em pacientes com câncer de mama 12-16. As melhores tecnologias de imagem disponível para visualização no fundo de órgãos vitais internos intactos são as modalidades clínicas (MRI, PET, CT), que oferecem excelentes vistas sobre o órgão inteiro e pode revelar patologias mesmo antes de produzir sintomas clínicos. Eles são incapazes, however, para revelar as primeiras fases de metástase e os mecanismos celulares de condução progressão do tumor devido à sua falta de resolução de uma única célula. No momento em que as metástases pulmonares são visíveis nessas modalidades, eles estão bem estabelecidos e em proliferação. Dada a estimativa de que 90% das células disseminadas tumorais que chegam ao pulmão ou não sobrevivem 17 ou inicialmente permanecer dormente 18, e a observação de que chegam muito mais cedo do que anteriormente esperado 19, imaginando os primeiros passos de chegada e sobrevivência torna-se crucial para compreendendo o processo de sementeira metastática e recorrência do crescimento tumoral em locais distantes. A execução dessas observações no pulmão tem se mostrado extremamente difícil no entanto; a grande maioria dos estudos de imagem têm utilizado ex vivo ou explantes preparações 20-23, que só dão uma visão para o pulmão em momentos isolados. Enquanto estas preparações não fornecem informações úteisrmação, eles não dão um completo entendimento das interações, causa e efeito relacionamentos e dinâmicas que ocorrem entre os vários componentes do microambiente. A falta de um sistema circulatório adequado (e concomitante desequilíbrio da homeostase) e a desconexão do resto do sistema imunológico do corpo torna desejoso para validar as conclusões que geram estas preparações em tecido intacto in vivo. Muitos grupos ter realizado imagens intravital do pulmão intacta 2,4,5,24-33 com Wearn alemão e sendo o primeiro a cirurgicamente expor a camada pleural 24 e Terry o primeiro a utilizar uma janela de imagem implantável 25. imagiologia de alta resolução no pulmão é fortemente entravada pelo movimento constante do pulmão e várias técnicas têm sido desenvolvidas para ultrapassar esta limitação. Wagner e Filley 27 estudou o movimento natural do pulmão caninoe projetou seu protocolo cirúrgico para localizar sua janela implantado sobre uma região relativamente estável enquanto Wagner utilizado vácuo na sua janela preparação cirúrgica para imobilizar o tecido 28. Desde essa altura, uma variedade de técnicas têm sido utilizados para a imagem do pulmão incluindo: aperto brônquio, apneia sequencial e imagiologia fechado, aquisição de sobreamostragem, colagem do lobo pulmonar e de vácuo 34. Cada uma delas tem as suas vantagens e desvantagens e não uma técnica emergiu como sendo superior a outro 34. Por exemplo, de aperto e apneia do brônquio sequencial normal de alterar a troca de gases no pulmão e pode causar atelectasia. imaging Fechado e aquisição amostrado não sofrem com essas desvantagens, mas exigem alta velocidade ou equipamentos de imagem especializado não é amplamente acessível. Finalmente, tanto a colagem do pulmão e a técnica do vácuo evitar tanto dos inconvenientes acima mencionados, mas pode apresentar lesão induzida força de cisalhamento se o cuidado de não é Taken. Nos últimos anos, a janela de vácuo foi miniaturizado e adaptado para utilização em ratinhos, utilizando microscopia confocal e multifotônica 4,5,33 e excelente imagem de alta resolução foi atingido 2. A Tabela 1 resume esta história rica e destaca os documentos que descrevem novos avanços no uso de janelas de imagem de pulmão intravital. Este protocolo descreve o uso de microscopia intravital multifotônica lapso de tempo prolongado para a metástase imagem no pulmão vivo, intacto com a resolução mais elevada possível subcelular. As imagens são adquiridas por até 12 horas usando um microscópio multiphoton equipada com uma lente objetiva de alta abertura numérica e detectores múltiplos tubo fotomultiplicador (PMT). modelos de camundongos transgênicos são utilizados para etiqueta fluorescente macrófagos nativas junto com fluorescente alta dextrano de peso molecular e células tumorais proteína transfectadas fluorescentes (de rotular as células da vasculatura e tumorais respectively). Embora esta escolha de células marcadas com fluorescência permite a visualização de interações celulares de macrófagos de células do endotélio de tumor e dinâmicas, este protocolo irá funcionar para qualquer estirpe de rato fluorescente ou não fluorescente. Após a aquisição, o movimento deriva residual (se houver) é eliminado usando um plug-in Fiji 35,36 e personalizados macros tempo médio do canal vascular para eliminar intermitente causada por células do sangue circulante não marcados. Embora este protocolo incide sobre a metástase de imagens, as técnicas são aplicáveis ​​a muitos outros processos biológicos observáveis ​​com imagiologia de uma única célula de alta resolução no pulmão.

<table><tbody><tr><td>Regulador de Vácuo de Latão Niquelado 1/8 NPT Fêmea, com Manômetro, 0 - 20" Hg Aspirador</td><td>McMaster Carr</td><td>4172K12&nbsp;</td><td>Regulador de vácuo</td></tr><tr><td>Adaptador de Mangueira de Latão Farpado para Mangueira de 1/4" ID X 1/8" NPTF Tubo Macho</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>Regulador de Vácuo Adaptador de Mangueira</td></tr><tr><td>Marca Pyrex com Tubulação; Pescoço trabalhado para rolha de borracha nº 4; Capacidade: 50 ml</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>5360-50</td><td>Garrafa de Vácuo</td></tr><tr><td>Redonda de Vidro Espessura #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260368</td><td>Lamínulas Exel</td></tr><tr><td>International Cateteres Descartáveis Safelet I.V.; 22 g x 1 pol.&nbsp;</td><td>Cateter Traqueal</td> <td>Exel International</td><td>26746</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Suturas de Seda Trançadas Pretas, ETHICON LIGAPAK Tamanho do Carretel de Dispensação 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>Corda</td></tr><tr><td>Líquida Super Cola, Transparente, 0.14 oz</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>Cola de Ciano-acrilato</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina isotiocianato&ndash; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD</td></tr><tr><td>Tubo de PVC Tygon transparente de laboratório Dextran, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Espessura da parede, 25 pés de comprimento</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>Thin Tubing & Tubulação para</td></tr><tr><td>Tubulação de Polietileno Resistente a Rachaduras Luer, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Espessura da Parede, Branco, 50 pés. Comprimento&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>5181K24&nbsp;</td><td>Tubulação grossa</td></tr><tr><td>Loção Depilatória</td><td></td> <td>Nair-Micro</td><td></td></tr> <tr><td>Tubo Médico 95 Durômetro LDPE</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Tubulação para cateter de veia caudal</td></tr><tr><td>30 G x 1 pol. Agulha BD PrecisionGlide</td><td>Agulhas BD</td><td>305128</td><td>para cateter de veia caudal</td></tr><tr><td>Puritan Nonsterile Cotton Tipped Swabs&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>Conector de Tubo de Policarbonato Transparente com Fenda Direta, Reduzindo Reto para Tubo de 3/32" x 1/16" ID</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>Conectores entre tubos Rolhas</td></tr><tr><td>de Borracha de Um Furo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-135F</td><td>Tampa para Garrafa de Vácuo</td></tr><tr><td>Pontas de Barreira de Precisão SHARP, Para P-100, 100 &micro; l</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>Ponta de pipeta</td></tr><tr><td>Fita de laboratório</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Saúde Animal</td><td>008897</td><td>Pomada Oftálmica</td></tr><tr><td>Kit de Cauterização de Gêmeos</td><td>Aparelho de Harvard</td><td>726067</td><td>Caneta de Cauterização</td></tr><tr><td>Graefe Micro Dissecação Fórceps; Serrilhada; Ligeira curva; Largura da ponta de 0,8 mm; 4" Comprimento</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>fórceps</td></tr><tr><td>Tesoura de Micro Dissecação Extra Fina 4" Reta Afiada/Afiada 24 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>Tesoura Afiada</td></tr><tr><td>Tesoura Micro Dissecante 4" Reta Blunt/Blunt</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5980</td><td>Tesoura Blunt</td></tr><tr><td>Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>arreio</td></tr><tr><td>Sistema PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>Vitals Monitor</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml, Tuberculina Ponta Deslizante</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Seringa</td></tr><tr><td>Acrilato de Ciano</td><td>Grampos</td><td>LOC1647358</td><td>Adesivo de Lamínula</td></tr> de <tr><td>Vaselina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086291 Adaptador de</td><td>Barreira de Água</td></tr><tr><td>Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm</td><td>Aparelho Harvard</td><td>Conector de</td><td>Cateter</td>734118</tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT oxímetro de pulso</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Oxímetro</td></tr><tr><td>de pulso Isoethesia (isoflurano)</td> <td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Válvula de esfera de PVC, Push to Connect, 1/4 In</td><td>Grainger</td><td>Ventilador</td> de <td>Válvula de Vácuo</td>3CGJ7</tr><tr><td>para Pequenos Animais</td><td>Harvard Apparatus</td><td>683</td><td>Alternativa está disponível na Kent Scientific: MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM Soro Reduzido Médio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Transfecção Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J</td><td>Ratos Jackson</td><td>Laboratory 026051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Multifotônico</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Alternativa ao escopo personalizado</td></tr><tr><td>Câmara de</td><td>Plásticos de Precisão de Gabinete</td> Ambiental <td>para FV1000</td><td>Alternativa ao gabinete personalizado</td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado</td><td>Solução salina ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Laser Power Meter</td><td>Coherent</td><td>FieldMaxIITOP</td><td></td></tr><tr><td>Cabeça de Medidor de Potência a Laser</td><td></td><td>Coerente PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Clover Fluorescente Proteína Vetor</td><td>Addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sulfato Antibiótico Seletivo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Classificador de Células Fluorescente-Ativado&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Mesh</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96 Placa de Poço</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de 60 mm</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de 10 cm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Laboratório Mouse</td><td>Jackson</td><td>000664&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

de longo prazo de alta resolução intravital microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado janela de imagem

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metástases para locais secundários, tais como o pulmão, fígado e ossos é um evento traumático com uma taxa de mortalidade de cerca de 90% 1. Desses sites, o pulmão é o mais difícil de avaliar utilizando imageamento óptico intravital devido à sua posição fechada dentro do corpo, delicada natureza eo papel vital na manutenção da fisiologia adequada. Enquanto modalidades clínicas (tomografia por emissão de positrões (PET), ressonância magnética (MRI) e tomografia computadorizada (CT)) são capazes de fornecer imagens não invasivas deste tecido, falta-lhes a resolução necessária para visualizar os primeiros eventos de semeadura, com um único pixel consistindo em quase mil células. Os modelos atuais de metastático de pulmão semeadura postulado de que eventos apenas após a chegada de uma célula de tumor são determinística para a sobrevivência e crescimento subseqüente. Isto significa que as ferramentas de imagem em tempo real intravital com resolução de célula única 2 são necessários para definir os fenótipos da CEL semeadurals e testar esses modelos. Embora imagens ópticas de alta resolução do pulmão tem sido realizada utilizando várias preparações ex vivo, estas experiências são tipicamente ensaios ponto de tempo único e são susceptíveis a possíveis artefactos e conclusões erradas devido ao ambiente dramaticamente alterada (temperatura, profusão, citoquinas, etc. ) resultante da remoção da cavidade torácica e sistema circulatório 3. Um trabalho recente demonstrou que a imagiologia óptica intravital lapso de tempo do pulmão intacto é possível usar um vácuo estabilizado janela de imagem 2,4,5 No entanto, os tempos típicos de imagiologia têm sido limitada a cerca de 6 horas. Descrevemos aqui um protocolo para a realização de imagens intravital com lapso de tempo a longo prazo do pulmão utilizando uma tal janela ao longo de um período de 12 h. As sequências de imagens de lapso de tempo obtidos utilizando este método permitir a visualização e quantificação de interações célula-célula, a dinâmica da membrana e perfusão vascular no pulmão. Nós ainda mais dEscribe uma técnica de processamento de imagem que dá uma visão sem precedentes clara da microcirculação pulmonar.

Para demonstrar o tipo de resultados que podem ser conseguidos com este método, as células tumorais injectadas E0771-LG marcadas com o trevo proteína fluorescente na veia da cauda de ratinhos MacBlue 44 em diferentes pontos de tempo antes da cirurgia. Após a cirurgia, 155 kD rodamina dextran marcado foi injectado por via intravenosa para marcar a imagem vasculatura e lapso de tempo foi realizada. Quando imagiologia ...

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

O objetivo geral deste método é realizar um imageamento de longa duração, de alta resolução e em nível de célula única do pulmão intacto, utilizando uma janela de imageamento estabilizada a vácuo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa do câncer, como, por exemplo, quais interações se estabelecem entre células estromais e tumorais durante as primeiras etapas da metástase. A principal vantagem desta técnica é que o pulmão vivo e intacto pode ser teoricamente visualizado com resolução de célula única por até 12 horas.Inicie amarrando um segmento de três polegadas de sutura 2-0 a um cateter traqueal, um quarto de polegada acima do encaixe, com um nó duplo. Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos de um camundongo anestesiado e use creme depilatório para remover os pelos do lado esquerdo do animal, desde a linha média do tórax até um quarto das costas e da axila até logo abaixo da caixa torácica. Limpe qualquer excesso de creme e esterilize a pele exposta com etanol 70%.Em seguida, entube o animal. E amarre o fio 2-0 ao redor do focinho, sob os dentes da frente. Transfira o animal para a área cirúrgica, tomando cuidado para não deslocar os cateteres, e ligue o ventilador.Conecte o ventilador ao cateter traqueal. Em seguida, fixe o cateter com fita adesiva no focinho e no membro anterior esquerdo ao cateter. Após confirmar a ausência de resposta ao aperto nos dedos dos pés, use tesoura afiada para remover um centímetro quadrado de pele acima da parede torácica esquerda.Levante a prega de gordura mamária e cauterize quaisquer vasos sanguíneos expostos. Em seguida, resseque a prega de gordura e remova a camada muscular até a caixa torácica, tomando cuidado para não cortar a veia axilar na base do membro anterior. Use pinça para levantar a sexta costela.Em seguida, segurando a tesoura afiada em um ângulo raso de cinco graus, corte a costela próxima à borda da abertura na pele. Remova quatro costelas consecutivas para alargar a abertura na parede torácica, expondo todo o lobo pulmonar. Em seguida, transfira cuidadosamente o camundongo para a platina do microscópio de imagem.Com o vácuo desligado, preencha a câmara interna da janela de vácuo com PBS. Inverta o camundongo e posicione o pulmão exposto sobre a janela de imagem com lamínula de vácuo. Lentamente, ligue o vácuo.Coloque um arnês de contenção, feito de papel-toalha dobrado ao meio, duas vezes sobre o tórax do camundongo e fixe o arnês na placa da platina com fita adesiva. Em seguida, acople um oxímetro de pulso à pata do animal. Depois, posicione a câmara ambiental sobre a platina e ligue o aquecimento para manter o camundongo em temperatura fisiológica.Quando o animal estiver posicionado, aproxime a objetiva de abertura numérica 25 por 95 da lamínula. No modo de epifluorescência, visualize o canal fitzy e coloque o tecido pulmonar em foco. Em seguida, carregue uma seringa estéril com 100 microlitros da suspensão de células tumorais, remova a seringa de PBS do cateter da veia caudal e conecte a seringa contendo as células tumorais.Injete lentamente as células tumorais na veia da cauda. Em seguida, reconecte a seringa de PBS ao cateter da veia da cauda e localize as células tumorais em todo o tecido pulmonar por meio da ocular do microscópio. Agora, substitua a seringa de PBS por uma seringa carregada com 100 microlitros de dextrana de rodamina e injete lentamente a dextrana no camundongo por meio do cateter da cauda.Após a administração da dextrana, realize uma lavagem com 50 microlitros de PBS estéril. Em seguida, obtenha imagens em cada um dos locais previamente identificados de células tumorais para visualizar o fluxo e a integridade da vasculatura. Vinte e quatro horas após a injeção, é possível visualizar células tumorais isoladas interagindo com macrófagos e monócitos dentro da vasculatura.A estabilidade da imagem é tal que pilhas Z sequenciais do campo podem ser adquiridas e uma reconstrução tridimensional pode ser gerada. Aqui, é mostrado um mosaico de cinco por cinco campos de imagem, cobrindo um campo de visão de 890 mícrons, durante 200 e cinco minutos, a 15 mícrons abaixo da superfície do pulmão de uma única lesão metastática, 12 dias após a injeção. Apesar do grande campo de visão, a alta resolução dos quadros subjacentes, que compõem o mosaico, permite a captura de eventos subcelulares, como a mitose de uma única célula, evidenciada pela separação cromossômica.A injeção intravascular de um dextrano de alto peso molecular marcado com fluorescência resulta na marcação da luz vascular; no entanto, eritrócitos e leucócitos circulantes não marcados podem ocluir o dextrano. Nos pequenos capilares do pulmão, essa oclusão resulta em um piscar do sinal do dextrano e na perda de definição dos limites vasculares. A alta estabilidade espacial proporcionada por este protocolo permite a média temporal do canal sanguíneo sem desfoque, restaurando assim as oclusões temporárias.Os outros canais de sinal podem então ser sobrepostos à vasculatura para fornecer uma visão clara dos limites dos vasos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cerca de uma hora, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado para não cortar nenhum vaso sanguíneo grande sem antes cauterizá-lo e de evitar tocar o tecido pulmonar em qualquer momento.Após seguir este procedimento, é possível visualizar os estágios iniciais da disseminação e proliferação de células tumorais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a imagem intravital no pulmão intacto com uma janela de imagem estabilizada por vácuo. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

Neste vídeo, descrevemos a imagem intravital do pâncreas de um camundongo através de uma janela estabilizada para visualização de longo prazo da dinâmica celular.

Imagem intravital: um método para observação em nível celular do pâncreas de camundongo através de uma janela de imagem estabilizada

Este protocolo descreve a intravital imagem de ratos transgênicos expressando marcadores fluorescentes específicos de célula. Intravital imagem fornece um método não-invasivo para observações de alta resolução em animais vivos usando windows implantáveis, através do qual a visualização microscópica de processos é possível. Este método é especialmente útil para estudar processos longitudinais.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

A imagem in vivo de alta resolução do pâncreas foi facilitada com a janela de imagem intravital pancreática.

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.

Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação cirúrgica de uma janela óptica permanentemente habitante para o tórax murino, que permite imagens intravitais de alta resolução do pulmão. A permanência da janela torna-a adequada ao estudo de processos celulares dinâmicos no pulmão, especialmente aqueles que estão evoluindo lentamente, como a progressão metastática das células tumorais disseminadas.

Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Este protocolo descreve uma nova janela de imagem mamária com uma tampa substituível (R.MIW). A microscopia intravital após a implantação do R.MIW permite imagens longitudinais e de vários dias da glândula mamária saudável e doente com resolução celular durante os diferentes estágios de desenvolvimento.

Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

A microscopia de fluorescência intravital pode ser utilizada para estudar interações leucócito-endotelial e perfusão capilar em tempo real. Este protocolo descreve métodos para imagem e quantificação desses parâmetros na microcirculação pulmonar usando um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo.

Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo

Aqui, apresentamos um protocolo para obter imagens intravitais do pulmão esquerdo de camundongo transplantado usando microscopia de dois fótons. Isso representa uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica e as interações celulares em tempo real após o transplante de pulmão murino.

Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

Aprenda a realizar microscopia intravital de longo prazo no pulmão intacto usando janela de imagem estabilizada por vácuo. Esta técnica permite visualização de alta resolução em células individuais por até 12 horas, auxiliando na pesquisa do câncer.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

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