Name: Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda a realizar gravação patch-clamp de células amácrinas starburst em preparação de retina plana de camundongo. Este método preserva conexões sinápticas verticais e laterais para estudo da neurobiologia retiniana.

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Agradecemos a Joung Jang e Xin Guan pela assistência técnica. Agradecemos ao Dr. Rory McQuiston, da Virginia Commonwealth University, por montar nosso primeiro patch clamp rig e conselhos sobre procedimentos experimentais. Agradecemos ao Dr. Samuel Wu pelas sugestões sobre o registro de grampo de tensão. O trabalho é apoiado por EY013811 de subsídios do NIH, EY022228 e um EY002520 de subsídios do núcleo de visão. C-KC é a cadeira dotada da Alice R. McPherson Retina Research Foundation no Baylor College of Medicine.

A aprovação ética - procedimentos que envolvem indivíduos animais foram conduzidos de acordo com as regras e regulamentos dos Institutos Nacionais de diretrizes de saúde para animais de pesquisa, conforme aprovado pelo Institutional Animal Care e usar comitê de Baylor College of Medicine. 1. externa e Soluções Internas <ol><li> Usar a solução de Ringer de mamífero durante a dissecção retina e como a solução externa na gravação eletrofisiológico subsequente. Preparar a solução de Ringer de mamífero a partir de solução-mãe 10x (sem cálcio) no dia da gravação, e adicionar CaCl2 gota a gota, após 15 minutos de carbogenation (95% O 2 e 5% CO 2). A solução final 1x contém (em mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 e 10 de D-glucose. </li><li> Use duas soluções internas para caracterizar oscilações SAC. Testea utilidade das soluções preparadas em de célula inteira gravações patch clamp prolongados em RGCs rato adulto e armazenar os lotes verificados em alíquotas de 500 uL a -20 ° C até à sua utilização. <ol><li> Para a gravação de membrana oscilação potencial, usar uma solução interna à base de potássio que contém (em mM): 125 de K-gluconato, 8 de NaCl, 4 de ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina (w / v). Ajustar o pH para 7,3 com KOH. </li><li> Para gravação excitatórios e correntes pós-sinápticos de inibição, usar uma solução interna à base de césio que contém (em mM): 100 Cs-metanossulfonato, 8 de NaCl, 4 de ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina ( w / v). Ajustar o pH para 7,3 com CsOH. </li></ol></li></ol> 2. Preparação para o Dia da Gravação <ol><li> Para preparar uma membrana de nitrocelulose com buracos abertos, perfurar manualmente a membrana com um perfurador personalizado feito de uma agulha de seringa embotada 16 G e achatar a membrana entre duas placas de vidro limpo. Para uma whole-montar retina, faça um furo central de 0,2 mm de diâmetro e cercá-lo por 4 furos maiores que são 1-1,2 mm de diâmetro. </li><li> Para fazer um filamento aterro personalizado para carregar solução interna para eletrodos, derreta uma ponta de pipeta 10 ul no meio e gentilmente alongar a parte derretida até que esfria e endurece. Imediatamente antes da utilização, usar uma lâmina de barbear para cortar limpo do filamento até que é ligeiramente mais longo do que as pipetas de patch. </li><li> Puxe pipetas de patch em um extrator programável de tubo de vidro de borosilicato com um filamento interno. Fabricar as micropipetas no dia da experiência e usá-los imediatamente. NOTA: Para ZEC gravação, usamos a seguinte configuração extrator: calor: 484; puxe: 0; velocidade: 25; tempo de atraso: 1; pressão: 400 e um valor de rampa de 462. O OD e ID dos tubos de borosilicato são de 1,65 mm e 1,0 mm, respectivamente. Resistência das pipetas é 10-14 mohms. </li><li> Uma hora antes da colheita de tecidos, descongelar um tubo de solução interna por shaking-lo em um vórtice de&gt; 30 min. </li></ol> 3. Retina Dissection <ol><li> Anestesiar o animal por 4% de isoflurano em oxigênio até que o animal perde a capacidade de resposta a uma pitada dedo do pé. Sacrificar o animal por deslocamento cervical. </li><li> Corte ambos os globos oculares fora os nervos ópticos a 1-2 mm de distância das cabeças do nervo óptico com íris retas-apontou tesoura. </li><li> Rolar os olhos em uma toalha de papel limpa para remover sangue e, em seguida, mergulhe-os em solução de Ringer de mamífero carbogenated. Faça um furo no limbo com uma agulha G 23 e bissetriz os globos oculares cortando ao longo do limbo com micro-tesoura. Retirar a córnea ea lente usando uma pinça fina. <ol><li> Para retinal todo-mount, descascar delicadamente a retina inteira fora do epitélio pigmentado com uma pinça fina e fazer cortes quatro 1,5-2 mm ortogonais a partir da borda em direção à cabeça do nervo óptico. </li></ol></li><li> Mergulhe uma membrana de nitrocelulose soco no prato e gentilmente arraste a retina sobre ele como lado GCL-se. Coloque a cabeça do nervo óptico no orifício central na preparação de uma retina de toda a montagem. Transferir a membrana com a retina no outro prato limpo. Gentilmente achatar a retina com um pincel fino para olhar como uma cruz de Malta e colocar todas as quatro bordas ao longo dos buracos. <ol><li> Se uma fracção da retina é para ser examinado de cada vez, cortar cada ocular preparado a partir do Passo 3.3 em 3-4 pedaços com uma lâmina de barbear com o epitélio pigmentado permanece ligado. Proteger as peças não utilizadas de luz na solução externa carbogenated e usá-los dentro de 12 horas. </li></ol></li><li> Seque a membrana de nitrocelulose com um pedaço de papel de filtro seco e remover a membrana limitadora interna e vítreo com uma pinça e um pincel. </li><li> Certifique-se de que todas as bordas da retina são totalmente ligado à membrana antes de transferir a montagem para a câmara de gravação com uma lamela de vidro selado na parte inferior. Fixe a membrana com graxa de vácuo para a lamínula e rehydratE é a retina com a solução externa. Seja não tomar cuidado para prender as bolhas de ar debaixo da montagem. </li><li> Definir a câmara para o palco de um microscópio vertical. Perfundir a câmara com (34-35 ° C) solução externa carbogenated quente, a uma taxa de ~ 3 mL por min. </li><li> Examinar a retina sob uma lente objetiva de 10x em primeiro lugar e, em seguida, usar uma lente de 60x de imersão em água para ver neurônios GCL e INL sob contraste de interferência diferencial (DIC) e / ou de epifluorescência. Para visualizar ZEC-expressando tdTomato, utilizar uma fonte de luz LED branco em combinação com um filtro de excitação de 554 nm e um filtro de emissão de 581 nm. </li></ol> 4. Whole-cell patch de gravação braçadeira de Flat-mount Retina <ol><li> Filtrar a solução através de um filtro interno da seringa no filamento aterro costume. </li><li> Insira o filamento em uma micropipeta acabada de tirar e dispensar a solução interna perto da ponta até que a solução cobre o fio do eletrodo de prata para&gt;5 mm. Fixar a micropipeta para um suporte de eléctrodo com uma vara de aspiração, através da qual a pressão no interior do eléctrodo pode ser ajustada, empurrando ou puxando o êmbolo de uma seringa de plástico de 10 ml ligado de tubo. </li><li> Encontre a pipeta no âmbito do objectivo e trazê-lo para baixo para ~ 100 mm acima da retina. Sob o modo atual seguidor (I = 0), use DC offset para zero o sinal de tensão DC em pé. Meça a resistência da pipeta sob a pinça de corrente de modo (I Grampo) através da injeção de amplitude fixa correntes onda quadrada através da pipeta enquanto ele está no banho e neutralizar a diferença girando o botão rAcesse. Use a leitura na maçaneta rAcesse para calcular a resistência da pipeta pela lei de Ohm. </li><li> levar lentamente o eletrodo para ~ 10 mm acima da retina. Aplicar a pressão positiva para o eléctrodo. Assista a mudança reflexão perto da ponta da pipeta quando se aproxima da retina. Rapidamente, mas com cuidado forçar a pipeta no GCL e reduzir o pressu positivare imediatamente. </li><li> Mover a pipeta para um neurônio rotulados. Evite entrar em contato com outros neurónios, vasos sanguíneos e endfeet de células Muller. Aplique uma pressão mais positiva se for necessário para evitar o entupimento do eletrodo. </li><li> Posicione a ponta da pipeta perto da linha média de um neurônio rotulados até uma covinha é visível. Solte a pressão positiva e permitir que a membrana plasmática para saltar de volta para a ponta da pipeta. </li><li> Aplicar 20 a 120 pA correntes negativos para a pipeta para ajudar a formação de um selo giga-ohm. Aplicar uma sucção suave, se necessário, para puxar a membrana plasmática para a pipeta. Esperar 5 minutos após a formação de selo para romper a membrana celular. Isso permite que a solução interna derramado foi afastada pelo superfusão. Ruptura da membrana por uma sucção suave. </li><li> Após a ruptura da membrana e ao mesmo tempo no modo de pinça de corrente, ligue o equilíbrio ponte e ajustá-lo usando o botão rAcesse. NOTA: Por uma pequena célula como o SAC, só é necessário ligeiro ajuste, se houver. Alterntivamente, ficha excitatórios e inibitórios correntes pós-sinápticos no modo braçadeira de tensão (V Grampo) por segurando o celular no potencial de reversão de cloreto de (cerca de -75 mV) e glutamato (em torno de 0 mV), respectivamente. Verifique e ajuste a posição da pipeta se necessário para acomodar retina ocasional e / ou deriva micromanipulador. </li><li> Para registar o potencial de membrana ou alteração da corrente antes, durante e após o tratamento farmacológico, preparam sinápticas bloqueadores (por exemplo, CNQX, AP5, picrotoxina, tubocurarina, etc.) e moduladores do canal (por exemplo, flupirtina, dopamina, ácido meclofenâmico, etc.) em fresco o dia do experimento de stocks congelados. Diluir as drogas com solução carbogenated de Ringer. Aplicá-las de uma forma de lote por meio de perfusão. </li><li> Após a gravação, remover suavemente a pipeta da soma. Transferir a montagem da câmara para um prato limpo. Desligar e voltar a ligar a retina para outra membrana de nitrocelulose achatados sem hol perfuradoES para assegurar o nivelamento da retina durante a fixação. </li><li> Fixar a retina por imersão em 4% de paraformaldeído durante 30 min à TA. Remova a retina a partir da membrana de nitrocelulose e lave-o extensivamente com 1x PBS. Revelam a morfologia das células gravadas por O / N coloração com estreptavidina conjugado com corante diluídos em 1x PBS com 0,4% de Triton X-100 a 4 ° C 14. Monte a retina em meio Antifade e observar células gravado utilizando um microscópio de varredura confocal. NOTA: os procedimentos de paraformaldeído, que é volátil e tóxico, deve ser realizado em um projeto de câmara de segurança. </li></ol>

<ol><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+bursting+of+AII+amacrine+cells+underlies+oscillations+in+the+rd1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina.</a> J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).</li>
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<li>Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+oscillations+drive+correlated+spiking+of+ON+and+OFF+ganglion+cells+in+the+rd1+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (1), e86253(2014).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+phosphorylation+of+Cx36+gap+junctions+in+the+AII+amacrine+cells+of+RD+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).</li>
<li>Enoki, R., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+horizontally+sliced+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method of horizontally sliced preparation of the retina.</a> Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Muitos laboratórios têm gravado a partir de neurônios GCL na preparação 15-18 plana de montagem, mas os nossos procedimentos de permitir a gravação de neurônios do INL. Vimos por este meio enfatizar várias etapas que são críticas para as gravações de rotina bem sucedidas. A frescura e achatamento da retina são importantes para penetrar com uma pipeta de gravação. A este respeito, a ligação firme da retina para a membrana de nitrocelulose perfurado é primordial e é conseguida pela ...

Como uma parte facilmente acessível do sistema nervoso central, a retina tem sido por décadas um modelo útil em estudos de neurociência. A marcação genética de neurônios permitiu a caracterização detalhada das conexões sinápticas na retina. Com muitas metodologias disponíveis para examinar a função e a morfologia dos neurônios da retina, a técnica de registro de patch clamp tem sido fundamental em nossa compreensão atual dos sinais transmitidos verticalmente na retina. Esses sinais são originados da absorção de fótons em fotorreceptores e enviados aos centros visuais cerebrais por meio do pico de células ganglionares da retina (RGCs). Apesar de um grande corpo de conhecimento acumulado até agora, a diversidade neural na retina vascularizada de mamíferos permanece sem solução e obstrui a apreciação total dos circuitos retinianos que servem à visão normal. Isso ocorre em parte porque a maioria das gravações foi realizada em fatias da retina para trocar a integridade do circuito lateral pelo acesso a neurônios retinianos mais proximais1-3. Para obter uma imagem abrangente de como a retina calcula os sinais visuais, é desejável registrar os neurônios em montagens planas, nas quais as conexões laterais, grandes e pequenas, podem ser melhor preservadas.
Quando a transmissão sináptica de fotorreceptores para células bipolares é interrompida devido a uma via de sinalização defeituosa do receptor metabotrópico de glutamato 6 (mGluR6) em células bipolares despolarizantes4-6 ou simplesmente como resultado da perda de fotorreceptores em retinas degeneradas7-10, muitos RGCs exibem atividades oscilatórias. Essas oscilações se originam de múltiplas fontes, no entanto, aquela que envolve o acoplamento de junções comunicantes entre células amácrinas AII (AII-ACs) e células bipolares de cone despolarizante (DCBCs) tem recebido mais atenção e, portanto, é melhor compreendida1,7,11. Encontramos outra fonte, que persiste sob bloqueio farmacológico da rede AII-AC/DCBC acima mencionada e impulsiona a oscilação de SACs do tipo OFF em camundongos RhoΔCTA e Nob com retinas deaferentadas7,8,12. Aqui, detalhamos nosso protocolo de preparação de montagens planas de retina para gravação de neurônios INL. Essa abordagem usa linhagens comerciais de camundongos (estoque Jax nº 006410 e 007905) para marcar neurônios colinérgicos da retina pela expressão de proteína fluorescente (tdTomato) que é identificável sob um microscópio fluorescente equipado com óptica de aprimoramento de contraste. Alguns resultados experimentais adquiridos por meio dessa abordagem foram relatados anteriormente4,5,7,13.

<table><tbody><tr><td>Microscópio fluorescente de estágio fixo com DIC</td><td>Olympus</td><td>BX51-WI</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipuladores</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplificador</td><td>A-M System</td><td>AM2400</td><td></td></tr><tr><td>AD conversor</td><td>National Instrument</td><td>NI-USB-6221</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de aquecedor</td><td>Warner Instrument</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Inline aquecedor</td><td>Warner Instrument</td><td>SC-20</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Rainin</td><td>Dynamax</td><td></td></tr><tr><td>extrator de pipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidro com filamento</td><td>King Precision Glass</td><td>Estimulador personalizado</td><td></td></tr><tr><td></td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Sigma S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cs-metanossulfonato</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Seringa filtro</td><td>Nalgene</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>1 ml seringa</td><td>Rainin</td><td></td><td></td>17013002</tr><tr><td>10 &mu; ponta de pipeta l</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-130RL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-488</td><td>ThermoFisher</td><td>S-11223</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td></td></tr></tbody></table>

patch-clamp gravação de células starburst amácrinas em um monte de luxo preparação de deafferentated mouse retina

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

A retina dos mamíferos é um tecido em camadas compostas de vários tipos neuronais. Para entender como os sinais visuais são processados ​​dentro de sua rede sináptica intrincado, registros eletrofisiológicos são frequentemente usados ​​para estudar as conexões entre os neurônios individuais. Nós otimizamos uma preparação plana de montagem para a gravação de patch-clamp de neurônios geneticamente marcados em ambos GCL (camada de células ganglionares) e INL (camada nuclear interna) de retinas de ratos. Gravação de neurônios do INL em planos montagens é favorecido sobre fatias porque as conexões verticais e laterais são preservados na configuração anterior, permitindo que os circuitos da retina com grandes componentes laterais a ser estudado. Temos utilizado este procedimento para comparar as respostas dos neurônios-espelho-partnered em retinas tais como as células amácrinas starburst colinérgicos (ZEC).

Registos representativos de dentro e fora do tipo SACs de uma retina deafferentated rato são mostrados na Figura 1. As células colinérgicas em ambos GCL e INL podem ser identificados de forma confiável por tdTomato fluorescência e direcionados para de células inteiras de gravação patch-clamp sob DIC (Figura 1A) para revelar oscilação de seus potenciais de membrana (top traços) e as correntes sinápticas que dirigi-lo (traços inferiores, Figura 1B)...

Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar gravações de patch clamp em células inteiras de neurônios da retina interna em preparações de retina de camundongo em montagem plana. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da neurobiologia da retina, como a diversidade dos neurônios e suas conexões sinápticas em condições normais e patológicas. A principal vantagem desta técnica é que tanto as conexões verticais quanto as laterais são preservadas, permitindo o estudo de circuitos retinianos com grandes componentes laterais.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a retina é um tecido fino e delicado que deve ser manipulado com grande cuidado e paciência. A prática, no entanto, é a melhor maneira de dominá-lo. Para iniciar este procedimento, role os olhos do camundongo em uma toalha de papel limpa para remover qualquer sangue.Em seguida, mergulhe-os na solução de Ringer mamífera carbogenada. Depois, faça um orifício na córnea com uma agulha de 23 graus e divida os bulbos oculares cortando ao longo da córnea com tesoura microcirúrgica. Em seguida, remova a córnea e o cristalino utilizando pinça fina.Para o montagem total da retina, desprenda cuidadosamente toda a retina do epitélio pigmentado com pinça fina e faça quatro cortes ortogonais de 1,5 a dois milímetros da borda em direção ao disco do nervo óptico. Em seguida, mergulhe uma membrana de nitrocelulose perfurada na placa e arraste suavemente a retina sobre ela com o lado da camada ganglionar (GCL) voltado para cima. Depois, posicione o disco do nervo óptico no orifício central ao preparar uma montagem total da retina.Posteriormente, transfira a membrana com a retina para outro recipiente limpo. Aplane suavemente a retina em formato de cruz de Malta com um pincel fino e posicione todas as quatro bordas sobre os orifícios. Seque a membrana de nitrocelulose com um pedaço de papel-filtro seco e remova o vítreo e a membrana limitante interna com pinça e pincel.Certifique-se de que todas as bordas da retina estejam totalmente aderidas à membrana antes de transferir o conjunto para a câmara de registro com uma lamínula de vidro selada na parte inferior. Fixe a membrana à lamínula com graxa de vácuo e reidrate a retina com a solução externa. Tenha cuidado para não aprisionar bolhas de ar sob o conjunto.Em seguida, coloque a câmara sobre a platina de um microscópio ereto. Perfunda a câmara com solução externa carbogenada a 34 graus Celsius a uma taxa de cerca de três mililitros por minuto. Examine a retina inicialmente com uma lente objetiva de 10x.Em seguida, utilize uma objetiva de imersão em água de 60x para observar os neurônios da LCG e da LCI em DIC e no ajuste de epifluorescência. Para visualizar as CACs que expressam tdTomato, use uma fonte de luz LED branca em combinação com um filtro de excitação de 554 nanômetros e um filtro de emissão de 581 nanômetros. Neste procedimento, filtre a solução interna através de um filtro de seringa para o filamento personalizado de reenchimento.Em seguida, insira o filamento em uma micropipeta recém-puxada e dispense a solução interna próximo à ponta até que a solução cubra o fio do eletrodo de prata por mais de cinco milímetros. Depois disso, fixe a micropipeta em um suporte de eletrodo com uma sucção que permita ajustar a pressão interna do eletrodo empurrando ou puxando o êmbolo de uma seringa plástica de 10 mililitros conectada ao sistema. A seguir, localize a pipeta sob a objetiva e posicione-a a cerca de 100 micrômetros acima da retina.No modo de seguidor atual, use a compensação de CC para zerar o sinal de tensão contínua estacionário. Meça a resistência da pipeta no modo de fixação de corrente injetando correntes em onda quadrada de amplitude fixa através da pipeta enquanto ela está no banho. Neutralize a diferença girando o botão Raccess e use a leitura nele indicada para calcular a resistência da pipeta.Depois disso, aproxime lentamente o eletrodo a cerca de 10 micrômetros acima da retina. Aplique pressão positiva ao eletrodo. Em seguida, observe a mudança no reflexo próximo à ponta da pipeta enquanto ela se aproxima da retina.Rapidamente, mas com cuidado, force a pipeta a penetrar na LCG e reduza imediatamente a pressão positiva. Mova a pipeta em direção a um neurônio marcado e evite o contato com outros neurônios, vasos sanguíneos e os pedes terminais das células de Müller. Aplique mais pressão positiva, se necessário, para prevenir o entupimento do eletrodo.Em seguida, posicione a ponta da pipeta próximo ao neurônio marcado até que uma reentrância seja visível. Então, libere a pressão positiva e permita que a membrana plasmática retorne à ponta da pipeta. Aplique correntes negativas de 20 a 120 picoampères à pipeta para auxiliar a formação de um selo gigaohm.Permitir que a membrana celular volte ao estado normal após a liberação da pressão positiva é importante porque um selo excelente se forma naturalmente entre a membrana e a abertura da pipeta, o que é essencial para preservar a morfologia celular após a gravação. Se necessário, aplique uma sucção suave para puxar a membrana plasmática para dentro da pipeta. Aguarde cinco minutos após a formação do selo para romper a membrana celular, a fim de permitir a remoção da solução interna derramada por meio da superfusão.Após a ruptura da membrana e enquanto estiver no modo de fixação de corrente, ligue o equilíbrio da ponte e ajuste-o usando o botão Raccess. Registre as correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias no modo de fixação de voltagem mantendo a célula em potenciais de inversão. Após o registro, remova suavemente a pipeta do corpo celular.Transfira a montagem da câmara para um recipiente limpo. Em seguida, desative e reative a retina em outra membrana de nitrocelulose planificada, sem furar furos, para garantir o achatamento da retina durante a fixação. O tecido está agora pronto para coloração.Essas imagens mostram que células colinérgicas na camada de células ganglionares (GCL) e na camada nuclear interna (INL) podem ser identificadas com confiança pela fluorescência de tdTomato e direcionadas para gravação com microeletrodo em modo de célula inteira sob contraste de interferência diferencial (DIC). A oscilação de seus potenciais de membrana pode ser revelada por gravação em modo de potencial constante, e a oscilação induzida por correntes sinápticas inibitórias e excitatórias é revelada mantendo-se as células em zero milivolts e menos 75 milivolts, respectivamente, sob condições de fixação de potencial. Aqui, a caracterização histológica pós-gravação das células registradas indica a morfologia dendrítica típica das células amácrinas do tipo SAC e os níveis de estratificação na camada plexiforme interna (IPL).Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de fixar cuidadosa e firmemente o conjunto da membrana retiniana na câmara de gravação e reidratá-lo sem aprisionar bolhas de ar por baixo, de modo a fornecer uma amostra gravável. Após este procedimento, outras técnicas, como gravações por duplo patch clamp, podem ser realizadas para responder a questões adicionais, como se as oscilações de múltiplas células-alvo são impulsionadas pelos mesmos mecanismos sinápticos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de neurobiologia da retina explorarem a sincronicidade das oscilações entre neurônios retinianos vizinhos em retinas com degeneração de fotorreceptores.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como remover o humor vítreo e preparar uma montagem plana da retina para gravação por patch clamp em escala total direcionada a neurônios da retina interna.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

Nós descrevemos um método relativamente simples de transretinal eletrorretinograma (ERG) para a obtenção de gravações photoresponses haste e cone da retina do rato intacto. Esta abordagem tira vantagem do bloco de transmissão sináptica de fotorreceptores para isolar as suas respostas de luz e gravar os usando eléctrodos de campo colocados através da retina plana montado isolado.

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Este vídeo demonstra uma técnica de patch-clamp de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana. Uma pipeta de vidro fina com um eletrodo é usada para abordar as células amácrinas starburst (SACs) dentro da retina. Depois de formar uma vedação, a sucção é aplicada para romper a membrana e formar a configuração de patch clamp de célula inteira. Finalmente, o fluxo de íons através dos receptores sinápticos SAC é medido usando a configuração.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana

Este vídeo demonstra a gravação de respostas pós-sinápticas evocadas por luz em uma preparação de corte de tecido retiniano de camundongo adaptado ao escuro. A fatia da retina é colocada em uma câmara de gravação e uma pipeta de gravação é usada para estabelecer a continuidade elétrica com uma célula ganglionar da retina. Pulsos de luz são aplicados para gerar potenciais pós-sinápticos excitatórios nas células ganglionares, que são registrados pela pipeta.

Respostas pós-sinápticas evocadas por luz em neurônios de fatias de retina de camundongos

Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Demonstraremos como preparar fatias de retina do olho do camundongo e registrar as respostas à luz nos neurônios da retina. Todo o procedimento é realizado em condições adaptadas ao escuro.

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Aprenda a realizar gravação patch-clamp de células amácrinas starburst em preparação de retina plana de camundongo. Este método preserva conexões sinápticas verticais e laterais para estudo da neurobiologia retiniana.

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

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