Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

O objetivo geral deste procedimento é realizar o registro de patch clamp de células inteiras de neurônios internos da retina na preparação da retina de camundongo de montagem plana. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia da retina, como a diversidade de neurônios, suas conexões sinápticas em condições normais e patológicas. A principal vantagem dessa técnica é que tanto as conexões verticais quanto as laterais são preservadas, permitindo que os circuitos da retina com grandes componentes laterais sejam estudados.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a retina é um tecido fino e delicado que deve ser manuseado com muito cuidado e paciência. A prática, no entanto, é a melhor maneira de dominá-la. Para iniciar este procedimento, role os globos oculares do rato em uma toalha de papel limpa para remover o sangue.

Em seguida, mergulhe-os na solução de Ringer de mamíferos carbogenados. Em seguida, faça um furo no limbo com uma agulha de calibre 23 e corte os globos oculares cortando ao longo do limbo com uma microtesoura. Em seguida, remova a córnea e o cristalino usando uma pinça fina.

Para montagem total da retina, retire suavemente toda a retina do epitélio pigmentado com uma pinça fina e faça quatro cortes ortogonais de 1,5 a dois milímetros da borda em direção à cabeça do nervo óptico. Depois disso, mergulhe uma membrana de nitrocelulose perfurada no prato e arraste suavemente a retina sobre ela com o lado GCL para cima. Em seguida, coloque a cabeça do nervo óptico no orifício central ao preparar uma retina de montagem completa.

Em seguida, transfira a membrana com a retina para outro prato limpo. Alise suavemente a retina como uma cruz de Malta com um pincel fino e coloque as quatro bordas sobre os orifícios. Seque a membrana de nitrocelulose com um pedaço de papel de filtro seco e remova a membrana vítrea e limitante interna com uma pinça e um pincel.

Certifique-se de que todas as bordas da retina estejam totalmente presas à membrana antes de transferir o conjunto para a câmara de gravação com uma lamínula de vidro selada na parte inferior. Prenda a membrana à lamínula com graxa a vácuo e reidratar a retina com a solução externa. Tenha cuidado para não prender bolhas de ar embaixo do conjunto.

Em seguida, coloque a câmara no palco de um microscópio vertical. Profuse a câmara com solução externa carbogenada a 34 graus Celsius a uma taxa de cerca de três mililitros por minuto. Examine a retina sob uma lente subjetiva 10x primeiro.

Em seguida, use uma lente de imersão em água de 60x para ver os neurônios GCL e INL sob DIC e a configuração epifluorescente. Para visualizar o tdTomato expressando SACs, use uma fonte de luz LED branca em combinação com um filtro de excitação de 554 nanômetros e um filtro de emissão de 581 nanômetros. Neste procedimento, filtre a solução interna através de um filtro de seringa no filamento de preenchimento personalizado.

Em seguida, insira o filamento em uma micropipeta recém-puxada e dispense a solução interna perto da ponta até que a solução cubra o fio do eletrodo de prata por mais de cinco milímetros. Em seguida, prenda a micropipeta em um porta-eletrodo com um puxão de sucção através do qual a pressão dentro do eletrodo pode ser ajustada empurrando ou puxando o êmbolo de um tubo conectado, seringa de plástico de 10 mililitros. Em seguida, localize a pipeta sob a objetiva e abaixe-a a cerca de 100 micrômetros acima da retina.

No modo seguidor de corrente, use o deslocamento CC para zerar o sinal de tensão CC permanente. Meça a resistência da pipeta no modo de pinça de corrente injetando correntes de onda quadrada de amplitude fixa através da pipeta enquanto ela está no banho. Neutralize a diferença girando o botão Raccess e use a leitura nele para calcular a resistência da pipeta.

Depois disso, leve lentamente o eletrodo a cerca de 10 micrômetros acima da retina. Aplique pressão positiva ao eletrodo. Em seguida, observe a mudança de reflexão perto da ponta da pipeta à medida que se aproxima da retina.

De forma rápida, mas suave, force a pipeta no GCL e reduza a pressão positiva imediatamente. Mova a pipeta em direção a um neurônio marcado e evite entrar em contato com outros neurônios, vasos sanguíneos e pés finais das células de Muller. Aplique mais pressão positiva, se necessário, para evitar o entupimento do eletrodo.

Em seguida, posicione a ponta da pipeta perto do neurônio marcado até que uma covinha seja visível. Em seguida, libere a pressão positiva e deixe a membrana plasmática saltar de volta para a ponta da pipeta. Aplique 20 a 120 picoamperes de correntes negativas na pipeta para ajudar na formação de uma vedação de gigaohm.

Permitir que a membrana celular se recupere após liberar a pressão positiva é importante porque uma excelente vedação formada naturalmente entre a membrana e a abertura da pipeta é importante para preservar a morfologia celular após o registro. Se necessário, aplique uma sucção suave para puxar a membrana plasmática para dentro da pipeta. Aguarde cinco minutos após a formação do selo para romper a membrana celular para permitir a depuração da solução interna derramada por superfusão.

Após a ruptura da membrana e enquanto estiver no atual clamp modo, ligue o equilíbrio da ponte e ajuste-o usando o botão Raccess. Registre as correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias no modo de pinça de tensão, mantendo a célula em potenciais de reversão. Após a gravação, remova suavemente a pipeta do soma.

Transfira o conjunto da câmara para um prato limpo. Em seguida, desconecte e recoloque a retina em outra membrana de nitrocelulose achatada sem fazer furos para garantir o nivelamento da retina durante a fixação. O tecido agora está pronto para coloração.

Essas imagens mostram que as células colinérgicas em GCL e INL podem ser identificadas de forma confiável por fluorescência tdTomato e direcionadas para registro de patch clamp de célula inteira sob DIC. A oscilação de seus potenciais de membrana pode ser revelada pelo registro da pinça de corrente, e a oscilação impulsionada pelas correntes sinápticas inibitórias e excitatórias é revelada mantendo as células em zero milivolts e 75 milivolts negativos, respectivamente, sob as condições de pinça de tensão. Aqui, a caracterização histológica post hoke das células registradas indica a morfologia dendrítica típica do SAC e os níveis de estratificação no IPL.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de prender o conjunto da membrana da retina na câmara de gravação e reidratar sem prender bolhas de ar por baixo de maneira apertada e delicada para fornecer uma amostra gravável. Seguindo este procedimento, outros métodos, como gravações de grampo de patch duplo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se as oscilações das várias células alvo são acionadas pelos mesmos mecanismos sinápticos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia da retina explorarem a sincronicidade da oscilação entre os neurônios retinianos vizinhos em retinas degeneradas com fotorreceptores.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como remover o humor vítreo e preparar uma montagem plana de retina para gravação de patch clamp em escala total direcionada dos neurônios internos da retina.