Name: Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a adquirir imagens 3D de alta resolução de embriões de camundongo usando microscopia episcópica. Esta técnica facilita a análise morfométrica detalhada em biologia do desenvolvimento com equipamento padrão.

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Agradecemos aos Drs. Yichen Huang, Chunming Guo e Zhenfang Zhou por seu suporte técnico. Esta pesquisa foi financiada pelo NIH / NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) e pela American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Todas as utilizações de animais são aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal do Hospital Infantil de Boston. Preparação 1. Amostra <ol><li> acasalamento cronometrada <ol><li> Coloque um C57BL6 tipo selvagem macho e uma fêmea juntos na mesma gaiola. </li><li> Verifique para a formação de um tampão genital cedo na manhã seguinte. A ficha de acasalamento (aka, vaginal ou a ficha cópula) é uma deposição gelatinosa endurecido que bloqueia a vagina. </li><li> Defina a data plugue como embrionária dia 0,5 (e0.5). </li></ol></li><li> O isolamento de embriões de ratinho <ol><li> Eutanásia fêmeas grávidas por asfixia com CO2. </li><li> Coloque ratos supina sobre uma almofada absorvente e spray região abdominal com etanol 70%. </li><li> Levante a pele e fazer uma incisão 5 milímetros inicial na região abdominal caudal usando uma tesoura cirúrgica. Cortar e remover a pele abdominal para expor totalmente os órgãos internos </li><li> Corte perto vagina para remover todo o útero. </li><li> Cortar entre locais de implantação ao longo do corno uterino. Cada segmento ou concepto deve ter apenas um embrião dentro. </li><li> Manter os segmentos uterinas em 1x fosfato gelada solução salina tamponada (PBS). </li></ol></li><li> dissecção embrião <ol><li> Coloque cada concepto em um prato separado com PBS gelado sob um estereoscópio. </li><li> Remover os tecidos uterinos, placenta e, em seguida, membranas fetais utilizando sequencialmente fórceps de dissecação finas. </li><li> Transferir o embrião dissecados para um tubo de 50 ml com 1 x PBS gelado utilizando uma pipeta de transferência grande. Evitar a captação de embriões diretamente com uma pinça para minimizar os danos do tecido. </li></ol></li><li> Fixação <ol><li> Fixar os embriões dissecados em solução de formalina tamponada neutra a 10% a 4 ° C durante mais de 24 horas, com pelo menos 10 volumes de amostra de fixador. </li></ol></li><li> Pré-tratamento <ol><li> Preparar a solução de Compensação: 4M de ureia, 10% glicerol, 4% de dodecilsulfato de sódio (SDS) em água duplamente destilada. </li><li> Substitua o fixador com a Solução de Compensação. </li><li> Rodar suavemente a amostra num agitador à temperatura ambiente durante 1 - 2 semanas. Trocar a solução de compensação uma vez que no segundo e no terceiro dia. O espécime lentamente torna-se clara e translúcida. </li><li> Substitua a solução de Compensação com formalina a 10% e deixar em uma cadeira de balanço para 2 dias. </li></ol></li><li> Desidratação <ol><li> Lavam-se as amostras pré-tratadas com 1x PBS 3 vezes durante 5 minutos cada. </li><li> Desidratar as amostras em uma série de etanol ascendente à temperatura ambiente em uma cadeira de balanço suave. Para os embriões E15.5, usar uma série ascendente de etanol incluindo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% de etanol, 2 horas cada passo. Para os embriões mais velhos, o tempo de incubação deve ser aumentada. </li></ol></li><li> coloração <ol><li> Prepare Coloração Solução: adicione 0.1375 gramas de Eosina Y Disodium Sal e 0,0275 gramas de hemi laranja de acridina (cloreto de zinco) sal a 50 ml de etanol a 100%. Agita-se durante 2 h. Filtrar com papel de filtro. Armazenar à temperatura ambiente e evitar a luz, cobrindo com papel alumínio. </li><li> Transferência da amostra para a solução de coloração, durante 1 h. </li><li> Substitua com solução de coloração fresca e durante a noite mancha. </li></ol></li><li> Infiltração <ol><li> Prepare Infiltração Solução: combinar 100 ml de solução A de JB-4 kit de incorporação, 1,25 g de Catalisador C, 0,275 g de sal dissódico Eosina Y e 0,055 g de hemi laranja de acridina (cloreto de zinco) sal. Mexa para misturar (200 rpm) em um balde de gelo, durante 2 horas, e em seguida, filtrar com papel de filtro. </li><li> Guardar a solução A infiltração a 4 ° C e evitar a luz através da cobertura com uma folha de alumínio. </li><li> Transferir os embriões à infiltração de solução: Solução de coloração (1: 1), e incuba-se durante pelo menos 3 horas num agitador rotativo a 4 ° C. </li><li> Transferir os embriões à infiltração solução e incubar durante 3 hR num agitador numa sala fria. </li><li> Substitua Infiltração Solution uma vez por dia, e deixar em uma sala fria em uma cadeira de balanço suave por mais três dias. </li></ol></li></ol> 2. Embedding <ol><li> Mantenha Solução B e infiltração Solution no gelo. </li><li> Faça Embedding Solution (01:25 de Solução B e infiltração Solution) imediatamente antes da incorporação. </li><li> Orientar a amostra em um molde de incorporação, em seguida, despeje Solution Embedding frio no molde incorporando delicadamente. Re-orientar com um pino, se necessário. </li><li> Use um pino para examinar se a solução Embedding é solidificado. Empurrar para fora o bloco da amostra, e prepará-la, se necessário. </li><li> Reorientar o bloco da amostra usando o molde separado para obter uma orientação cruzada. </li><li> Coloque um suporte de bloco em cima do molde de incorporação. Derramar delicadamente Embedding Solução para dentro do molde até que o molde e o suporte do bloco estão submersos por Incorporação Solution. </li><li> Mantenha a amostra em um recipiente secundário e deixá-loem gelo durante 3-4 horas numa hotte. </li><li> Armazenar as amostras solidificadas numa 4 ° C. </li><li> Descascar o molde de incorporação. Coloque o bloco sob o microscópio estereoscópico com iluminação oblíqua para inspecionar posição da amostra no bloco. Na face do bloco, linhas de grade marca ao redor do espécime. </li><li> Apare o bloco para remover montante acesso de material de incorporação utilizando as linhas de grade marcado como referências. </li></ol> 3. Aquisição de Imagem <ol><li> Prender o bloco de amostra para o micrótomo e obter uma superfície de corte fresco. Definir espessura de corte (por exemplo, e9.5-10.5, 1,5 uM; e11.5-12.5, 2,0 uM; e13.5-15.5, 2,5 uM; E16.5-idosas, 3? M). Mantenha o espécime / bloco na posição inicial de micrótomo. </li><li> Montar o microscópio estéreo zoom horizontal voltada para a superfície do bloco de amostra. </li><li> Ligue o computador e microscópio, e iniciar o software de aquisição de imagem. </li><li> Visualizar e focar as óticas para o bloco-faceno modo &quot;live view&quot; do software de imagem. </li><li> Alinhar microscópio e micrótomo, se necessário, para que o bloco de face é no centro do visor. </li><li> Ajuste o zoom de modo que todo o bloco-face está dentro do visor. </li><li> Escolha filtro verde proteína fluorescente (GFP) (excitação 470 ± 20 nm, dicróica 495 nm, emissão de 525 ± 25 nm) e reorientar, se necessário. </li><li> Medir e definir o tempo de exposição manualmente (por exemplo, 80-400 mini-sec). </li><li> Adquirir imagens do bloco-face depois de cada corte fresco e guardar as imagens automaticamente, se possível. </li><li> Grave parâmetros importantes, incluindo resolução, espessura de corte e zoom. </li><li> Depois de terminar o espécime inteiro, exportação e converter todos os arquivos de imagem para o formato JPEG, se necessário. </li><li> Inverter todas as imagens originais usando um software de processamento de imagens e ajustar o brilho eo contraste. </li><li> Salve todas as imagens processadas em uma pasta separada. </li></ol> 4. 3DVisualização <ol><li> Carregar todos os as imagens transformadas para um software de visualização 3D, seguindo as instruções. </li><li> Resolução de entrada e espessura de corte para converter todas as imagens para dados volumétricos (ou seja, o tamanho voxel) e salve o arquivo 3D. </li><li> Alinhar todas as imagens utilizando o modo automático. Ajustar imagens individuais manualmente, se necessário. </li><li> Salve a imagem alinhada com um novo nome de arquivo. </li><li> Analisar as características morfométricas da amostra usando o software de visualização 3D. </li></ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+Res+C%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).</li>
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<li>Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+mammalian+cloacal+morphogenesis+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dev Biol. 409, 106-113 (2016).</li>
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<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, apresentamos um protocolo modificado utilizando equipamentos de laboratório de rotina para obter imagens HREM de série que são compatíveis para uma rápida visualização 3D e análises morfométricas de estruturas complexas. Porque as imagens de alta resolução são tomadas diretamente da face do bloco, em vez de seções individuais, as características morfológicas finas são preservados e rapidamente reconstruída digitalmente em um programa de visualização 3D. imagens 3D oferece vantagens sig...

O advento das tecnologias de imagem 3D abriu a possibilidade de análise sistêmica de características morfológicas detalhadas durante o desenvolvimento fetal. Uma variedade de modalidades de imagem 3D está agora disponível, incluindo imagem por ressonância magnética micromagnética (micro-MRI), microtomografia computadorizada, ultrassom de alta frequência, tomografia de coerência óptica, tomografia de projeto óptico e microscopia episcópica1-4. Cada modalidade tem suas próprias características únicas em resolução, contraste, velocidade, custo, capacidade e disponibilidade no útero.
A captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) e a microscopia episcópica de alta resolução (HREM) são métodos de imagem de microscopia episcópica4. Aqui, imagens seriais de alta resolução são capturadas continuamente da face do bloco em vez de seções de tecido. As imagens resultantes refletem fielmente características morfológicas detalhadas com mínima ou nenhuma distorção tecidual. Os dados volumétricos adquiridos são prontamente convertidos em imagens 3D de alta resolução adequadas para análise morfométrica precisa. Devido ao custo relativamente baixo e à alta resolução, HREM e EPIC tornaram-se as alternativas superiores para avaliação sistêmica de modelos de camundongos de defeitos congênitos humanos2,4-8.
Ambos os métodos EFIC e HREM exigem que as amostras sejam incorporadas no meio adequado. O EFIC detecta a autofluorescência emitida pelo tecido incorporado. Por causa disso, é limitado a espécimes que emitem altos níveis de autofluorescência, mas não aqueles com autofluorescência relativamente fraca, como embriões em estágio inicial9. Para superar a dependência da autofluorescência, as amostras são coradas com um corante fluorescente, como a eosina, para imagens HREM. As escolhas de corantes e métodos de coloração também tornam o HREM mais compatível para detectar sinais moleculares no contexto da arquitetura e morfologia do tecido4,10.
Neste artigo, apresentamos um protocolo HREM aprimorado adequado para avaliação de corpo inteiro de embriões de camundongos em estágio avançado. Para facilitar a coloração, incluímos uma etapa de pré-tratamento para aumentar a penetração do tecido, permitindo assim a imagem HREM de embriões de camundongos mais velhos.

<table><tbody><tr><td>Ratos</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Etílico</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Provas, Absoluto, ACS/USP/Kosher</td></tr><tr><td>Grau Formalina</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Solução de Limpeza</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Solução de Limpeza</td></tr><tr><td>Eosina Y Sal Dissódico</td><td>Fisher scientific</td><td>BP241925</td><td>Solução de Infiltração</td></tr><tr><td>Acridina Laranja hemi (cloreto de zinco) sal</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Solução de Infiltração</td></tr><tr><td>Papel Whatman</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Kit de Incorporação - Solução A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Solução de Infiltração</td></tr><tr><td>JB-4 Kit de Incorporação - Solução B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Solução de Incorporação</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Kit de Incorporação - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Solução</td></tr><tr><td>de Infiltração de Moldes de Incorporação</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8 mm</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Moldes de Incorporação Afiados</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>22 mm x 22 mm quadrado, truncado para 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Suportes de bloco de plástico</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Transferência Graduados Descartáveis</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Petrl</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Pinça de Dissecção de Embriões</td></tr><tr><td>Ponta de Inox</td><td>&nbsp; Pinça de Tecido Graefe para</td><td>Dissecção de Embriões</td>ROBOZ <td>RS-5015</td></tr><tr><td></td><td> ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>Tesoura</td></tr><tr><td>de Operação Delicada para Dissecção de Embriões</td><td> ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Dissecção de embriões</td></tr><tr><td>14 ml Tubos de fundo redondo de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de polipropileno de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3,4 onças) Barcos de pesagem de poliestireno antiestático</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11,2 oz.) Poliestireno antiestático pesa barcos</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>Solução PBS</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>Solução PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Solução Sigma</td><td>P5405</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico heptahidratado</td> Solução <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de zoom estéreo de fluorescência</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz de fibra óptica</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de micrótomo descartável</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de borda única</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D Software</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Computador</td><td>Dell T7600, disco rígido SAS de 2 x 900 GB e memória</td><td></td><td></td>DDR3 RDIMM de 64 GB</tr><tr><td>Agitadores de plataforma oscilante</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placa quente padrão</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

rápida aquisição de imagens 3d usando de alta resolução episc microscopia

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

A tecnologia microscópica episcópica de alta resolução (HREM) permite a aquisição rápida de dados morfométricos volumétricos e tridimensionais (3D) digitais de alta resolução. Aqui, descrevemos o protocolo detalhado para obter imagens de todo o embrião de camundongo. O protocolo consiste em quatro seções principais: preparação da amostra, incorporação, aquisição de imagens e, finalmente, visualização 3D. A tecnologia exige que as amostras sejam coradas com um corante fluorescente, o que pode ser problemático para amostras grandes ou densas. Para superar essa limitação, melhoramos o protocolo existente para aumentar a penetração do corante no tecido, pré-tratando a amostra com uma solução contendo uréia e dodecil sulfato de sódio. O protocolo usa apenas equipamentos e reagentes de laboratório de rotina para facilitar a adaptação em ambientes laboratoriais padrão. Mostramos que as imagens 3D de alta resolução resultantes recapitulam fielmente as características morfológicas detalhadas dos órgãos internos de embriões de camundongos, permitindo assim análises morfométricas. Juntos, apresentamos um protocolo detalhado e aprimorado usando equipamentos de laboratório padrão para adquirir imagens 3D de alta resolução de espécimes de pequeno e grande porte.

Nós relatamos imagens HREM alta qualidade de embriões de rato entre E9.5 e E13.5 8. A qualidade de imagem dos embriões final faseada, no entanto, é significativamente comprometida devido à penetração nos tecidos limitada do eosina corante fluorescente. Para aumentar a eficiência de coloração, testámos vários métodos de pré-tratamento que são compatíveis com imagens fluorescentes 11. Especificamente, os embriões de camundongos E15.5 foram tratados com Sca / e A2 <sup...

Descrevemos um protocolo detalhado usando microscopia episcópica de alta resolução para adquirir imagens tridimensionais (3D) de embriões de camundongos. Este protocolo aprimorado utiliza um método de preparação de tecido modificado para aumentar a penetração do corante fluorescente, permitindo assim a análise morfométrica de espécimes pequenos e grandes.

Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

O objetivo geral deste protocolo é adquirir rapidamente imagens digitais tridimensionais de alta resolução de espécimes biológicos utilizando equipamentos laboratoriais padrão. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento por meio da visualização e da dinâmica de características morfológicas complexas. As principais vantagens desta técnica são o uso de equipamentos laboratoriais comuns e a exigência de experiência prévia mínima.O procedimento será demonstrado por Jungang Huang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Após a dissecação e fixação do embrião conforme descrito no protocolo textual, substitua o fixador pela solução de clareamento e gire suavemente o espécime em um agitador rotativo à temperatura ambiente por uma a duas semanas. Ao final da incubação, transfira o espécime para formalina a 10% e deixe no agitador rotativo por mais dois dias.No terceiro dia, lave a amostra em PBS com três lavagens de cinco minutos cada. Em seguida, desidrate as amostras em uma série ascendente de etanol à temperatura ambiente, em agitador suave durante duas horas para cada concentração. Após a desidratação em etanol a 100%, transfira o espécime para a solução de coloração por uma hora, protegido da luz.Em seguida, substitua a solução por solução de coloração fresca para marcação noturna da amostra. Na manhã seguinte, imerja a amostra em uma mistura, volume a volume, de uma parte de solução de infiltração e uma parte de solução de coloração, recém-preparada, por pelo menos três horas em agitador a quatro graus Celsius. Ao final da incubação, transfira o embrião para a solução de infiltração e realize outra incubação sob agitação por três horas.Em seguida, substitua o sobrenadante por solução de infiltração fresca e continue agitando por mais três dias a quatro graus Celsius. No quarto dia, posicione o embrião em um molde para inclusão e coloque o molde sobre gelo. Misture a solução B com a solução de infiltração e, então, mergulhe suavemente o molde na solução de inclusão fria a quatro graus Celsius.Após cerca de três horas, use uma ponta para confirmar que a solução se solidificou e empurre o espécime para fora do molde. Remova qualquer material de inclusão em excesso, depois reoriente o bloco do espécime em um novo molde em orientação cruzada. Em seguida, coloque todo o conjunto sobre gelo em uma câmara de exaustão.Adicione cuidadosamente a solução de inclusão ao novo molde até que o molde esteja submerso. Em seguida, coloque um suporte para bloco sobre o molde. Após três a quatro horas, retire cuidadosamente o molde de inclusão e posicione o bloco sob um microscópio estereoscópico com iluminação oblíqua para determinar a posição do espécime dentro do bloco.Na face do bloco, marque linhas de grade ao redor do espécime e use-as como guia para aparar qualquer material de inclusão em excesso. Para obter a imagem do espécime, primeiro fixe o bloco em um micrótomo e faça um corte fresco da superfície do espécime. Em seguida, monte um microscópio estereoscópico com zoom na posição horizontal, voltado para a face do bloco do espécime, e ligue o microscópio e o computador associado.Em seguida, inicie o software de aquisição de imagens e use o modo de visualização ao vivo no software de imagem para focalizar a óptica na face do bloco. Alinhe o microscópio e o micrótomo conforme necessário, de modo que a face do bloco fique no centro do visor. Um dos passos mais críticos deste procedimento é adquirir imagens na posição fixa de repouso do micrótomo.Ajuste o zoom para garantir que toda a face do bloco esteja dentro do visor. Em seguida, selecione o filtro da proteína verde fluorescente. Prossiga com o pré-corte do bloco até que o tecido do espécime apareça, e refocalize a imagem conforme necessário.Após medir e ajustar manualmente o tempo de exposição, adquira e salve imagens da face do bloco após cada corte fresco e registre os parâmetros importantes de aquisição de imagem. Ao final da sessão de aquisição, exporte e converta todos os arquivos de imagem para o formato JPEG e use o software apropriado de processamento de imagem para inverter todas as imagens originais, ajustando o brilho e o contraste das imagens conforme necessário. Carregue todas as imagens processadas em um software de visualização 3D, seguindo as instruções.Alinhe todas as imagens usando o modo automático e exiba os resultados em 3D e 2D. Nesta imagem representativa de uma vista de superfície de um embrião de camundongo no dia embrionário 15,5, preparado e imageado conforme acabou de ser demonstrado. Podem ser observadas as características morfológicas detalhadas da pele, incluindo os coxins vibrissais e os folículos pilosos em desenvolvimento.É importante destacar que a resolução da vista de corte virtual de um espécime de dia embrionário 15,5, obtida por este método, é semelhante à de um corte histológico padrão. Após dominar todo o procedimento, a etapa posterior ao pré-tratamento com a solução clareadora pode ser concluída em uma semana, se realizada corretamente. Ao realizar este procedimento, é fundamental lembrar-se de proteger a solução de coloração da luz a quatro graus durante as etapas de infiltração e inclusão.Após este procedimento, outros métodos, como a coloração em escala, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre os padrões específicos de distribuição dos tipos celulares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar equipamentos de laboratório para obter imagens tridimensionais de alta resolução de espécimes biológicos para sua análise morfométrica. Não se esqueça de que o trabalho com soluções de fixação, coloração e infiltração pode ser extremamente perigoso, e que precauções, como operar em uma câmara de fluxo laminar e usar luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia micro computadorizada (TC).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Autophagy é um processo ubíquo que permite que as células para se degradarem e reciclar proteínas e organelas. Aplicamos microscopia de fluorescência para visualizar avançada e quantificar o pequeno, mas, alterações físicas essenciais associados com a indução de autofagia, incluindo a formação e distribuição de autofagossomas e lisossomas, e sua fusão em autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Informações espaço-temporais sobre proteínas dinâmicas dentro de células vivas são cruciais para a compreensão da biologia. Um tipo de microscopia de super-resolução chamada microscopia de iluminação rápida estruturada em 3D (f3D-SIM) revela informações únicas sobre o anel Z citocinético em bactérias: tanto sua aparência semelhante a um grânulo quanto a dinâmica rápida do FtsZ dentro do anel.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de interferometria fotoativado Localization Microscopy (iPALM), um método de microscopia de super-resolução 3-dimensional única molécula localização, à imagem do citoesqueleto de actina em células de mamíferos aderentes. Esta abordagem permite a visualização à base de luz de características estruturais em nanoescala que, caso contrário permanecem sem solução por microscopia óptica limitado por difração convencional.

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Nós fornecemos protocolos simples e robustos para o processamento de materiais de biópsia de várias espécies, embriões de organismos modelo biomédico e amostras de outros tecidos orgânicos para permitir a geração de dados de volume digital com o método de microscopia episcópica de alta resolução.

Microscopia episcopática de alta resolução (HREM) - Protocolos simples e robustos para processamento e visualização de materiais orgânicos

Recentemente nós mapeamos locais espaciais tridimensionais (3D) de rotas de transporte para várias proteínas se dentro cílios primários em células vivas. Aqui este detalhes de papel a instalação experimental, o processo de amostras biológicas e as análises de dados para a fluorescência de super-resolução 3D imagem abordagem recém aplicadas em viver cílios primários.

Aplicação da microscopia de velocidade de alta velocidade super-resolução no cílio primário ao vivo

Este protocolo explica como preparar e montar amostras bacterianas para imagens tridimensionais vivas e como reconstruir a forma tridimensional de E. coli a partir dessas imagens.

Imagem tridimensional de células bacterianas para representações celulares precisas e localização precisa de proteínas

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação

Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

Este protocolo detalha as aplicações avançadas de imagem e o gerenciamento de recursos compartilhados de um sistema de microscópio confocal de varredura a laser integrado a um detector de matriz multiplexada para imagens celulares e subcelulares de alta resolução. O fluxo de trabalho permite imagens multimodais desde confocal até super-resolução (~120 nm) dentro de uma única plataforma, tornando a visualização em escala nanométrica mais acessível.

Imagem de Superresolução e Gerenciamento Compartilhado: Um Protocolo para Microscopia Confocal com Detecção de Multiplex

Aprenda a adquirir imagens 3D de alta resolução de embriões de camundongo usando microscopia episcópica. Esta técnica facilita a análise morfométrica detalhada em biologia do desenvolvimento com equipamento padrão.

Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia

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