Rápida aquisição de imagens 3D usando de alta resolução episc Microscopia

O objetivo geral deste protocolo é adquirir rapidamente imagens digitais 3D de alta resolução de espécimes biológicos usando equipamentos de laboratório padrão. Este método pode responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento por meio da visualização e dinâmica de características morfológicas complexas. As principais vantagens dessa técnica são que ela usa equipamentos de laboratório padrão e requer experiência prévia mínima.

Demonstrando o procedimento estará Jungang Huang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Após a dissecção e fixação do embrião conforme descrito no protocolo de texto, substitua o fixador por solução de limpeza e gire suavemente a amostra em um balancim em temperatura ambiente por uma a duas semanas. No final da incubação, transfira a amostra para 10% de formalina e deixe na cadeira por mais dois dias.

No terceiro dia, lave a amostra em PBS por três lavagens de cinco minutos. Em seguida, desidratar as amostras em uma série ascendente de etanol à temperatura ambiente, em um balancim suave por duas horas para cada concentração. Após a desidratação com etanol a 100%, transfira a amostra para a solução de coloração por uma hora, protegida da luz.

Em seguida, substitua a solução por uma solução de coloração nova para rotulagem noturna da amostra. Na manhã seguinte, mergulhe a amostra em uma mistura de um para um volume de soluções de infiltração e coloração recém-preparadas por pelo menos três horas em um balancim a quatro graus Celsius. No final da incubação, transfira o embrião para uma solução de infiltração para outra incubação de balanço de três horas.

Em seguida, substitua o sobrenadante por uma solução de infiltração nova por mais três dias de balanço a quatro graus Celsius. No quarto dia, oriente o embrião em um molde de incorporação e coloque o molde no gelo. Misture a solução B com a solução de infiltração e, em seguida, mergulhe suavemente o molde em solução de incorporação a frio a quatro graus Celsius.

Após cerca de três horas, use uma ponta para confirmar se a solução solidificou e empurre a amostra para fora do molde. Apare qualquer excesso de material de incorporação e, em seguida, reoriente o bloco de amostra em um novo molde em uma orientação cruzada. Em seguida, coloque toda a configuração no gelo em uma capela de exaustão.

Adicione suavemente a solução de incorporação ao novo molde até que o molde esteja submerso. Em seguida, coloque um suporte de bloco em cima do molde. Após três a quatro horas, retire o molde de incorporação e coloque o bloco sob um microscópio estéreo com iluminação oblíqua para determinar a posição da amostra dentro do bloco.

Na face do bloco, marque as linhas de grade ao redor da amostra e use as linhas como guias para aparar qualquer excesso de material de incorporação. Para obter a imagem da amostra, primeiro prenda o bloco a um micrótomo e obtenha um novo corte superficial da amostra. Em seguida, monte um microscópio de zoom estéreo horizontalmente voltado para a face do bloco da amostra e ligue o microscópio e o computador que o acompanha.

Em seguida, inicie o software de aquisição de imagem e use o modo de visualização ao vivo no software de imagem para focar a óptica na face do bloco. Alinhe o microscópio e o micrótomo conforme necessário, de modo que a face do bloco fique no centro do visor. Uma das etapas mais críticas desse procedimento é adquirir imagens na posição inicial fixa do micrótomo.

Ajuste o zoom para garantir que toda a face do bloco esteja dentro do visor. Em seguida, selecione o filtro de proteína fluorescente verde. Prossiga para pré-cortar o bloco até que o tecido da amostra apareça e refoque a imagem conforme necessário.

Depois de medir e definir o tempo de exposição manualmente, adquira e salve imagens da face do bloco após cada novo corte e registre os parâmetros importantes de aquisição de imagem. No final da sessão de imagem, exporte e converta todos os arquivos de imagem para o formato JPEG e use o software de processamento de imagem apropriado para inverter todas as imagens originais, ajustando o brilho e o contraste das imagens conforme necessário. Carregue todas as imagens processadas para um software de visualização 3D, seguindo as instruções.

Alinhe todas as imagens usando o modo automático e mostre os resultados 3D e 2D. Nesta imagem representativa de uma visão de superfície de montagem total de um embrião embrionário de dia 15,5 embriões de camundongo preparados e fotografados como acabamos de demonstrar. As características morfológicas detalhadas da pele, incluindo as almofadas de bigode e os folículos pilosos em desenvolvimento, podem ser observadas.

É importante ressaltar que a resolução da visualização da seção virtual de um espécime embrionário do dia 15,5 fotografado por este método é semelhante a uma seção histológica padrão. Uma vez dominado, todo o procedimento após o pré-tratamento com a solução de limpeza pode ser concluído em uma semana, se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a solução de coloração protegida da luz a quatro graus durante a etapa de infiltração e incorporação.

Após este procedimento, outros métodos, como coloração de escamas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre os padrões de distribuição específicos dos tipos de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar equipamentos de laboratório para adquirir imagens 3D de alta resolução de espécimes biológicos para sua análise morfométrica. Não se esqueça de que trabalhar com solução de fixação, coloração e infiltração pode ser extremamente perigoso, e que precauções como operar em uma capela e usar luvas devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.