preparação e

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a síntese de uma sonda baseada em atividade, ARN 14 seis oito seis, específica para a enzima N-acetil-etanolamida ácida amidase, ou NAAA, e descrever seu uso para detectar a enzima cataliticamente ativa em extratos celulares e seções de tecidos. Este método pode ajudar a responder perguntas sobre a função in vivo da NAAA, fornecendo informações sobre a ativação da NAAA em diferentes condições fisiológicas e patológicas, como doenças inflamatórias e neurodegenerativas. Sua principal vantagem é que uma simples manipulação ocorre após a reação da NAAA com a sonda, fornecendo assim informações confiáveis sobre o estado de ativação in vivo da enzima.

Outra vantagem é que, ao contrário de anticorpos específicos, nossa sonda detecta apenas a forma ativa da enzima, o que é útil para o status da microscopia de fluorescência. A demonstração visual deste método é fundamental, pois combina diferentes especialidades que se reúnem em uma história completa, desde a síntese adequada até suas aplicações finais. Em um frasco redondo de 50 mililitros, dissolva 350 miligramas de undecinenol e três vírgula cinco mililitros de diclorometano seco.

Em seguida, adicione 25 miligramas de DMAP e 530 miligramas de DPC a esta solução. Agite a mistura à temperatura ambiente por 16 horas. Após 16 horas, adicione 20 mililitros de diclorometano à solução.

Transfira a mistura para um funil de separação. Adicione 15 mililitros de água. Agite a mistura e deixe as duas fases separarem.

A seguir, abra a torneira, colete a fase orgânica da parte inferior, feche a torneira e transfira novamente a fase orgânica para o funil. Adicione 15 mililitros de uma solução saturada de bicarbonato de sódio à mistura. Agite o funil de separação e deixe as duas fases se separarem.

Após secar a camada orgânica com sulfato de sódio, filtre-a através de algodão em um frasco redondo de fundo plano com haste. Em seguida, evapore a camada orgânica até secagem completa sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. Pese o frasco e obtenha 600 miligramas de óleo, que é uma mistura de dois carbonatos de piridil undecinila e undecinol dois carboxilatos de oxipiridina na proporção de um vírgula sete para um.

Em um balão de fundo redondo de 10 mililitros, dissolva 60 miligramas de acetato de oxoacetidenol amônio em dois mililitros de diclorometano seco. Resfrie a solução até zero grau Celsius em banho de gelo e, em seguida, adicione 81 microlitros de diazapropaletilamina gota a gota. Em seguida, dissolva 350 miligramas da mistura bruta contendo undecinol dois carboxilato de oxipiridina em dois mililitros de diclorometano seco.

Adicione a mistura dissolvida à solução e agite à temperatura ambiente por 15 horas. Em seguida, evapore o solvente até secagem sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. Purifique o composto por cromatografia em coluna de gel de sílica utilizando um aparato automatizado de cromatografia em coluna.

Primeiro, absorva a amostra em gel de sílica. Após equilibrar a coluna com ciclohexeno, aplique a amostra na cartela. Elua a amostra com acetato de etila em ciclo-hexano de zero a 100, coletando os picos em tubos de ensaio.

Evapore o solvente das frações correspondentes ao composto até secagem sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotatório, obtendo 40 miligramas de um sólido branco. Após pré-limpeza da amostra conforme descrito no protocolo do texto, adicione 11,3 microlitros de um estoque de 5 milimolar de azida de polietilenoglicol biotina e vortex. Em seguida, adicione 11,3 microlitros de um estoque de 50 milimolar de TCEP recém-preparado à amostra e vortex.

Após pré-misturar 34 microlitros de uma solução de trabalho recém-preparada de TBTA 1,7 milimolar com 11,3 microlitros de uma solução estoque de sulfato de cobre 50 milimolar, adicione 45,3 mililitros dessa solução à amostra e vortex. Utilize recipientes identificados. Incube a reação a 25 graus Celsius por pelo menos duas horas.

Após uma hora de incubação, observe a precipitação proteica e misture a reação. Centrifugue a amostra por quatro minutos a 6.500 ×g a quatro graus Celsius. Após a remoção do sobrenadante, adicione 750 microlitros de metanol frio e reconstitua o precipitado por sonicação usando um sonicator de sonda por cinco segundos.

Em seguida, centrifugue a amostra por quatro minutos a 6.500 × g a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante com uma seringa e agulha. Após lavar mais duas vezes com metanol frio, adicione 325 microlitros de SDS a 2,5% em PBS ao pellet proteico.

Sonicar a amostra três vezes por cinco segundos. Em seguida, aquecer a amostra por cinco minutos a 65 graus Celsius. Após a sonicação, centrifugar a amostra por cinco minutos a 6.500 ×g em temperatura ambiente.

Em seguida, transfira o sobrenatante para um tubo limpo de 15 mililitros e adicione um ponto quatro mililitros de PBS ao sobrenatante para diluir a concentração de SDS a zero ponto cinco por cento. Para o enriquecimento com estreptavidina, primeiro ajuste o volume da amostra a quatro ponto dois mililitros com PBS. Em seguida, adicione 40 microlitros de uma suspensão a 50% de agarose conjugada à estreptavidina pré-lavada, utilizando uma ponteira com a extremidade cortada.

Incube a mistura por duas horas à temperatura ambiente com rotação. Após centrifugar por dois minutos a 1.400 ×g, remova o sobrenadante sem secar o pellet de esferas. Use o sobrenadante residual para transferir as esferas para uma coluna de centrifugação de um mililitro e lave a coluna por gravidade com um mililitro de SDS a um por cento em PBS.

Continue lavando as microesferas com ureia seis molar seguido por PBS conforme descrito no protocolo no texto. Em seguida, use 500 microlitros de PBS para transferir as microesferas lavadas para um tubo de um ponto cinco mililitro. Após centrifugar a amostra por dois minutos a 1.400 × g, aspire suavemente o sobrenadante com uma seringa e agulha.

Para eluir as proteínas ligadas à resina, adicione 25 microlitros de tampão de eluição ao pellet da resina e incube por 15 minutos à temperatura ambiente, seguido por 15 minutos a 95 graus Celsius. Adicione aproximadamente 400 microlitros da mistura de química click a fatias de tecido que tenham sido preparadas de acordo com o protocolo descrito no texto. Observe que o volume escolhido da mistura de química click deve ser suficiente para cobrir completamente as fatias.

Em seguida, incube os fragmentos de tecido por uma hora à temperatura ambiente, protegidos da luz. Após a incubação, lave as amostras com PBS por cinco minutos e, em seguida, com metanol frio por cinco minutos. A seguir, lave os fragmentos de tecido três vezes com uma solução contendo um por cento de Tween 20 e zero vírgula cinco milimolar de EDTA em PBS, por dois minutos cada lavagem.

Por fim, lave as fatias mais uma vez com PBS durante cinco minutos. Após secagem ao ar, adicione uma gota de meio de montagem antidesvanecimento com DAPI. Feche as amostras com lamínulas e sature com esmalte.

Para a síntese da sonda, o undecinenol é ativado pelo carbonato de dipiridila na presença de quatro dimetilaminopiridina catalítica para produzir um carbonato misto, que é então reagido com o lactam aminil; o beta-lactam ou cabeça da sonda reage com o sítio ativo da NAAA, enquanto o alquino terminal pode ser funcionalizado com uma etiqueta marcadora por meio de química click. ARN 14 seis oito seis foi utilizado para detectar a ativação da NAAA em extratos proteicos de patas inflamadas de ratos pelo método de bloqueio proteico. Em ratos ingênuos, nenhum sinal de NAAA é detectado.

Por outro lado, em ratos tratados com adjuvante completo de Freund, observa-se uma faixa acentuada correspondente à NAAA ativa. Outra aplicação do ARN 14 six eight six é a imagem de tecidos por microscopia de fluorescência. Aqui, as células vermelhas representam macrófagos alveolares que são positivos para NAAA ativa.

A NAAA está localizada em estruturas vesiculares difusas, conforme observável em maior aumento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar e utilizar o ARN 14 seis oito seis para detectar a NAAA ativa em tecidos, tanto por meio de blot de proteína quanto por microscopia de fluorescência. Além disso, embora este protocolo seja específico para o nosso alvo, as aplicações da sonda que descrevemos podem ser facilmente adaptadas para diferentes sondas baseadas em atividade, específicas para alvos distintos da NAAA.