Name: preparação e In Vivo O uso de uma sonda baseado em atividades para N Amidase Ácido -acylethanolamine (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a sintetizar e aplicar a sonda ARN14686 para detectar a forma ativa da NAAA em extratos celulares e tecidos. Este método oferece informações confiáveis sobre o estado de ativação da enzima em condições fisiológicas e patológicas.

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Os autores agradecem ao Nikon Imaging Center no Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Itália (NIC@IIT).

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A actividade enzimática é finamente regulados em níveis diferentes, incluindo a transcrição de ARN, a síntese de proteínas, a translocação da proteína, a modificação pós-translacional, e interacção proteína-proteína. Muitas vezes, a expressão da enzima sozinha não leva em conta para a sua actividade. ABPP foi desenvolvido para estudar a actividade de proteínas no seu estado nativo. Duas características são necessárias: uma sonda química que covalentemente liga-se ao sítio activo de uma enzima de interesse e um marcador ...

Comumente usado métodos para investigar os padrões de expressão, interações e funções das proteínas, incluindo plataformas de espectrometria de cromatografia de massa de líquido para análise espingarda 1,2, fermento métodos de dois híbridos 3,4 e, em ensaios in vitro, são limitados em que eles são incapaz de avaliar a atividade das proteínas no seu estado nativo. profiling proteína baseado em atividades (ABPP) pode ser usado para preencher esta lacuna. Nesta abordagem, pequena molécula sondas capazes de se ligar covalentemente ao sítio activo de uma enzima de interesse conjugado com um grupo repórter que permite a detecção do alvo. Usando clique química (CC), o repórter pode ser integrado na sonda ou podem ser introduzidos após acoplamento alvo ocorreu 5,6. O último procedimento requer a utilização de sondas que contêm grupos químicos adequados, tais como um alcino ou azida de terminal, que pode ser modificado com uma série de reagentes repórter via reacções bio-ortogonal sucH, tal como o Cu (I) catalisada por Huisgen [3 + 2] cicloadição 7-9 ou Staudinger ligadura 10,11. Recentemente, foi divulgada a ARN14686 composto como o primeiro ABP para o in vitro e in vivo de detecção da hidrolase de cisteína, NAAA 12. NAAA catalisa a desativação hidrolítica FAEs saturados e monoinsaturados, incluindo oleoletanolamina (OEA) e palmitoiletanolamida (PEA), que são agonistas endógenos do anti-inflamatório receptor nuclear PPAR-alfa 13-15. NAAA é predominantemente expresso em macrófagos e outras células derivadas de monócitos, bem como em linfócitos-B 14,16, sugerindo um papel na regulação da resposta imune inata. A enzima é sintetizada no retículo endoplasmático rugoso numa forma inactiva e é activado em compartimentos acídicos da célula através de um mecanismo 17 autoproteolica. A clivagem autoproteolítica gera uma nova cisteína N-terminal (C131 em ratinhos e ratos, C126 em seres humanos), que é o responsável por nucleófilo FAE hidrólise 18,19. A inibição farmacológica da actividade NAAA altera o equilíbrio síntese / degradação FAE em favor do aumento dos níveis celulares de FAEs 16,20,21. Vários derivados β-lactona e β-lactâmicos têm mostrado inibir a actividade de NAAA com elevada potência e selectividade 16,22-26. Estes inibidores actuam através de S-acilação da cisteína catalítica 16,27,28. O ARN14686 composto foi concebido com base na estrutura química do, inibidor β-lactama NAAA-serina derivada sistemicamente activa, ARN726 (N-4 cyclohexylbutyl- - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo) 16. O grupo 4-butil-ciclo-hexilo de ARN726 foi substituído com uma cadeia alifática em C9 saturado tendo uma marcação alcino terminal para conjugação subsequente com uma tag de CC repórter azida de rolamento. Nós escolhemos para projetar um ABP em duas etapas para minimally alterar a estrutura do andaime original, mantendo, assim, a afinidade da sonda para NAAA. Além do mais, evitando a introdução de etiquetas volumosos, uma tal sonda poderia ser mais adequado para o tratamento in vivo do que um PAF directa. ARN14686 NAAA inibe com elevada potência (hNAAA CI50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) através da formação de um aducto covalente com a cisteína catalítica da enzima 12. Experimentos em ratos vivos mostraram que a sonda é seletiva na captura NAAA expressos em pulmões. Ácido ceramidase, outra cisteína-amidase que partilha 33-34% de identidade com NAAA, também foi identificado como um alvo de baixa afinidade ao utilizar concentrações elevadas de sonda (10 uM in vitro, 10 mg / ml por via intravenosa, iv) 12. Temos também utilizado ARN14686 para estudar a presença de NAAA activo em tecidos de rato a seguir à administração inflamadas de adjuvante completo de Freund (CFA) 29. Aqui, descrevemos um protocolo para os preparatina de ARN14686 (Figura 1) e sua aplicação para a investigação de activação NAAA ex vivo. Como exemplo, descreve-se um procedimento experimental para visualizar NAAA nas patas de ratos após a administração CFA. Nesta experiência, as proteínas são extraídas a partir de tecido da pata após a injecção IV da sonda, e o proteoma ABP-marcado é submetido a CC com biotina-azida. amostras biotiniladas são enriquecidas utilizando esferas de estreptavidina, e manchas de proteínas são realizadas. Em outra aplicação, descreve-se a localização de NAAA activo por microscopia de fluorescência em pulmões de ratinho a partir de ratinhos tratados com sonda. Neste caso, o tecido é seccionado e secções são submetidos a CC, por adição de rodamina. Um regime de fluxo de trabalho é ilustrado na Figura 2.

<table><tbody><tr><td>1,1'-sulfonildiimidazol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td></td></tr><tr><td>2-dipiridilcarbonato</td> nocivo <td>Fluorochem</td><td>11331</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td> nocivo <td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Inflamável, tóxico, perigoso para o ambiente aquático</td></tr><tr><td>4-(Dimetilamino) piridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td> tóxico <td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>Inflamável, corrosivo</td></tr><tr><td>Acetonitrila&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Carvão ativado inflamável e tóxico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Azida-PEG3-Biotina</td> prejudicial <td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Colunas Bio-spin</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de bloqueio</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro Bovin altamente tóxica (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Perigo para a saúde</td></tr><tr><td>Nitrato de amônio cérico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Oxidante, Nocivo</td></tr><tr><td>Hidrato de Cloral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Tóxico Ciclohexadieno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Inflamável, Perigo para a saúde</td></tr><tr><td>Ciclohexano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34855</td><td>Inflamável, Nocivo, Perigo para a saúde, Perigo para o ambiente</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Nocivo, Perigo para a saúde</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Inflamável, </td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido nocivo (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Inflamável,</td></tr><tr><td>Acetato de etila</td> nocivo <td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Inflamável, </td></tr><tr><td>Glicerol Nocivo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptavidin&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>Centrifugue brevemente antes de usar para precipitar complexos de proteínas</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>Metanol altamente tóxico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Inflamável, tóxico, perigoso para a saúde</td></tr><tr><td>N-(3-Dimetilaminopropil)-N&prime; Cloridrato de -etilcarbodiimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>Nocivo, Corrosivo</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>Inflamável, Corrosivo, Tóxico</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Inflamável, Nocivo, Perigoso para a Saúde</td></tr><tr><td>N-Cbz-L-Serina</td><td>Fluoroquímico</td><td>M03053</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia confocal Nikon A1</td> prejudicial <td>Nikon</td><td></td><td>Leia o manual do usuário</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Paládio sobre carbono</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anisidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Tóxico, Perigo para a saúde, Perigo ambiental</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>Tóxico, respiratório prejudicial, corrosivo, falmável</td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol)&nbsp;</td>Montagem antifade <td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold com DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Evite a formação de bolhas</td></tr><tr><td>Coquetel inibidor de protease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Tóxico, corrosivo, inflamável</td></tr><tr><td>Hidreto de sódio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td>Sulfato</td></tr><tr><td>de sódio</td> inflamável <td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 scanner de imagem</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>Leia&nbsp; o manual do usuário</td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Terc-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Tóxico, inflamável</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Inflamável, prejudicial, perigoso para a saúde</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Tóxico, quente a 50 &graus; C para dissolver</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 homogeneizador de tecidos básicos</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td></td></tr><tr><td>Harmful Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Tóxico, quente a 50 &deg; C para dissolver</td></tr></tbody></table>

preparação e<em&gt; in vivo</em&gt; o uso de uma sonda baseado em atividades para<em&gt; n</em&gt; amidase Ácido -acylethanolamine

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

perfis de proteína à base de Actividade (ABPP) é um método para a identificação de uma enzima de interesse em um proteoma do complexo através da utilização de uma sonda que tem como alvo química sítios activos da enzima. Uma etiqueta repórter introduzidos na sonda permite a detecção da enzima marcada por análise em gel de fluorescência, mancha de proteína, microscopia de fluorescência, ou espectrometria de massa de cromatografia de líquido. Aqui, descrevemos a preparação e utilização do ARN14686 composto, uma sonda baseada em atividades de cliques química (CC-ABP) que reconhece seletivamente a enzima N amidase ácido -acylethanolamine (NAAA). NAAA é uma hidrolase cisteína que promove a inflamação desactivando -alfa agonistas endógenos do receptor proliferador de peroxissoma activado (PPAR), tais como palmitoiletanolamida (PEA) e oleoletanolamina (OEA). NAAA é sintetizada como uma proenzima de comprimento completo inactiva, que é activada pelo autoproteolysis no pH ácido do lisossoma. estudos de localização have mostrado que NAAA é predominantemente expresso em macrófagos e outras células derivadas de monócitos, bem como em linfócitos-B. Nós fornecem exemplos de como ARN14686 podem ser usadas para detectar e quantificar NAAA activo ex vivo em tecidos de roedores por mancha de proteína e microscopia de fluorescência.

ARN14686 foi projetado com base no cadafalso da ARN726 inibidor NAAA. O grupo 4-butil-ciclo-hexilo de ARN726 foi substituído com uma cadeia alifática em C9 saturado tendo uma marcação alcino terminal (Figura 1). A tag alcino foi introduzida, a fim de permitir a utilização de um procedimento de marcação de dois passos para adicionar um fluoróforo ou uma molécula de biotina através de CC. Esta característica torna ARN14686 uma ferramenta muito versátil para sondar NAAA <em...

Aqui, nós descrevemos a preparação e utilização de uma sonda com base na actividade (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo), que permite a detecção e quantificação da forma activa da enzima pró-inflamatória N-amidase ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

preparação e<em&gt; In Vivo</em&gt; O uso de uma sonda baseado em atividades para<em&gt; N</em&gt; Amidase Ácido -acylethanolamine

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a síntese de uma sonda baseada em atividade, ARN 14 seis oito seis, específica para a enzima N-acetil-etanolamida ácida amidase, ou NAAA, e descrever seu uso para detectar a enzima cataliticamente ativa em extratos celulares e seções de tecidos. Este método pode ajudar a responder perguntas sobre a função in vivo da NAAA, fornecendo informações sobre a ativação da NAAA em diferentes condições fisiológicas e patológicas, como doenças inflamatórias e neurodegenerativas. Sua principal vantagem é que uma simples manipulação ocorre após a reação da NAAA com a sonda, fornecendo assim informações confiáveis sobre o estado de ativação in vivo da enzima.Outra vantagem é que, ao contrário de anticorpos específicos, nossa sonda detecta apenas a forma ativa da enzima, o que é útil para o status da microscopia de fluorescência. A demonstração visual deste método é fundamental, pois combina diferentes especialidades que se reúnem em uma história completa, desde a síntese adequada até suas aplicações finais. Em um frasco redondo de 50 mililitros, dissolva 350 miligramas de undecinenol e três vírgula cinco mililitros de diclorometano seco.Em seguida

preparation-vivo-use-an-activity-based-probe-for-n-acylethanolamine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interesse para a saúde humana), utilizando um método de triagem recém-desenvolvido com base em um método imunoquímico competitiva e uma detecção eletroquímica final é demonstrada.

ELIME Método (Enzyme Linked Immuno Magnetic eletroquímica) para Detecção de micotoxinas

Este protocolo descreve a preparação de um substrato sintético para o...

Ensaio in vitro de metilação tRNA com a Entamoeba histolytica DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferase (Ehmeth) Enzyme

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Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

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Medição in vitro da atividade da enzima α-galactosidase A e da α-glicosidase ácida

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Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

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preparação e

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