Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse
17 de novembro de 2016
O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo.
O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo de camundongo reprodutível, sustentável e persistente de deficiência de células-tronco límbicas. Essa técnica simples fornece um modelo animal consistente de deficiência de células-tronco límbicas, sem induzir lesões indesejadas no olho, o que é difícil de alcançar com os modelos padrão de lesões químicas. Este modelo é útil para estudar o processo da doença a longo prazo em nível celular e molecular.
E para testar ou comparar a eficácia de novos tratamentos. Depois de anestesiar o mouse, aperte o dedo do pé para garantir a profundidade adequada da anestesia. Inspecione o olho sob uma lâmpada de fenda para verificar a ausência de qualquer lesão anterior na córnea.
Instilar uma gota de cloridrato de tetracaína a 1% no olho e aguardar 60 segundos. Em seguida, aplique suavemente 5% de iodopovidona no olho e no cabelo ao redor. Após um minuto, limpe a gota ou espalhe-a no cabelo ao redor do olho para evitar que o cabelo interfira na ponta da ferramenta.
Prepare uma rebarba rotativa estéril e um par de pinças dobradas estéreis e mantenha-as em uma folha estéril durante o procedimento. Agora, estabilize o olho agarrando as pálpebras do lado nasal usando a pinça dobrada e processando suavemente o olho. Tenha cuidado para não aplicar muita pressão.
Sob um microscópio cirúrgico, barbeie ao redor da área límbica duas vezes usando a broca rotativa estéril. Remova todo o epitélio da córnea de limbo a limbo com a broca rotativa de forma circular e trabalhe com o lado lateral de sua ponta. Para evitar lesões no estroma, não escove novamente as partes da córnea das quais o epitélio foi removido.
Não aplique pressão no olho. Limpe a ponta da escova conforme necessário. Aplique uma gota de PBS estéril na córnea e limpe todas as folhas epiteliais destacadas com um lenço de limpeza macio.
Em seguida, raspe o epitélio restante, se houver. Preste atenção à cauda do rato para garantir a profundidade adequada da anestesia durante a cirurgia. Aplique uma gota de Flouresceína sódica na córnea.
Limpe a córnea após 30 segundos e examine-a ao microscópio com um filtro azul cobalto para verificar a remoção completa do epitélio. Após o procedimento, coloque o animal em sua gaiola sobre um cobertor de aquecimento e observe-o por 30-45 minutos até a recuperação completa da anestesia. Enquanto isso, aplique pomada oftálmica de eritromicina a 1% no olho e continue a aplicação do antibiótico diariamente por uma semana.
Além disso, injete 0,1 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea imediatamente e 12 horas após o procedimento e continue a injeção duas vezes ao dia por dois dias. Este é o fenótipo da córnea um mês após o procedimento. Você pode ver uma extensa neovascularização, que é uma característica da deficiência de células-tronco límbicas.
Uma córnea normal expressa citoqueratina 12, mas é desprovida de citoqueratina 8 ou células caliciformes. Na deficiência de células-tronco límbicas, a citoqueratina 8 e as células caliciformes aparecem na córnea, enquanto a citoqueratina 12 é perdida. Uma vez dominada, essa técnica resultará em neovascularização da córnea que cobrirá quase toda a superfície da córnea do camundongo em um mês e ficará estável por até três meses.
É importante evitar escovar novamente as partes da córnea que o epitélio já foi removido. Isso pode causar inflamação indesejada do estroma e opacificação. Após o desenvolvimento da deficiência de células-tronco límbicas, métodos experimentais de tratamento podem ser testados e comparados.
Alternativamente, os tratamentos podem ser iniciados logo após a lesão. Este vídeo mostrou como remover efetivamente o epitélio límbico e da córnea para induzir a deficiência de células-tronco límbicas em camundongos. Com algumas modificações, também pode ser realizado em outros animais.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma técnica reprodutível para criar um modelo sustentável de deficiência das células-tronco da borda limbar (LSCD) em camundongos. Este modelo é essencial para o estudo do processo da doença e para testar tratamentos inovadores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Oftalmologia
Contexto
- A deficiência de células-tronco da região limbar afeta a saúde da córnea e a visão.
- Os modelos atuais frequentemente induzem lesões indesejadas, complicando a pesquisa.
- É necessário um modelo sustentável para estudos de longo prazo.
- Essa técnica tem como objetivo preencher essa lacuna.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo consistente de LSCD em camundongos.
- Facilitar o estudo dos processos celulares e moleculares da doença.
- Avaliar a eficácia de tratamentos potenciais.
Métodos Utilizados
- A anestesia é administrada ao camundongo.
- O olho é inspecionado com lâmpada de fenda para verificar lesões prévias.
- Uma técnica específica é empregada para induzir DCEL sem danos adicionais.
- É realizado o monitoramento de longo prazo do modelo.
Resultados Principais
- O modelo imita com sucesso a DLEC sem causar lesão ocular indesejada.
- Permite estudos celulares e moleculares de longo prazo.
- Tratamentos inovadores podem ser testados de forma eficaz utilizando este modelo.
- Os resultados indicam um método confiável para pesquisas futuras.
Conclusões
- Essa técnica fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa em DCEC.
- Amplia a compreensão das doenças das células-tronco limbares.
- Estudos futuros podem se basear nesse modelo para melhorar as opções de tratamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de um modelo reprodutível em camundongo de deficiência das células-tronco da região limbar (LSCD) atende a uma necessidade crítica por sistemas relevantes à doença na descoberta de fármacos oftálmicos. Este modelo permite a redução de riscos mecanicistas e confiança preditiva na avaliação pré-clínica de terapias regenerativas e anti-inflamatórias direcionadas a distúrbios corneanos. Seu fenótipo sustentado e alinhamento translacional apoiam o avanço robusto da linha de pesquisa e a comparabilidade entre programas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função das células-tronco da região limbar e das vias de regeneração da córnea.
- Apoia a desmistificação biológica ao fornecer um modelo de doença consistente e controlado por lesão.
- Facilita a validação funcional de alvos terapêuticos candidatos para o tratamento da DCTL.
- Aprimora a confiança preditiva quanto à relevância translacional na pesquisa de doenças da superfície ocular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece uma plataforma in vivo validada para avaliação quantitativa da eficácia terapêutica.
- Permite a avaliação padronizada de desfechos celulares e moleculares, como a expressão de citoceratina e a neovascularização.
- Apóia a triagem reprodutível e escalonável de novos compostos ou biológicos para a reparação da córnea.
- Facilita a comparação confiável de modalidades de tratamento em um ambiente controlado.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à patologia humana de DLEC, apoiando o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Permite a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de estratégias regenerativas.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco para terapêuticas oculares direcionadas à deficiência de células-tronco.
- Fornece compreensão mecanicista da progressão da doença e da resposta terapêutica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de DLEC se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico, permitindo testes de hipóteses, identificação de compostos promissores e validação translacional de terapias para a superfície ocular.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a investigação baseada em hipóteses sobre a perda de células-tronco limbares e os mecanismos de reparo da córnea.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para avaliação da eficácia e segurança de intervenções candidatas.
- Análise: Permite a medição de marcadores moleculares (por exemplo, perfis de citoceratinas) e de neovascularização para análises comparativas.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas pré-clínicas à relevância clínica por meio da modelagem de fenótipos sustentados de DCTL.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e adaptável para avaliação interprogramas de terapêuticos oculares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista no desenvolvimento de medicamentos oculares.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos estudos pré-clínicos de DCEO.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital em portfólios oftálmicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos regenerativos e anti-inflamatórios.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cirurgia oftálmica de pequenos animais e no cuidado pós-procedimental.
- Requer acesso a microscópios cirúrgicos, fresas motorizadas e ferramentas analíticas moleculares.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de indução de lesão e avaliação fenotípica.
- Pode ser adaptado a outros modelos de pequenos animais com modificações procedimentais.
- Uma técnica cuidadosa é essencial para evitar lesão estromal e garantir a consistência do modelo.
