Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

O objetivo geral deste método é investigar mudanças na composição lipídica dos neutrófilos durante a liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando cromatografia em camada fina e HPLC. Este método pode ser usado para obter informações mais detalhadas sobre os mecanismos envolvidos na formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou brevemente denominadas formação de NET. A principal vantagem desse procedimento é que ele fornece informações sobre o papel dos lipídios na função geral dos neutrófilos, utilizando um protocolo fácil de seguir.

O isolamento de células derivadas do sangue humano será demonstrado por uma ex-aluna de doutorado de nosso laboratório, Ariane Neumann. E ela será auxiliada por Friederike Reuner. A preparação de células para análise lipídica será demonstrada por Graham Brogden, um pós-doutorado em meu laboratório, e Diab Husein, um aluno de mestrado no programa de bioquímica.

Para isolar neutrófilos derivados do sangue humano, coloque aproximadamente 20 mL de sangue em 20 mL de solução de diatrizoato de sódio / dextrana perto de uma chama, sem misturar. Centrifugue durante 30 minutos a 470 vezes g sem travar. É fundamental não misturar a fase sanguínea com o grau de densidade em solução.

Após a etapa de centrifugação, as células mononucleares precisam ser cuidadosamente removidas para evitar contaminação ou ativação inespecífica das células. Remova as células mononucleares e a camada de plasma amarelada. Transfira a célula polimorfonuclear, ou fase PMN, para um novo tubo de 50 mL e encha-o até 50 mL com solução salina tamponada com fosfato 1X.

Centrifugar a amostra durante 10 minutos a 470 vezes g com travagem. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 mL de água estéril por cinco segundos para lisar os eritrócitos. Encha imediatamente o tubo até 50 mL com 1X PBS e centrifugue a amostra.

Ao remover o sobrenadante, o pellet deve ser branco. Se ainda estiver vermelho, repita essas etapas. Em seguida, ressuspenda o pellet em 1000 microlitros de Roswell Park Memorial Institute, ou meio RPMI.

Conte o número de células usando a coloração com azul de tripano e um hemocitômetro sob um microscópio óptico. Preparar uma suspensão celular em RPMI a uma concentração de dois milhões de células por ml. Aproximadamente 25 milhões de neutrófilos podem ser colhidos de 20 mL de sangue.

Para tratar farmacologicamente os neutrófilos para análise lipídica, use 15 milhões das células preparadas. Incube as amostras nos tubos de reação por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a centrifugação das amostras, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 300 microlitros de HBSS.

Depois de centrifugar novamente a amostra utilizando os mesmos parâmetros, ressuspender o sedimento celular em 1 ml de uma solução de clorofórmio:metanol 1:1. Em seguida, homogeneizar o pellet ressuspenso com uma cânula de calibre 26, empurrando a amostra para dentro e para fora de uma seringa de 1 mL 10 vezes. Para isolar os lipídios dos neutrófilos derivados do sangue periférico humano, pegue os neutrófilos preparados e coloque-os no gelo.

Pipetar os neutrófilos para um tubo de vidro com tampa de rosca de 15 ml com um selo de PTFE e homogeneizá-los agitando durante um minuto. Em seguida, adicione 2 mL de metanol seguido um minuto depois por 1 mL de clorofórmio. Depois de agitar por mais um minuto, gire os tubos de vidro em temperatura ambiente e 50 rpm por 30 minutos.

Em seguida, coloque a fração de proteína em pellet centrifugando a solução a 7 graus Celsius e 1.952 vezes g por 10 minutos. Transvasar cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de vidro com tampa de rosca de 15 ml, deixando para trás o sedimento que contém proteínas. Armazene o pellet a 20 graus Celsius para quantificação futura.

Adicione 1 mL de clorofórmio e aguarde um minuto. Em seguida, adicione 1 mL de água bidestilada e inverta o tubo de vidro com tampa de rosca com a amostra por 30 segundos. Depois de centrifugar a amostra como antes, remover e rejeitar a fase superior até à camada turva, mas não incluindo.

Seque as amostras em um concentrador a vácuo a 60 graus Celsius e armazene-as a 20 graus Celsius até que sejam necessárias. Para começar, encha até 5 mL de cada solução na câmara de vidro correspondente. Adicione qualquer tipo de papel de filtro para aumentar a velocidade de funcionamento em cada câmara.

Pré-incube uma placa de vidro HPTLC sílica gel 60 de 20x10cm na primeira solução em execução. Quando a solução em funcionamento atingir o topo da placa, seque-a por 10 minutos a 110 graus Celsius. Dissolva o pellet lipídico, previamente obtido após secagem com concentrador a vácuo, no volume desejado de solução de clorofórmio:metanol 1:1 e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius para dissolver.

Em seguida, use uma régua e um lápis macio para marcar os pontos de carregamento para o número desejado de amostras mais pelo menos um padrão. Marque a distância de corrida em aproximadamente 4 cm para a primeira solução de corrida e em aproximadamente 6 cm para a segunda solução de corrida. Para carregar as amostras, lave a seringa de 10 microlitros três vezes em clorofórmio 1:1:metanol antes de carregar cada nova amostra.

Carregue 10 microlitros de cada amostra gota a gota, tentando concentrar a amostra na menor área possível. Coloque a placa verticalmente na primeira câmara com a solução de corrida um. Certifique-se de que a placa esteja paralela à parede da câmara de vidro para obter uma velocidade de migração uniforme.

Tome cuidado para que as placas sejam colocadas paralelamente à parede posterior das câmaras de vidro e que as frentes do solvente não se afastem muito para garantir que os lipídios sejam separados de forma eficiente. Quando a linha de solvente atingir a primeira marca, remova a placa, seque-a e coloque-a na segunda solução. Repita etapas semelhantes para a segunda e para a terceira soluções em execução.

Deixe a placa na solução até que a frente do solvente atinja o topo da placa. Em seguida, remova o prato e seque-o em temperatura ambiente por um minuto. Coloque a placa na solução de sulfato de cobre por sete segundos.

Depois de secar bem o prato, leve ao forno por sete minutos a 170 graus Celsius. Retire o prato do forno e deixe esfriar. Para realizar HPLC, conecte a coluna a um cartucho de proteção no instrumento e aqueça-o a 32 graus Celsius.

Use o metanol como fase móvel a uma taxa de fluxo de 1 mL por minuto e 65 bar. Defina o detector UV para medir em 202 nanômetros para quantificar a quantidade de colesterol em cada amostra. Lave bem a máquina de HPLC antes de analisar as amostras e estabeleça uma curva padrão de colesterol conforme descrito no protocolo de texto.

Finalmente, ressuspenda as amostras em 500 microlitros de clorofórmio 1:1: metanol em frascos de vidro de 1,5 mL de cor âmbar com tampas de rosca de PTFE vermelho/silicone branco antes de carregá-las no instrumento de HPLC. Aqui é mostrado o perfil lipídico dos neutrófilos em uma placa de HPTLC. Os lipídios podem ser identificados comparando as distâncias de migração com o padrão.

Também é mostrado um cromatograma HPLC mostrando dois grandes picos. O primeiro pico pouco antes de dois minutos é o clorofórmio. O segundo grande pico em cinco minutos é o colesterol.

Aqui são mostradas as curvas padrão de colesterol determinadas por HPLC e por HPTLC. A curva padrão obtida por HPLC é linear em uma faixa de concentração mais ampla em comparação com a curva padrão de HPTLC. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar neutrófilos derivados do sangue humano e, posteriormente, analisar sua composição lipídica.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas de nitrilo para proteger as mãos contra a exposição perigosa ao clorofórmio: metanol e também para trabalhar sob uma capela de exaustão. Experimentos futuros fornecerão mais informações sobre os mecanismos envolvidos na formação de NET e funções gerais de neutrófilos que ainda não são totalmente compreendidas. Não se esqueça de que trabalhar com células primárias derivadas do sangue humano requer permissão ética, bem como precauções de segurança apropriadas, como trabalhar em um respectivo laboratório de biossegurança para evitar a exposição ao risco de patógenos humanos.

Finalmente, o objetivo do nosso estudo é encontrar novos alvos terapêuticos contra uma infecção baseada no sistema imunológico inato e, especialmente, a composição lipídica é muito interessante para nós, pois nos ajudará a entender por que o neutrófilo está agindo antimicrobiano contra uma infecção.