Name: Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a analisar a composição lipídica de neutrófilos humanos usando HPTLC e HPLC. Este método revela o papel do colesterol na formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, auxiliando pesquisas em imunologia.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Akademie für Tiergesundheit (AFT) e uma bolsa de estudos do programa de doutoramento, &quot;Animal e Zoonoses Infecções&quot;, da Universidade de Medicina Veterinária de Hanover, Alemanha, desde a Ariane Neumann.

A coleta de sangue periférico neste protocolo foi aprovado pela comissão de ética em pesquisa humanos local. Todos os seres humanos desde que o seu consentimento informado por escrito. 1. Isolamento de neutrófilos humanos de sangue derivadas por centrifugação em gradiente de densidade <ol><li> Isolamento de neutrófilos derivados do sangue humano <ol><li> Camada de ~ 20 ml de sangue para 20 ml de diatrizoato / solução de dextrano de sio perto de uma chama e sem misturar. </li><li> Centrifugar durante 30 minutos a 470 x g sem travão. </li><li> Remover as células mononucleares e a camada de plasma amarelado. Transferir a fase de células polimorfonucleares (PMN) (segunda fase com células de acumulação; Figuras 1 e 2) para um novo tubo de 50 mL e preenchê-lo até 50 mL com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS). </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 470 xg, com travão. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 mL de água estéril foR 5 s, para lisar os eritrócitos. </li><li> encher imediatamente até 50 mL com PBS 1x e centrifuga-se durante 10 min a 470 x g. </li><li> Remover o sobrenadante. O sedimento deve ser de cor branca. Se ele ainda estiver vermelho, repita os passos 1.1.5 e 1.1.6. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1.000 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) médio. Contar o número de células por meio da coloração com azul de tripano num hemocitómetro sob um microscópio de luz. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células em meio RPMI a uma concentração de 2 x 10 6 / mL. Aproximadamente 2,5 x 10 7 neutrófilos podem ser colhidas a partir de 20 ml de sangue. </li></ol></li><li> O tratamento farmacológico de neutrófilos para análise de lípidos <ol><li> Use 5 x 10 7 culas a partir do passo 1.1.9. Ajustar o número de células em forma pura Hank&#39;s Solução Salina Equilibrada (HBSS) na presença ou ausência de MβCD 10 mM ou 25 nM de PMA, em um volume total de 300 ul num tubo de reacção de 1,5 mL. </li><li> Incubar as amostras notubos de reacção de 2 h a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 470 xg, com travão. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 300 uL de HBSS. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 470 xg, com travão. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de clorofórmio / metanol (1: 1), homogeneizar com uma cânula de 26-G, pela sucção da amostra dentro e para fora para uma seringa de 1 mL de 10 vezes, e armazenar as amostras à temperatura de -20 ° C. </li></ol></li><li> O tratamento farmacológico de neutrófilos para a quantificação NET por imunofluorescência <ol><li> Prepare a poli-L-lisina-revestidas placas de 48 cavidades com lamelas de vidro. <ol><li> Coloque uma lamela de vidro de 8 mm em cada cavidade, adicionar 55 mL de solução estéril de 0,01% de Poli-L-Lisina, e incubar durante ~ 20 min a temperatura ambiente (RT). </li></ol></li><li> Lavar duas vezes com 200 ul de 1x PBS. Armazenar as placas com 200 de 1x PBS por poço num frigorífico até serem necessários. </li><li> Carroefully adiciona-se 100 uL de suspensão de células (2 x 10 5/100 uL) a partir do passo 1.1.9 por cavidade no centro de cada lamela. </li><li> Adicionar 100 por po de ambos o MβCD final de 10 mM ou o final de 25 nM PMA. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 370 xg, com travão. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 370 xg, com travão. </li><li> Fixar as células com 155 uL de PFA a 4%, embrulhá-los em filme plástico de parafina, e armazená-los durante a noite a 4 ° C ou durante 10 min a RT. NOTA: Para os dados sobre a formação de NET induzida por MβCD, ver Neumann et ai. 15. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento lipídico e Análise de neutrófilos derivados do sangue humano <ol><li> Isolar os lípidos a partir dos neutrófilos derivados do sangue periférico humano à base de Bligh e Dyer 22 e Brogden et al. 23 <ol><li&gt; Leve neutrófilos do passo 1.2.6 e colocá-los no gelo. </li><li> Em gelo, pipetar os neutrófilos (presentes em metanol e solução de clorofórmio) para um tubo de vidro com tampa de rosca de 15 ml com um (PTFE) politetrafluoroetileno vedação e homogeneizá-los por agitação durante 1 min. Usar tubos de vidro para impedir que os lípidos de ligação a superfícies de plástico. Uso de PTFE tampões para evitar a contaminação a partir de borracha / plástico. </li><li> Adicionar 2 mL de metanol, seguido de 1 min mais tarde por 1 mL de clorofórmio. Agitar mais uma vez durante 1 min. </li><li> Rodar os tubos de vidro à temperatura ambiente e 50 rpm durante 30 min. </li><li> Sedimentar a fracção de proteína por centrifugação da solução, a 7 ° C e 1952 x g durante 10 min. </li><li> Decantar o sobrenadante cuidadosamente para um novo tubo com tampa de rosca de 15 mL glass, deixando o sedimento contendo proteína atrás. Armazenar o sedimento a -20 ° C para futuro quantificação. </li><li> Adicionar 1 mL de clorofórmio, esperar um minuto, adicionar 1 mL de água duplamente destilada, e inverter o tubo de vidro com tampa de rosca com a amostra durante 30 s. </li&gt; <li> Centrifugar a 7 ° C e 1952 x g durante 10 min e eliminar a fase superior, para baixo, mas não incluindo, a camada turva. </li><li> Se necessário, realizar um outro passo opcional de purificação por repetição do passo 2.1.8. </li><li> Secam-se as amostras em um concentrador de vácuo a 60 ° C e armazená-las a -20 ° C até ser necessário. </li></ol></li><li> Cromatografia em camada fina de elevado rendimento (HPTLC) para semi-quantificar a quantidade de vários lipidos, incluindo o colesterol, fosfolípidos, e esfingomielina <ol><li> Preparar os seguintes quatro soluções de funcionamento e a solução de coloração. <ol><li> Solução 1: Misturar acetato de etilo (26,6%), 1-propanol (26,6%), clorofórmio (26,6%), metanol (26,6%), e cloreto de potássio (9,6%). Prepare de KCl por dissolução de 0,25 g de KCl em 100 mL de água de HPLC de qualidade. </li><li> Solução 2: Misturar n-hexano (73%), éter dietílico (23%), e ácido cítrico (2%). </li><li> Solução 3: 100% de n-hexano. </li><li> Preparar a solução de coloração pelamistura de água destilada (90 ml) com 7,5 g de sulfato de cobre, e, em seguida, adicionar 10 mL de ácido fosfórico. </li></ol></li><li> Encha até 5 mm de cada solução numa câmara de vidro separada. Adicionar qualquer tipo de papel de filtro para aumentar a velocidade de execução em cada câmara. </li><li> Pré-incubar uma HPTLC de gel de sílica 60 da placa de vidro de 20 x 10 cm da primeira solução de funcionamento até que a solução de funcionamento atinge o topo da placa. Em seguida, secar durante 10 min a 110 ° C. NOTA: Estas placas podem ser armazenadas para uso futuro em folha de alumínio e secou-se durante 10 min a 110 ° C antes de usar. </li><li> Dissolve-se o sedimento de lípidos obtida a partir do passo 2.1.10 em 200 ul de clorofórmio / metanol (1: 1) solução e incubar durante 15 min a 37 ° C para dissolver. </li><li> Usar uma régua e um lápis macio para marcar os locais de carregamento para o número de amostras desejado, além de pelo menos um padrão. Marque a distância percorrida a aproximadamente 4 cm e 6 cm para a primeira e segunda solução de execução, respectivamente. </li><li> Para carregar as amostras, lavar a seringa de 10 pL de 3 vezes em clorofórmio / metanol (1: 1) antes de carregar cada nova amostra. Carga de 10 ul de cada amostra, gota a gota, tentando concentrar a amostra na menor área possível. As amostras devem ser carregados pelo menos em duplicado. </li><li> Colocar a placa verticalmente para dentro da primeira câmara com uma solução de 1 (passo 2.2.1.1) em execução. Assegure-se que a placa é paralela à parede da câmara de vidro para atingir uma velocidade de migração uniforme. </li><li> Uma vez que a linha de solvente atingiu a primeira marca, remover a placa, secá-lo e colocá-lo na segunda solução. Repetir os passos semelhantes, para o segundo e para as soluções de terceiros de funcionamento; deixar a placa na solução até que a frente de solvente atingir o topo da placa e, em seguida remover e secá-lo a temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Coloque placa em solução de sulfato de cobre durante 7 s. Remova a placa, secá-la completamente, e cozê-la num forno durante 7 min a 170 ° C. Aguarde até que o prato para esfriar. </li><li> Using uma cromatografia em camada fina e software de análise de gel, bem como um software de processamento de imagem, digitalizar e analisar tal como descrito anteriormente por Brogden et al. 23. </li></ol></li><li> Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para quantificar a quantidade de colesterol <ol><li> Anexar uma coluna 100 x 4,6 mm a um cartucho de guarda mm 5 m / 4,6 e aquecê-la a 32 ° C. Utilizar metanol como a fase móvel a um caudal de 1 mL / min a 65 bar e um detector de medição UV a 202 nm para quantificar a quantidade de colesterol, em cada amostra. </li><li> Lava-se a máquina de HPLC completamente antes de analisar as amostras, executando as seguintes etapas: a limpeza da bomba, lavagem da agulha, enxaguar o vaso, purgar a seringa, e de se lavar a purga da bomba. Lave todos com água. Por fim, realizar uma purga de sistema com metanol a um caudal de 5 mL / min durante 5 min. </li><li> Para estabelecer uma curva padrão de colesterol, preparar, pelo menos, 4 concentraes variandoa partir de 0,05 mg / mL a 2 mg / mL de colesterol em clorofórmio / metanol (1: 1) 24. </li><li> Ressuspender as amostras obtidas a partir do passo 2.1.10 em 500 mL de clorofórmio / metanol (1: 1) em frascos de 1,5 mL glass de cor âmbar com tampa de rosca de PTFE vermelho / tampas de silicone branco. </li><li> Quantificar as concentrações de colesterol utilizando o padrão preparado no passo 2.3.3. NOTA: inserir o protocolo de amostragem, começando com, pelo menos, um padrão e um controlo negativo, seguido pelas amostras. </li><li> Expressar os resultados como a área sob a curva e comparar entre amostras apropriados utilizando qualquer software estatístico. Nota: Os resultados também pode ser quantificado contra uma curva padrão e podem ser mostrados como a quantidade total de colesterol por mL, g, ou o número de células. A equação da curva padrão deve ser calculado utilizando os valores obtidos no passo 2.3.3. </li></ol></li></ol> 3. visualização e quantificação das redes <ol><li> Visualization de redes NOTA: A visualização das redes é baseado no trabalho previamente publicado por Neumann et al. 15. <ol><li> Lavam-se as amostras fixadas a partir do passo 1.3.8 três vezes com 200 uL de PBS 1x. </li><li> Bloco e permeabilizar com 100 uL de BSA a 2%, 0,2% de Triton X-100 em PBS por poço durante 45 minutos a RT. </li><li> Adicionar 100? L de anticorpos primários: anticorpo monoclonal de ratinho anti-DNA-histona 1-anticorpo (diluir o material com 2,2 mg / ml de 1: 5000 em PBS contendo 2% de BSA e 0,2% de Triton X-100) ou anticorpo policlonal contra mieloperoxidase (MPO; de coelho anti-MPO; diluído 1: 300 em PBS contendo 2% de BSA e 0,2% de Triton X-100). Incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes com 200? L de PBS 1x. </li><li> Adicionar 100 uL de anticorpo secundário (marcado com fluorescência de cabra anti-ratinho, 1: 1000 em BSA-PBS-Triton X-100 e de cabra anti-coelho, 1: 1000 de BSA-PBS-Triton X-100) durante 1 h a TA no escuro. </li><li> Lavar 3 vezes com 200 &amp; #181; L de PBS 1x. </li><li> Remover lamelas usando uma pinça e colocá-los de face para baixo com 3 mL de meio de montagem contendo DAPI em lâminas de vidro. </li><li> Examinar as amostras utilizando uma base de microscópio invertido confocal de fluorescência equipado com um HCX PL APO 40X 0,75-1,25 óleo objectiva de imersão 15. </li></ol></li><li> A quantificação dos núcleos de libertação da NET <ol><li> Abra um software de processamento de imagem (por exemplo, ImageJ) e arraste e solte imagem de interesse para a barra de ferramentas. </li><li> Clique em &quot;Plugins&quot;, &quot;Analisar&quot; e &quot;Contador de células&quot;. </li><li> Pressionar o botão &quot;Inicializar&quot; na janela do contador e escolher um tipo de contador (por exemplo, clique no dia 7 no vermelho para células libertador de NET e 8 em amarelo para células não desprendimento, como apresentado na Figura 6B-I e II). NOTA: Os critérios de células NET-positiva: positivamente coradas núcleo verde + um nucleu menos densos (perda de lobulação) ou uma perda da forma redonda do núcleo + um aumento do tamanho do núcleo, ou uma ocorrência de uma extracelular distinta ramificação. </li><li> Clique cada aderente de células com os critérios acima e escrever o número de células contadas em uma folha de dados de um software de análise. </li><li> Calcular a percentagem de células libertador de líquido a partir das número de células contadas de células-NET libertando e de não desprendimento. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+rafts+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane rafts in host-pathogen interactions.</a> Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).</li>
<li>Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25866715">Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients.</a> Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962(2015).</li>
<li>Bavari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft+microdomains%3A+A+gateway+for+compartmentalized+trafficking+of+Ebola+and+Marburg+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses.</a> J Exp Med. 195, 593-602 (2002).</li>
<li>Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+rafts+in+the+pathogenesis+of+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections.</a> Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).</li>
<li>Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+caveolae+act+as+an+entry-port+for+group+A+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci.</a> Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).</li>
<li>Grassme, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa+requires+ceramide-rich+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts.</a> Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).</li>
<li>Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+sphingolipids+in+microbial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of sphingolipids in microbial pathogenesis.</a> Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).</li>
<li>Gatfield, J., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+cholesterol+in+entry+of+mycobacteria+into+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages.</a> Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).</li>
<li>Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRapini%2C+RP+%22Dermatology+2-Volume+Set%22">Dermatology 2-Volume Set</a>. , St. Louis: Mosby. (2007).</li>
<li>Tamilselvam, B., Daefler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+targets+cholesterol-rich+host+cell+membrane+domains+for+entry+into+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages.</a> J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).</li>
<li>Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Salmonella+pathogenicity+island+1+secretion+system+directs+cellular+cholesterol+redistribution+during+mammalian+cell+entry+and+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking.</a> Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).</li>
<li>Gilk, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+host+cells+in+the+absence+of+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol.</a> PLoS Pathog. 9 (1), e1003107(2013).</li>
<li>Tuong, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Ror%CE%B11+and+cholesterol+25-hydroxylase+expression+attenuates+phagocytosis+in+male+Roralphasg%2Fsg+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice.</a> Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).</li>
<li>Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+cholesterol+depletion+and+its+effect+on+the+phagocytosis+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+alterations+in+human+blood-derived+neutrophils+lead+to+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps.</a> Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+turned+inside-out%3A+antimicrobial+defense+by+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps.</a> J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Lauth, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+Protein+Allows+Group+A+Streptococcal+Survival+in+Phagocyte+Extracellular+Traps+through+Cathelicidin+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition.</a> J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).</li>
<li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+Enhance+Formation+of+Phagocyte+Extracellular+Traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps.</a> Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems%2C+lipid+rafts%2C+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+membrane+lipids+and+lipid+rafts+in+common+carp+%28Cyprinus+carpio+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L).</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).</li>
<li>Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+separation+and+determination+of+12+cholesterol+oxidation+products+in+fish%3A+comparative+study+of+RI%2C+UV%2C+and+APCI-MS+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors.</a> J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).</li>
<li>Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+and+quantitative+determination+of+selected+aminoglycoside+antibiotics+by+thin-layer+chromatography+and+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry.</a> J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).</li>
<li>Maalouf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+lipid+composition+in+Fabry+disease+leads+to+an+intracellular+block+of+the+detergent-resistant+membrane-associated+dipeptidyl+peptidase+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV.</a> J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).</li>
<li>Correia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori%27s+cholesterol+uptake+impacts+resistance+to+docosahexaenoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid.</a> Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).</li>
<li>Gorudko, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-induced+activation+of+plasma+membrane+NADPH+oxidase+in+cholesterol-depleted+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils.</a> Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).</li>
<li>Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol%3A+A+modulator+of+the+phagocyte+NADPH+oxidase+activity+-+A+cell-free+study%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study.</a> Redox Biol. 3, 16-24 (2014).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+is+immunomodulatory+and+vasculoprotective+in+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harbour+seal+%28Phoca+vitulina%29+PMN+and+monocytes+release+extracellular+traps+to+capture+the+apicomplexan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii.</a> Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).</li>
<li>Chuammitri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+heterophil+extracellular+traps+%28HETs%29%3A+novel+defense+mechanism+of+chicken+heterophils%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils.</a> Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).</li>
<li>Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+cast+NETs%3A+Neutrophil+extracellular+traps+are+released+from+fish+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils.</a> Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).</li>
<li>Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrimp+hemocytes+release+extracellular+traps+that+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria.</a> Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).</li>
<li>Hawes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA%3A+the+tip+of+root+defenses%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA: the tip of root defenses?</a> Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft-associated+%CE%B2-adducin+is+required+for+PSGL-1-mediated+neutrophil+rolling+on+P-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin.</a> J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).</li>
<li>Ermert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections.</a> J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).</li>
<li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos descritos aqui podem ser utilizados para analisar os lípidos específicos, tais como colesterol, por HPTLC ou HPLC e para investigar os efeitos de alterações lipídicas farmacológicos sobre a formação de redes (ver Neumann et ai. 15). HPTLC é um método relativamente de baixo custo e simples para analisar uma larga gama de lipidos em um grande número de amostras. Este método tem sido usado em muitas áreas de investigação, incluindo quantificação antib...

<html> Os lípidos foram mostrados para desempenhar um papel importante na homeostase celular, morte celular, as interacções hospedeiro-patogénio, e libertação de citoquinas 1. Ao longo do tempo, o interesse eo conhecimento sobre o impacto dos lipídios na interação patógeno-hospedeiro ou inflamação têm aumentado, e várias publicações confirmam o papel central de certos lipídios, especialmente o colesterol esteróide, em respostas celulares. O tratamento farmacológico com estatinas, que são utilizados como inibidores da biossíntese do colesterol através do bloqueio 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima-A-redutase (HMG-CoA-redutase), podem actuar como agentes anti-inflamatórios, diminuindo os níveis séricos de interleucina 6 e proteína C-reactiva 2. Colesterol e estruturas enriquecido-glicoesfingolipídeos pode ser utilizado por vários agentes patogénicos, tais como bactérias e vírus, como uma porta de entrada para o hospedeiro 3, 4, 5,class = &quot;xref&quot;&gt; 6. Os esfingolípidos (por exemplo, esfingomielina) foram mostrados para ser usado por agentes patogénicos para promover a sua patogenicidade 7. Em macrófagos, domínios para entrar nas células uso micobactérias colesterol enriquecido; uma diminuição do colesterol inibe a absorção de micobactérias 8. Além disso, a infecção de macrófagos com Francisella tularensis, um agente zoonótica responsável pela tularemia (também conhecida como febre do coelho) 9, levou a uma infecção que foi abolido quando o colesterol foi descarregada a partir das membranas 10. Da mesma forma, a invasão de células hospedeiras de Escherichia coli por meio de estruturas ricas em lípidos foi demonstrado ser 4 dependente de colesterol. Além disso, a Salmonella typhimurium experiências de infecção de células epiteliais demonstrado que o colesterol é essencial para a entrada de agentes patogénicos para as células 11. Colesterol a inibição da exaustãod a absorção de Salmonella 11. Além disso, um estudo recente por Gilk et al. demonstrou que o colesterol desempenha um papel importante na captação de Coxiella burnetti 12. Além disso, Tuong et al. encontrado que 25-hidroxicolesterol desempenha um papel crucial na fagocitose por lipopolissacarídeo (LPS) estimuladas por macrófagos 13. Fagocitose foi reduzida quando os macrófagos foram tratados farmacologicamente para esgotar colesterol 14. Assim, colesterol e outros lípidos parecem desempenhar um papel importante na infecção e inflamação, uma vez que seu esgotamento pode reduzir o risco de invasão de vários patógenos 10, 11, 12. Recentemente, fomos capazes de mostrar que as alterações lipídicas, especialmente o esgotamento de colesterol do celular, induzir a formação de extracellula neutrófilosarmadilhas r (NETS) em neutrófilos derivados do sangue humano 15. Desde a descoberta de redes em 2004, eles foram mostrados para desempenhar papéis críticos na armadilha bacteriana, e, portanto, impedindo a propagação da infecção 16, 17. NET consistem num esqueleto de ADN associado com histonas, proteases, e péptidos antimicrobianos 16. A libertação das redes por neutrófilos pode ser induzido por patogénios invasores 18, 19 e às substâncias químicas, tais como de forbol-miristato-acetato (PMA) ou estatinas 16, 20. No entanto, os mecanismos celulares detalhados, e especialmente o papel dos lipídios neste processo, ainda não são totalmente claras. A análise de lípidos pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em uma grande variedade de processos e interacções celulares, tais como a libertação de NET. CholesteRol e esf ingomielina são constituintes importantes das microdomínios da membrana celular e de lípidos, onde eles agregam estabilidade e facilitar a aglomeração das proteínas envolvidas no tráfico de proteína e eventos de sinalização 21. Para investigar o papel mecanicista de certos lípidos, agentes farmacológicos anfifílicos, tais como o oligossacarídeo cíclico metil-β-ciclodextrina (MβCD), pode ser usado para alterar a composição lipídica de uma célula e para reduzir o colesterol in vitro 15. Aqui, apresentam-se um método para utilizar HPTLC para analisar a composição lipídica de neutrófilos em resposta a MβCD. HPLC foi usada para confirmar o nível de colesterol na população de neutrófilos. Além disso, descreve-se um método para visualizar a formação de redes por microscopia de imunofluoresccia nos neutrófilos derivado de sangue humano em resposta a MβCD.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Isolamento de neutrófilos, coloração NET e quantificação</td></tr><tr><td>Alexa Flour 633 cabra anti-coelho IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MPO&alpha; anticorpo</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3912-100G</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld-Neubauer melhorou a câmara de</td><td></td> <td>contagem CelerômicaMF-0640010</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal TCS SP5 AOBS com scanner tandem</td><td>Leica</td><td>DMI6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&agudo; s PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td>Diluir 1:10 em água para 1x solução de trabalho</td></tr><tr><td>Dy Light 488 conjugado altamente absorvido Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>35503</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>DNA/Histone 1 anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB3864</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.8</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>VWR</td><td>630-1554</td><td></td></tr><tr><td>Metil-&beta;-ciclodextrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4555-1G</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td>dissolver em água, aquecer até 65 &graus; C e adicione 1 N NaOH à solução clara PMA</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td>Stock 16 &micro; M, dissolvido em 1x PBS</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>AXIS-SHIELD</td><td>AN1114683</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidesvanecimento ProLong Gold com DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>PAA</td><td>E 15-848</td><td></td></tr><tr><td>HBSS com CaCl e Mg</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblue</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>Solução de 0,4%</td></tr><tr><td>Água</td><td>Carl Roth</td><td>3255.1</td><td>livre de endotoxinas</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td><forte>Número do catálogo&nbsp; </td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Isolamento e análise lipídica</td></tr><tr><td>1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33538</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>701 NR 10 &micro; l</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etila</td><td>Carl Roth</td><td>7336.2</td><td></td></tr><tr><td>Canullla 26 G</td><td>Braun</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>Cobre(II)sulfatopentahidratado</td><td>Merck</td><td>1027805000</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td></td></tr><tr><td>CP ATLAS software</td><td>Lazarsoftware</td><td>2,0</td><td></td></tr><tr><td>Chromolith RP-18 endcapped 100-4,6 mm coluna</td><td>Merck</td><td>152022</td><td></td></tr><tr><td>Cromatógrafo Líquido de Alto Desempenho Cromatógrafo</td><td>Hitachi</td><td>HITA 892-0080-30Y</td><td>Os paramaters dependem da máquina individual HPLC</td></tr><tr><td>Detector UV</td><td>de HPLC Hitachi</td><td>5410</td><td></td></tr><tr><td>Forno de Coluna HPLC</td><td>Hitachi</td><td>5310</td><td></td></tr><tr><td>Auto Amostrador</td><td>Hitachi</td><td>5260</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Bomba</td><td>Hitachi</td><td>5160</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>n-hexano</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30417</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Merck</td><td>49.361.000</td><td></td></tr><tr><td>Potters</td><td>LAT Garbsen</td><td>5 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>HPTLC gel de sílica 60</td><td>Merck</td><td>105553</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge mais dispositivo básico</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar cultura de células Placa de 48 poços, fundo plano</td><td>Sigma</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1198882</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>BD Tuberculin Syringe Only 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos de estudo de lipídios alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos extracelular traps

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

análise de lípidos realizada por cromatografia em camada fina de elevado rendimento (HPTLC) é um método relativamente simples e de baixo custo para analisar uma larga gama de lipidos. A função dos lípidos (por exemplo, em interacções hospedeiro-patogénio ou entrada de acolhimento) tem sido relatada a desempenhar um papel crucial em processos celulares. Aqui, mostramos um método para determinar a composição lipídica, com um foco no nível de colesterol de neutrófilos derivados do sangue primárias, por HPTLC em comparação com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O objectivo foi o de investigar o papel das alterações de lípido / colesterol na formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETS). libertação líquida é conhecido como um mecanismo de defesa do hospedeiro para evitar a propagação de agentes patogénicos no interior do hospedeiro. Portanto, os neutrófilos humanos derivadas do sangue foram tratadas com metil-β-ciclodextrina (MβCD) para induzir alterações lipídicas nas células. Usando HPTLC e HPLC, que demonstraram que o tratamento MβCD das células leva a lipídicoalterações associadas com uma redução significativa no teor de colesterol da célula. Ao mesmo tempo, o tratamento MβCD dos neutrófilos levou à formação de redes, como mostrado por microscopia de imunofluorescência. Em resumo, aqui se apresenta um método detalhado para estudar alterações lipídicas em neutrófilos e a formação de redes.

Neutrófilos derivados do sangue humano foram isolados por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 2). Para investigar o efeito de alterações lipídicas sobre os neutrófilos, as células foram tratadas com 10 mM de MβCD, que esgota o colesterol a partir da célula. Subsequentemente, os lípidos foram isolados a partir das amostras por Bligh e Dyer (Figura 1, painel da esquerda), como descrito por Brogden et al. 23. As ...

Lipídios são conhecidos por desempenhar um papel importante nas funções celulares. Aqui, descrevemos um método para determinar a composição lipídica de neutrófilos, com ênfase sobre o nível de colesterol, usando tanto HPTLC e HPLC para obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes da formação armadilha extracelular de neutrófilos.

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

O objetivo geral deste método é investigar mudanças na composição lipídica dos neutrófilos durante a liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando cromatografia em camada fina e HPLC. Este método pode ser usado para obter informações mais detalhadas sobre os mecanismos envolvidos na formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou brevemente denominadas formação de NET. A principal vantagem desse procedimento é que ele fornece informações sobre o papel dos lipídios na função geral dos neutrófilos, utilizando um protocolo fácil de seguir.O isolamento de células derivadas do sangue humano será demonstrado por uma ex-aluna de doutorado de nosso laboratório, Ariane Neumann. E ela será auxiliada por Friederike Reuner. A preparação de células para análise lipídica será demonstrada por Graham Brogden, um pós-doutorado em meu laboratório, e Diab Husein, um aluno de mestrado no programa de bioquímica.Para isolar neutrófilos derivados do sangue humano, coloque aproximadamente 20 mL de sangue em 20 mL de solução de diatrizoato de sódio / dextrana perto de uma chama, sem misturar. Centrifugue durante 30 minutos a 470 vezes g sem travar. É fundamental não misturar a fase

methods-to-study-lipid-alterations-neutrophils-subsequent-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para gerar e isolar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Os neutrófilos são isolados do sangue periférico e estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA) para produzir TNEs. Durante a incubação, os neutrófilos passam por um processo de morte celular (NETosis) para liberar NETs compreendendo cromatina descondensada misturada com proteínas citoplasmáticas granulares.

Uma técnica in vitro para gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos

Este vídeo demonstra a indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs em neutrófilos pré-marcados usando soro de paciente contendo anticorpos anticitoplasma de neutrófilos. Além disso, o uso de um corante de DNA impermeável e microscopia de fluorescência permite a visualização de NETs.

Indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos pré-marcados

Podemos descrever métodos para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro e visualizar a formação líquida em neutrófilos ao vivo usando microscopia de fluorescência. Também descritos são protocolos para quantificar a formação líquida e citrulinado histona H3 (citH3) expressão usando microscopia de imunofluorescência.

In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

Este protocolo descreve um ensaio de neutrófilos armadilha extracelular (NET) altamente sensível e alta taxa de transferência para a quantificação semi-automático de ex vivo NET formação pela microscopia confocal tridimensional de imunofluorescência. Este protocolo pode ser usado para avaliar a formação de líquido e degradação após estímulos diferentes e pode ser usado para estudar terapias NET-alvo potenciais.

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Uma série de métodos é descrita, incluindo o isolamento da lipoproteína de baixa densidade (LDL) do plasma humano, diferenciação de células HL-60 em células semelhantes a neutrófilos, preparação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) na presença de LDL e estimulação de células endoteliais aórticas humanas com uma mistura de NETs e LDL.

Estimulação de células endoteliais vasculares usando armadilhas extracelulares de neutrófilos na presença de lipoproteína de baixa densidade

Os neutrófilos de baixa densidade (LDN) aumentam significativamente em várias doenças. Os LDN são geralmente isolados por meio de classificação de células. Apresentamos um método prático para obter LDN puro e viável. Após a centrifugação do sangue periférico com gradiente de densidade, as células são incubadas com microesferas magnéticas e, em seguida, o LDN é separado por meio de colunas magnéticas.

Método rápido de microesferas magnéticas para purificação eficiente de neutrófilos de baixa densidade

Aprenda a analisar a composição lipídica de neutrófilos humanos usando HPTLC e HPLC. Este método revela o papel do colesterol na formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, auxiliando pesquisas em imunologia.

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

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