Ferramentas para estudar o papel da HMGB1 Protein Architectural no processamento de Helix distorcendo, DNA Site-specific intercadeias Crosslinks

O objetivo geral dos experimentos de imunoprecipitação de cromatina modificada e superenrolamento de DNA é estudar a associação e as modificações topológicas subsequentes induzidas por proteínas arquitetônicas em danos ao DNA específicos do local induzidos por agentes quimioterápicos ou carcinogênicos em células humanas. Essa metodologia nos permitirá abordar questões-chave sobre danos e reparos no DNA, o que deve facilitar a descoberta de novos alvos farmacológicos para a terapia do câncer. Nossa tecnologia nos permite direcionar danos ao DNA específicos do local e facilita a avaliação de processos críticos de reparo de DNA relevantes para o câncer humano.

Para começar, 24 horas antes da transfecção, colocar 400.000 células de mamíferos por placa de 60 milímetros em DMEM suplementado com 10% de FBS sem antibióticos. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. Em um tubo inferior redondo de 14 mililitros, combine 30 microlitros de agente transfeccionário em temperatura ambiente com 500 microlitros de meio de crescimento 1X que foi aquecido a 37 graus Celsius.

Em um segundo tubo, combine dois microgramas de plasmídeos contendo ICL direcionados por TFO em 500 microlitros de meio de crescimento 1X. Incube os tubos em temperatura ambiente por 10 minutos. Combine misture um com misture dois e pipete para cima e para baixo para misturar bem.

Em seguida, incube a solução à temperatura ambiente por 25 a 30 minutos. Em seguida, use PBS quente para lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione a mistura de transfecção gota a gota, distribuindo a solução uniformemente por toda a placa de células.

Adicione um mililitro de meio de crescimento ao prato e leve o volume final para dois mililitros. Misture bem e coloque as placas de cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quatro horas depois, substitua o meio por três mililitros de meio de crescimento com 10% de FBS e incube por mais 16 horas.

Após a incubação, adicione 80 microlitros de formaldeído fresco a 37% por placa às células e incube em temperatura ambiente no escuro por 10 minutos. Resfrie a reticulação do formaldeído adicionando 300 microlitros de glicina gelada por placa e incube por cinco minutos. Em seguida, remova o meio e use PBS resfriado para lavar as placas duas vezes.

Em seguida, depois de adicionar um milímetro de PBS resfriado, colete as células raspando em um tubo de microcentrífuga no gelo, mantendo as amostras no gelo o tempo todo. Prepare os grânulos celulares centrifugando a 13.400 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e coloque os pellets no gelo.

Use um mililitro de tampão A resfriado para ressuspender homogeneamente os pellets e incube no gelo por 10 minutos. Em seguida, pelete as células como antes. Agora, com um mililitro de Buffer B resfriado, ressuspenda homogeneamente os pellets e incube no gelo por 10 minutos com mistura ocasional por inversão.

Em seguida, jogue as células como antes. Depois de ressuspender as células novamente, em 200 microlitros de tampão B resfriado, adicione dois microlitros de nuclease microcócica, ou MNase, e incube a reação em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, pare a reação MNase colocando os tubos no gelo e adicionando 40 EDTA milimolares.

O nível de digestão pela nuclease microcócica é muito crítico, porque a superdigestão pode causar perda de sinal, enquanto a subdigestão pode causar muitos antecedentes inespecíficos. Após a peletização das células, ressuspenda os pellets em 100 microlitros de imunoprecipitação de cromatina, ou tampão ChIP, suplementado com coquetel de inibidores de protease. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de paredes finas.

Sonicar as amostras flutuando-as em um sonicador em banho-maria por 20 segundos, seguido de 20 segundos no gelo. Repita as etapas de sonicação nove vezes para gerar aproximadamente 800 a 1.200 fragmentos de pares de bases. A 20 microlitros das amostras sonicadas, adicione três microlitros de cloreto de sódio de cinco molares e um microlitro de RNase A.Vortex os tubos e incube-os a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, adicione dois microlitros de proteinase K e incube a 65 graus Celsius por duas horas. Depois de purificar as amostras, de acordo com o protocolo de texto, execute-as em gel de agarose a 1% e visualize com brometo de etídio. Em três tubos siliconizados pré-resfriados separados, adicione 30 microlitros de lisado e 70 microlitros de tampão ChIP 1X resfriado com inibidores de protease adicionados.

Adicione um micrograma de anticorpos anti-IgG, anti-histona H3 ou anti-HMGB1 aos respectivos tubos. Incubar durante a noite em câmara fria com rotação contínua. Na câmara fria, após ressuspender as esferas de proteína G, adicione quatro microlitros das esferas a cada tubo de reação e incube em uma câmara fria com rotação por mais duas a quatro horas.

Coloque os tubos em um rack magnético para pellet as contas e remova o sobrenadante. Adicione 200 microlitros de tampão 1X ChIP com coquetel inibidor de protease aos pellets e lave no frio com rotação por cinco minutos. Em seguida, com tampão ChIP 1X com alto teor de sal, faça uma lavagem adicional.

Em seguida, use 160 microlitros de tampão de eluição para ressuspender os pellets e incube a 37 graus Celsius com rotação por 30 minutos. Retire as contas e colete o sobrenadante em um tubo novo. Adicione seis microlitros de cloreto de sódio de cinco molares e dois microlitros de proteinase K e incube durante a noite a 65 graus Celsius.

Após purificar o DNA, de acordo com o protocolo de texto, realizar reações de PCR usando conjuntos de primers para a região ou regiões de interesse e resolver os produtos em um gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio. Antes de usar, descongele o tampão de síntese de reparo de DNA previamente preparado em gelo e adicione 40 milimolares de fosfocreatina e 2,5 microgramas de creatina fosfoquinase. Depois de preparar o tampão de superenrolamento 10X, de acordo com o protocolo de texto, use um microlitro de vaccinia topoisomerase 1 com tampão de superenrolamento 1X em uma reação de 10 microlitros para linearizar 300 nanogramas de plasmídeo superenrolado, PCA FG1.

Aos plasmídeos relaxados, adicione 25 microlitros de extrato de células HeLa recém-descongelado e tampão de síntese de DNA. Misture bem, adicione um microlitro de vaccinia topoisomerase 1 à reação e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Termine as reações adicionando 1% de SDS e 0,25 miligramas por mililitro de proteinase K e incube a 65 graus Celsius por duas horas.

Depois de fundir um gel de agarose 1% com tampão TPE 1X, adicione corante de carga de DNA às reações e carregue as amostras diretamente no gel com pelo menos quatro pistas de distância. Execute o gel por oito a 10 horas a dois volts por centímetro em 1X TBE para a primeira dimensão à temperatura ambiente para resolver os topoisômeros. Prepare dois litros de 1X TBE com três microgramas por mililitro de fosfato de cloroquina.

Mergulhe o gel em 200 mililitros da solução, coberto com papel alumínio por 20 minutos. Para eletroforizar o gel na segunda dimensão, gire o gel 90 graus no sentido horário e execute-o por quatro a seis horas a dois volts por centímetro em cloroquina contendo 1X TBE para resolver as superbobinas positivas e negativas. A quantidade de cloroquina no tampão de eletroforese e no gel é muito crítica, assim como o funcionamento do gel em uma tensão muito baixa para a segunda dimensão é muito crítico para separar as superbobinas positivas e negativas.

Após a coloração e descoloração do gel, de acordo com o protocolo de texto, use um imageador para visualizar a termodistribuição dos topoisômeros. Como visto neste gel, aproximadamente 79% dos plasmídeos que abrigam ICLs direcionados por TFO migram com uma mobilidade mais lenta através da matriz de gel de agarose quando comparados aos plasmídeos de controle não reticulados. Os ensaios de ChIP realizados em lisados de células U2OS humanas transfectadas com plasmídeo de controle ou plasmídeos contendo ICLs direcionados por TFO mostram enriquecimento de HMGB1 na região P-ICL em comparação com a região de controle quando imunoprecipitada com anticorpo anti-HMGB1.

Quando o HMGB1 foi esgotado das células por meio do tratamento com siRNA, o enriquecimento específico de P-ICL diminuiu. Quando as mesmas amostras foram imunoprecipitadas usando um anticorpo anti-IgG, foi detectada uma amplificação mínima da PCR. Finalmente, nesta figura, a eletroforese bidimensional em gel de agarose demonstra a modificação arquitetônica dos plasmídeos contendo ICL direcionados por TFO como superenrolamento negativo por HMGB1 em extratos de células HeLa.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em aproximadamente cinco dias, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar que todas as lavagens devem ser feitas na câmara fria, pois as lavagens em temperatura ambiente podem aumentar o sinal de fundo. Após esse procedimento, outros métodos, como a depleção de proteínas mediada por siRNA, seguida de ensaios de triagem de mutação, podem ser realizados para responder a perguntas, como: a proteína de interesse está envolvida no reparo do DNA?

Ou altera significativamente os espectros de mutação durante o processo? Essa técnica abriu caminho para estudar a associação entre proteínas e danos ao DNA específicos do local. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como estudar a associação de proteínas arquitetônicas para direcionar as ligações cruzadas do DNA e, posteriormente, determinar o efeito dessa associação na topologia do DNA.

Não se esqueça de que trabalhar com brometo de etídio pode ser extremamente perigoso e, portanto, equipamentos de proteção adequados devem ser sempre usados durante a realização deste experimento.