Name: Ferramentas para estudar o papel da HMGB1 Protein Architectural no processamento de Helix distorcendo, DNA Site-specific intercadeias Crosslinks (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprenda a estudar a associação de proteínas arquiteturais ao dano específico de DNA usando ensaios de imunoprecipitação de cromatina modificados e ensaios de superenrolamento de DNA em células humanas. Este método auxilia na descoberta de novos alvos farmacológicos para terapia do câncer.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório de Vasquez para discussões úteis. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de / Instituto de Saúde Nacional do Câncer [CA097175, CA093279 a KMV]; ea Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas [RP101501]. O financiamento para taxa de acesso aberto: Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional do Câncer [CA093279 a KMV].

1. Preparação de ICLs TFO-dirigidas no plasmídeo Substratos <ol><li> Incubar quantidades equimolares de pSupFG1 10,11 plasmídeo de DNA (DNA de plasmídeo de 5 ug é um bom ponto de partida) com psoraleno-AG30 conjugado TFO em 8 mL de tampão de ligação triplex [50% de glicerol, Tris 10 mM (pH 7,6), 10 mM de MgCl 2] e dH 2 o para um volume final de 40 ul num tubo de âmbar. Misture bem, pipetando para cima e para baixo. Incubar a reacção a 37 ° C banho de água durante 12 h. </li><li> Aquecer a lâmpada UVA para garantir a saída de potência total. Coloque a reação triplex em filme de parafina, e coloque o filme de parafina no gelo sob a (nM 365) lâmpada UVA. Colocar um filtro de Mylar entre a lâmpada e a reação. </li><li> UVA irradiar para uma dose total de 1,8 J / cm 2. Armazenar as amostras a 4 ° C para posterior utilização. Cuidado: Usar óculos de protecção adequado e roupas com irradiação UVA. </li><li> Linearizar 200 ng do plasmídeo preparado acima com a restriction enzima Eco R1 em um volume total de 20 ul usando tampão fornecido pelo fabricante de 10x. Calor desnaturar a enzima durante 20 min a 65 ° C. Rodar as amostras durante 10 min a 10000 xg e armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare 50x tampão alcalino [1,5 M de NaOH, 50 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)]. Adicionar 0,5 mg de agarose com 50 ml de dH 2 O. Ebulição para dissolver a agarose e colocá-lo em um banho de água a 50 ° C. </li><li> Depois de a temperatura da agarose é dissolvido até 50 ° C, adicionar 1 ml de tampão 50x alcalina, e misturá-lo em seguida, verter o gel em placa de gel. Permitir que o tempo para o gel solidificar à temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Adicionar 4 ul de EDTA 0,5 M para os 20 ul de amostra de ADN linearizado e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar tampão de carregamento de gel alcalino 6x (NaOH a 300 mM, EDTA 6 mM, 18% (w / v) de polissacárido de elevado peso molecular, 0,06% de verde de bromocresol em dH2O) para as amostras e para uma escada de DNA de 1 kb. NOTA: É importante usar tampão de carregamento de gel alcalino 6x, por favor veja a discussão. </li><li> amostras carregar no gel na câmara fria e executado durante a noite em tampão alcalino 1x (12-16 h) em 3,2 volts por cm. Depois de as amostras terem entrado no gel, colocar uma placa de vidro no topo do gel para evitar que ele flutua. </li><li> Neutraliza-se a amostras embebendo o gel em tampão de neutralização [1 M de Tris-Cl (pH 7,6), NaCl 1,5 M, acetato de sódio 3 M (pH 5,2)] durante 45 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Corar o gel para o ADN com 4 ul de 1% de brometo de etídio (EtBr) em 50 ml de água durante 1 h à temperatura ambiente. Destain com água durante 15 min. Visualizar o DNA utilizando um sistema de imagem. Cuidado: EtBr é um potente agente mutagénico e pode ser absorvida através da pele. Evitar o contacto directo com EtBr. </li></ol> 2. Transfecção e imunoprecipitação de TFO dirigidos ICL-contendo plasmídeos em células humanas <ol><li> Placa de 400.000 células de mamífero (por exemplo, S U2OScélulas steosarcoma) por milímetro prato 60 em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) sem antibióticos 24 h antes da transfecção. Incubar as células durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Antes da transfecção, o meio de crescimento quente e salino tamponado com fosfato (PBS) a 37 ° C num banho de água. Aquecer o reagente de transfecção até à temperatura ambiente. </li><li> Incubar 30 ul de reagente de transfecção com 500 ul de meio de crescimento 1x (mix 1) e 2 ug de TFO dirigidos ICL contendo plasmídeos em 500 ul de 1x meio de crescimento (mistura 2), em separado 14 mL de tubos de fundo redondo durante 10 min a temperatura do quarto. </li><li> Adicionar mix 1 para misturar 2, misture bem por pipetagem cima e para baixo. Incubar durante 25-30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS quente. Adicionar a mistura de transfecção de uma forma gota a gota, distribuindo uniformemente por toda a placa de células. Adicionar 1 ml de meio de crescimento para a placa e levar o volume final de 2 ml. misture nósll. Colocar as placas de cultura na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 4 horas. </li><li> Substituir os meios de comunicação com os meios 3 mL de crescimento suplementado com 10% de FBS, e incubar ainda mais durante 16 horas. Não use antibióticos. </li><li> Tratar as células com 80 uL de 37% de formaldeído por placa fresca para uma concentração final de aproximadamente 1% e incubar durante 10 min à temperatura ambiente na ausência de luz. Atenção: O formaldeído é tóxico e deve ser manuseado de acordo com as suas instruções de segurança. exposição ao formaldeído pode causar danos à pele, olhos e trato respiratório. </li><li> Extingue-se a reticulação de formaldeído por adição de 300 ul de glicina arrefecida (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) por placa e incubar durante 5 min. Remover os meios e lava-se duas vezes com PBS arrefecido, e em seguida, recolher as células por raspagem em 1 ml de solução arrefecida (4 ° C) em PBS num tubo de microcentrífuga. Manter as amostras em gelo em todos os momentos. </li><li> Prepare os sedimentos celulares por centrifugação a 4 ° C durante 5 minutos, umat 13.400 xg utilizando uma mesa refrigerada centrífuga. Pipete para fora o sobrenadante e colocar o agregado de células em gelo. </li><li> Homogeneamente ressuspender o pellet em 1 ml de solução arrefecida (4 ° C) de tampão A (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) e incubar em gelo durante 10 min. Misture ocasionalmente invertendo o tubo. células de pellets como antes (veja o passo 2.9 acima). </li><li> Homogeneamente ressuspender o pellet em 1 ml de solução arrefecida (4 ° C) Tampão B (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) e incubar em gelo durante 10 min, com mistura ocasional por inversão. células por centrifugação como anteriormente (veja o passo 2.9 acima). </li><li> Ressuspender as células de novo em 200 ul de tampão B. refrigeradas Adicionar 2 mL de Micrococo nuclease (MNase) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Misture reacção, ocasionalmente, sacudindo o tubo. Parar a reacção de MNase colocando o tubo em gelo e adicionando EDTA 40 mM. células de pellets como antes (veja o passo 2.9 acima). </li><li> Ressuspender as células em 100 immunopr cromatina ul 1xecipitation tampão (ChIP) tampão (fornecidos em kits disponíveis comercialmente), suplementado com um cocktail inibidor de protease. </li><li> Colocar as células ressuspensas em um tubo de microcentrífuga de parede fina. Sonicar as amostras por flutuante-los no banho sonicador de água durante 20 segundos seguido por 20 segundos de incubação sobre gelo. Repita os passos sonicação 9 vezes para gerar ~ 800-1200 fragmentos pb. <ol><li> A 20 ul das amostras sonicadas adicionar 3 mL de NaCl 5 M e 1 ul de ARNase A: misturar bem por agitação em vórtex e incubar a 37 ° C durante 30 min. Subsequentemente, adiciona-se 2 ul de proteinase K e incubar durante 2 horas a 65 ° C. Purifica-se as amostras utilizando um kit de purificação de PCR. Executar amostras em 1% de gel de agarose e visualização com EtBr. NOTA: A intensidade máxima do DNA resultante deve ser igual ou abaixo de 1.000 pb. </li></ol></li><li> Em três tubos separados, adicionar 30 ul de lisado num tubo siliconizado pré-refrigerada e, em seguida, adicionar 70 ul de tampão 1x ChIP gelada com inibidores da protease adicionada. Adicione 1 μg de anti-imunoglobulina G (IgG), anti-histona H3 (como um controlo positivo), ou anticorpos anti-HMGB1 para os respectivos tubos. Incubar durante a noite em uma sala fria com rotação contínua. </li><li> grânulos Ressuspenda proteína G homogeneamente na sala fria. Adicione 4 mL de esferas de proteína G por tubo e incubar por mais 2-4 horas na sala fria com rotação. </li><li> Usando uma cremalheira magnética, sedimentar as pérolas e remover o sobrenadante. Adicionar 200 ul de tampão 1x ChIP misturado com cocktail de inibidores de protease para o sedimento e lava-se durante 5 min na câmara fria com rotação. Repita duas vezes lavar. </li><li> Execute uma lavagem adicional com elevado teor de sal tampão 1x chip (contendo NaCl 70 mM). </li><li> Ressuspender as peletes com tampão de eluição de 160 ul (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) e incubar a 37 ° C com rotação durante 30 min. </li><li> Sedimentar as pérolas e recolher o sobrenadante num tubo fresco. Adicionar 6 ul de NaCl 5 M e 2 ul de proteinase K, e incubar durante a noite a 65° C. </li><li> Purifica-se o ADN utilizando um kit de purificação de produto de PCR e elui-se o ADN utilizando 50 uL de dH 2 O. </li><li> Executar PCR 16 reações que utilizam conjuntos de primers para a região (s) de interesse, e resolver os produtos em um gel de agarose a 1% corado com EtBr. </li></ol> 3. supercoiling Ensaio e 2-dimensional Agarose Gel Eletroforese <ol><li> Preparar DNA de tampão de síntese de reparação (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; KCl 70 mM; mM de MgCl 7,4 2; DTT 0,9 mM; EDTA 0,4 mM; ATP 2 mM, 20 ^ M de dNTP, 3,4% de glicerol e 18 albumina de soro ug bovina) . Armazenar a -80 ° C. Thaw no gelo e antes da utilização adicionar fosfato 40 mM e 2,5 g de creatina fosfoquinase. </li><li> Prepare 10x tampão supercoiling [Tris 500 mM (pH 8,0), NaCl 500 mM, MgCl 25 mM 2, EDTA 1 mM], e armazenar a temperatura ambiente. </li><li> Linearizar 300 ng de ADN de plasmídeo super-enrolado pSupFG1 utilizando completamente um ul Vaccinia topoisomerase I (5-15 U / ul) com 1xtampão de super-enrolamento numa reacção de 10 ul. Incubar a mistura a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Descongelar extrato livre de células HeLa 24 no gelo. Para os plasmídeos completamente relaxado, adicionar 25 ul extrato livre de células HeLa e tampão de síntese de reparação do ADN. Misture bem. Adicionar 1 ml adicionais de Vaccinia topoisomerase I à mistura, e incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Terminar as reacções através da adição de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) (1% de concentração final) e proteinase K (0,25 mg / ml de concentração final). Incubar a 65 ° C durante 2 h. </li><li> Transmitir um gel de agarose a 1% com 1x Tris Borato EDTA tampão (TBE). Adicionar ADN corante de carga e carregar as reacções directamente no gel, pelo menos, 4 pistas separadas. Executar o gel durante 8-10 h a 2 V / cm em TBE 1x (dimensão 1) à temperatura ambiente para resolver os topoisomers. NOTA: Prepara-se uma solução de reserva 5x TBE em 1 L de dH2O, adicionando 54 g de base Tris. 27,5 g de ácido bórico e 20 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8,0). </li><li> Prepare 2 L de 1xTBE com 3 ug / ml de cloroquina-fosfato. Embeber o gel em 200 ml desta solução durante 20 min. Cubra a bandeja de gel com papel alumínio. </li><li> Para o gel à electroforese na segunda dimensão, transformar o gel de 90 ° no sentido horário e executá-lo por 4-6 h a 2 V / cm em cloroquina contendo 1 x TBE para resolver os supercoils positivos e negativos. </li><li> Manchar o gel com EtBr por 1 hora em uma cadeira de balanço. Destain o gel com dH 2 O durante 15 min e subsequentemente visualizar a distribuição térmica dos topoisomers usando um gerador de imagens. </li></ol>

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<li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li>
<li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li>
<li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+number+of+2%27-O-%282-aminoethyl%29+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li>
<li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li>
<li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

A formação eficiente de ICLs TFO-dirigida é dependente de dois factores fundamentais: Em primeiro lugar, os componentes do tampão adequado (por exemplo, MgCl 2) e o tempo de incubação do TFO com o seu substrato de ADN alvo (dependente da afinidade de ligação do TFO ao seu alvo duplex, e as concentrações utilizadas); e segundo, a irradiação a dose apropriada de radiação UVA (365 nm) para formar reticulações de psoraleno eficientemente. formação de triplex ideal pode ser conseguido através da utilizaçã...

Triplex-formando oligonucleotídeos (TFO) DNA ligam duplex de uma forma específica de sequência por meio de ligação de Hoogsteen-hidrogênio para formar estruturas 1-5 triple-helicoidais. Tecnologia triplex foi utilizado para interrogar uma variedade de mecanismos biomoleculares, tais como a transcrição, reparação de danos do ADN, e o gene de segmentação (revisto em referências 6-8). TFO têm sido amplamente utilizados para induzir dano local específico em plasmídeos repórter 9,10. O nosso laboratório e outros já anteriormente utilizado um TFO, AG30, presa a uma molécula de psoraleno para induzir reticulações intercadeias de ADN específicas do local (ICLs) no gene supF no plasmídeo pSupFG1 5,10-12. ICLs são altamente citotóxica como estas lesões covalente reticular as duas cadeias de ADN e, se deixada sem conserto, pode bloquear a transcrição de genes e impedem a maquinaria de replicação do DNA 13,14. Devido ao seu potencial citotóxico, agentes indutores de ICL foram usados ​​como drogas quimioterapêuticas no tratamentode câncer e outras doenças 15. No entanto, o processamento e reparação de ICLs nas células humanas não é bem compreendido. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no processamento de ICLs em células humanas pode ajudar a melhorar a eficácia dos regimes quimioterapêuticos baseados em ICL. ICLs-induzidas TFO e seus intermediários reparação têm o potencial de causar distorções estruturais importantes para a hélice do ADN. Tais distorções são alvos prováveis para proteínas de arquitectura, que se ligam ao ADN distorcido com maior afinidade do que a B-forma canónica de ADN duplex 16-20. Aqui, estudou-se a associação de uma proteína de arquitectura altamente abundante, HMGB1 com ICLs em células humanas por meio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaios em plasmídeos de psoraleno-reticulado e identificado um papel para HMGB1 na modulação da topologia do ADN plasmídeo psoraleno-reticulado em humanos Os lisados ​​celulares de cancro. HMGB1 é altamente abundante e ubiquamente expresso não-Hisproteína arquitectónico tom que se liga ao DNA danificado e substratos de DNA, alternativamente, estruturados com maior afinidade do que o DNA-forma canónica B 17-20. HMGB1 está envolvido em vários processos metabólicos de ADN, tais como a transcrição, replicação de ADN, e a reparação do ADN 16,21-23. Demonstrámos previamente que se liga a HMGB1 ICLs TFO-dirigida in vitro com alta afinidade 20. Além disso, demonstrámos que a falta de HMGB1 aumentou o processamento mutagénico de ICLs TFO-HMGB1 dirigidos e identificado como uma reparação de excisão de nucleótidos (ILM) de co-factor de 23,24. Recentemente, verificou-se que está associado com HMGB1 ICLs TFO-dirigidas em células humanas e o seu recrutamento de tais lesões é dependente da proteína NER, XPA 16. Superenrolamento negativo do ADN tem mostrado promover a remoção eficiente das lesões do ADN por NER 25, e verificou-se que a HMGB1 induz superenrolamento negativo preferencialmente em TFO dirigidos Plas-ICL contendomeados substratos (em relação a substratos não danificado, plasmídeos) 16, proporcionando uma melhor compreensão do papel potencial (s) de HMGB1 como um co-factor NER. O processamento de ICLs não é totalmente compreendido, em células humanas; Assim, as técnicas e ensaios desenvolvidos com base em ferramentas moleculares aqui descritos podem levar à identificação de proteínas adicionais envolvidos na reparação de ICL, que por sua vez podem servir como alvos farmacológicos que podem ser exploradas para melhorar a eficácia dos regimes de quimioterapia do cancro. Aqui, uma abordagem eficaz para avaliar a eficiência de formação de TFO-dirigida ICL em DNA de plasmídeo por electroforese em gel desnaturante de agarose foi discutido. Além disso, utilizando os plasmídeos que contêm os ICLs TFO-dirigidas, técnicas para determinar a associação de HMGB1 com os plasmídeos de ICL-danificados num contexto celular utilizando ensaios ChIP modificados foram descritos. Além disso, um método fácil para estudar as modificações introduzidas por Th topológicose HMGB1 proteína de arquitectura, especificamente sobre substratos plasmídeo ICL-danificadas em lisados ​​de células humanas foi determinada realizando ensaios de super-enrolamento através de electroforese em gel de agarose bidimensional. As técnicas descritas podem ser usadas para ajudar a compreender o envolvimento da reparação do ADN e proteínas de arquitectura no tratamento de danos no ADN alvo em plasmídeos em células humanas. Descrevemos protocolos pormenorizados para a formação de ICLs psoraleno específicas do local dirigidas no TFO-DNA do plasmídeo e subsequente ChIP plasmídeo super-enrolamento e ensaios para identificar proteínas que se associam com as lesões, e proteínas que alteram a topologia do ADN, respectivamente. Estes ensaios podem ser modificados para realizar com outros agentes prejudiciais de ADN, TFO, substratos de plasmídeos, e as linhas de células de mamífero de interesse. Na verdade, temos mostrado que há pelo menos um potencial de afinidade única e alta local TFO de ligação dentro de cada gene anotada no genoma humano 26. Comocada vez, para maior clareza, que estas técnicas descritas para a utilização específica de um TFO psoraleno-conjugado (pAG30) num plasmídeo repórter-mutação específica (pSupFG1) em células humanas U2OS que temos utilizado em Mukherjee &amp; Vasquez, 2016 16.

<table><tbody><tr><td>5'HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>Pedido personalizado</td><td>HPLC (ou gel) purificado</td></tr><tr><td>Kit IP de cromatina enzimática simples ChIP</td><td>Cell signaling Inc.</td><td>9003</td><td>O protocolo sugerido pelo fabricante é otimizado para IP de cromatina e não para IP de plasmídeo. Os anticorpos IgG e H3 de controle, bem como as esferas de proteína G e a nuclease microcócica, são fornecidos pelo fabricante.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>HMGB1 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel e kit de limpeza de PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Sal de cloroquina-difosfato</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>Para eletroforese em gel de agarose bidimensional</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção GenePORTER</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada ultravioleta de onda longa Blak-Ray</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>Lâmpada UVA</td></tr><tr><td>Bioprocessador multifuncional EpiSonic 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>Sonicador de banho-maria</td></tr><tr><td>Filtro Mylar</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td>80112939</tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD</td><td>XRS+ sistema</td><td>de imagem de DNA</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Usado para reticulação&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Meios de cultura celular</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Bromocresol verde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>Corante de carregamento de DNA</td></tr><tr><td>Tubos siliconizados</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>Tubo de microfuga de baixa retenção</td></tr><tr><td>Base Tris Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td>Fotômetro</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A Medição de</td><td>dose UVA</td></tr><tr><td><forte>Linhas celulares</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osteossarcoma U2OS humano</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Cultivado de acordo com o fornecedor recomendação do</td></tr><tr><td>Adenocarcinoma cervical humano HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Cultivado de acordo com o fornecedor s recomendação</td></tr><tr><td>Primer direto proximal</td><td>5&prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer reverso proximal</td><td>5&prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer direto distal</td><td>5&prime;-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer reverso distal</td><td>5&prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ferramentas para estudar o papel da hmgb1 protein architectural no processamento de helix distorcendo, dna site-specific intercadeias crosslinks

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

caixa de grupo de alta mobilidade 1 (HMGB1) a proteína é uma proteína não-histona arquitectónico que está envolvido na regulação de muitas funções importantes no genoma, tais como transcrição, replicação de ADN, e a reparação do ADN. HMGB1 se liga ao DNA estruturalmente distorcida com maior afinidade do que a B-ADN canónica. Por exemplo, descobrimos que HMGB1 se liga ao DNA intercadeias ligações cruzadas (CIET), que covalentemente ligam as duas cadeias do DNA, causar distorção da hélice e, se deixada sem conserto pode causar morte celular. Devido ao seu potencial citotóxico, vários agentes indutores de ICL são actualmente utilizados como agentes quimioterapêuticos em clínica. Enquanto os agentes ICL-formando mostrar preferências por certas sequências de bases (por exemplo, 5&#39;-TA-3 &#39;é o local de reticulação preferido para psoraleno), que em grande parte induz danos no ADN de uma forma indiscriminada. No entanto, por acoplamento covalente do agente de indução de ICL a um oligonucleótido de formação de triplex (TFO), que se liga a DNA de uma sequência-específicaforma, o dano ao DNA alvo pode ser alcançado. Aqui, nós utilizamos um TFO covalentemente conjugado no &quot;fim a um 4&#39;-hidroximetil-4,5 &#39;a 5 (HMT) psoraleno, 8-trimetilpsoraleno para gerar um ICL específica do local num plasmídeo repórter-mutação a ser usado como uma ferramenta para estudar a modificação de arquitectura, processamento, e reparação das lesões do ADN complexas por HMGB1 em células humanas. Descrevemos técnicas experimentais para preparar ICLs TFO dirigidos em plasmídeos repórter, e para interrogar a associação de HMGB1 com os ICLs TFO dirigidos em um contexto celular usando ensaios cromatina imunoprecipitação. Além disso, descreve-se ensaios de super-enrolamento de ADN para avaliar a alteração de arquitectura específica do ADN danificado por medição da quantidade de voltas superhelical introduzidas no plasmídeo psoraleno-reticulada por HMGB1. Estas técnicas podem ser usadas para estudar os papéis de outras proteínas envolvidas no processamento e reparação de ICLs TFO-dirigida ou outro dano do DNA alvo em qualquer linha celular de interesse.

Formação do ICL TFO-dirigida é crítico para os ensaios de plasmídeo baseado, que são utilizados para interrogar as funções das proteínas de arquitectura do processamento de ICL, em células humanas. Electroforese em gel desnaturante de agarose é uma maneira fácil para determinar a eficiência da formação de ICL TFO-dirigida. Os plasmídeos que albergam ICLs TFO dirigidos migram com uma mobilidade mais lenta através da matriz de gel de agarose (Figura 1A, pista 3) quando com...

O dano direcionado ao DNA pode ser alcançado amarrando um agente prejudicial ao DNA a um oligonucleotídeo formador de triplex (TFO). O uso de TFOs modificados, a associação de proteínas específicas de danos ao DNA e a modificação da topologia do DNA podem ser estudadas em células humanas pela utilização de ensaios de imunoprecipitação de cromatina modificada e ensaios de superenrolamento de DNA aqui descritos.

Ferramentas para estudar o papel da HMGB1 Protein Architectural no processamento de Helix distorcendo, DNA Site-specific intercadeias Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

O objetivo geral dos experimentos modificados de imunoprecipitação de cromatina e superenrolamento de DNA é estudar a associação e as modificações topológicas subsequentes induzidas por proteínas arquiteturais em danos específicos ao DNA provocados por agentes quimioterápicos ou carcinogênicos em células humanas. Esta metodologia permitirá abordar questões fundamentais sobre dano e reparo do DNA, o que deve facilitar a descoberta de novos alvos farmacológicos para o tratamento do câncer. Nossa tecnologia nos permite direcionar danos específicos ao DNA e facilita a avaliação de processos críticos de reparo do DNA relevantes para o câncer humano.Para começar, 24 horas antes da transfeção, plaque 400.000 células de mamífero por placa de 60 milímetros em DMEM suplementado com 10% de FBS sem antibióticos. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. Em um tubo cônico de 14 mililitros, combine 30 microlitros do agente transfectante em temperatura ambiente com 500 microlitros do meio de crescimento 1X aquecido a 37 graus Celsius.Em um segundo tubo, combine dois microgramas de plasmídeos contendo ICL direcionados por TFO em 500 microlitros de meio de crescimento 1X. Incube os tubos à temperatura ambiente por 10 minutos. Combine a mistura um com a mistura dois e pipete para cima e para baixo para misturar completamente.Em seguida, incubar a solução à temperatura ambiente por 25 a 30 minutos. Depois, usar PBS morno para lavar as células duas vezes. Então, adicionar a mistura de transfeção gota a gota, distribuindo a solução uniformemente por toda a placa de células.Adicione um mililitro de meio de crescimento à placa e complete o volume final para dois mililitros. Misture bem e coloque as placas de cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quatro horas depois, substitua o meio por três mililitros de meio de crescimento com 10% de soro bovino fetal, e incube por mais 16 horas.Após a incubação, adicione 80 microlitros de formaldeído fresco a 37% por placa às células e incube em temperatura ambiente no escuro por 10 minutos. Interrompa a reticulação com formaldeído adicionando 300 microlitros de glicina gelada por placa e incube por cinco minutos. Em seguida, remova o meio e use PBS gelado para lavar as placas duas vezes.Em seguida, após adicionar um milímetro de PBS gelado, colete as células raspando-as para um tubo de microcentrífuga sobre gelo, mantendo as amostras sempre no gelo. Prepare os pellets celulares centrifugando a 13.400 × g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e coloque os pellets sobre gelo.Utilize um mililitro do Tampão A gelado para ressuspender homogeneamente os pellets e incubar no gelo por 10 minutos. Em seguida, pelotize as células como anteriormente. Agora, com um mililitro do Tampão B gelado, ressuspender homogeneamente os pellets e incubar no gelo por 10 minutos com mistura ocasional por inversão.Em seguida, pelote as células como antes. Após ressuspender as células novamente em 200 microlitros do tampão B gelado, adicione dois microlitros de nucleases microcócica, ou MNase, e incube a reação à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, interrompa a reação da MNase colocando os tubos no gelo e adicionando 40 milimolar de EDTA.O nível de digestão pela nucleases micrococcais é muito crítico, pois uma superdigestão pode causar perda de sinal, enquanto uma subdigestão pode gerar muito fundo inespecífico. Após a centrifugação das células, re-suspenda os pellets em 100 microlitros de tampão de imunoprecipitação de cromatina, ou ChIP, suplementado com coquetel de inibidores de protease. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de parede fina.Sonicar as amostras flutuando-as em um banho ultrassônico por 20 segundos, seguido por 20 segundos em gelo. Repetir os passos de sonicação nove vezes para gerar fragmentos de aproximadamente 800 a 1.200 pares de bases. A 20 microlitros das amostras sonicadas, adicionar três microlitros de cloreto de sódio cinco molar e um microlitro de RNase A. Vortexiar os tubos e incubá-los a 37 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, adicione dois microlitros de proteinase K e incube a 65 graus Celsius por duas horas. Após purificar as amostras, de acordo com o protocolo descrito, eletroforese em gel de agarose 1% e visualize com brometo de etídio. Em três tubos separados, pré-resfriados e silanizados, adicione 30 microlitros de lisado e 70 microlitros de tampão ChIP 1X resfriado com inibidores de protease adicionados.Adicione um micrograma dos anticorpos anti-IgG, anti-histona H3 ou anti-HMGB1 aos tubos respectivos. Incube durante a noite em câmara fria com rotação contínua. Na câmara fria, após a re-suspensão das microesferas de Proteína G, adicione quatro microlitros das microesferas a cada tubo de reação e incube em câmara fria com rotação por mais duas a quatro horas.Coloque os tubos em um suporte magnético para sedimentar as microesferas e remova o sobrenatante. Adicione 200 microlitros de tampão ChIP 1X com coquetel de inibidores de protease aos pellets e lave sob rotação em frio por cinco minutos. Em seguida, realize uma lavagem adicional com o tampão ChIP 1X de alto sal.Em seguida, utilize 160 microlitros de tampão de eluição para ressuspender os pellets e incubar a 37 graus Celsius com rotação durante 30 minutos. Centrifugue para obter o pellet das esferas e colete o sobrenadante em um tubo novo. Adicione seis microlitros de cloreto de sódio cinco molar e dois microlitros de proteinase K, e incube durante a noite a 65 graus Celsius.Após purificar o DNA, de acordo com o protocolo descrito no texto, realize reações de PCR usando conjuntos de iniciadores para a região ou regiões de interesse e separe os produtos em um gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio. Antes do uso, descongele em gelo o tampão de síntese de reparo do DNA previamente preparado e adicione fosfocreatina a 40 milimolar e 2,5 microgramas de creatina fosfoquinase. Após preparar o tampão 10X de superenrolamento, de acordo com o protocolo descrito no texto, use um microlitro de topoisomerase 1 de vaccínia com tampão de superenrolamento 1X em uma reação de 10 microlitros para linearizar 300 nanogramas do plasmídeo superenrolado PCA FG1.Às plasmídios relaxados, adicione 25 microlitros de extrato de células HeLa recentemente descongelado e tampão de síntese de DNA. Misture bem, então adicione um microlitro de topoisomerase 1 de vaccínia à reação e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Interrompa as reações adicionando 1% de SDS e 0,25 miligramas por mililitro de proteinase K, e incube a 65 graus Celsius por duas horas.Após confeccionar um gel de agarose a 1% com tampão TPE 1X, adicione corante de carga de DNA às reações e carregue as amostras diretamente no gel, mantendo pelo menos quatro poços de distância entre elas. Execute o gel por oito a dez horas a dois volts por centímetro em TBE 1X, na primeira dimensão, à temperatura ambiente, para separar os topoisômeros. Prepare dois litros de TBE 1X com três microgramas por mililitro de fosfato de cloroquina.Deixe o gel mergulhado em 200 mililitros da solução, coberto com papel alumínio, durante 20 minutos. Para realizar a eletroforese do gel na segunda dimensão, gire o gel 90 graus no sentido horário e execute-o por quatro a seis horas a dois volts por centímetro em cloroquina contendo TBE 1X para separar as superenrolamentos positivos e negativos. A quantidade de cloroquina no tampão de eletroforese e no gel é muito crítica, assim como executar o gel em uma voltagem muito baixa na segunda dimensão é essencial para separar os superenrolamentos positivos e negativos.Após a coloração e descoloração do gel, de acordo com o protocolo descrito, utilize um sistema de imagem para visualizar a termodistribuição dos topoisômeros. Como observado neste gel, aproximadamente 79% dos plasmídeos que contêm ICLs direcionados por TFO migram com mobilidade mais lenta através da matriz de agarose quando comparados aos plasmídeos controle sem entrecruzamento. Ensaios de ChIP realizados em lisados de células humanas U2OS transfetadas com plasmídeo controle ou plasmídeos contendo ICLs direcionados por TFO mostram enriquecimento de HMGB1 na região P-ICL em comparação com a região controle quando imunoprecipitados com anticorpo anti-HMGB1.Quando a HMGB1 foi esgotada nas células por meio do tratamento com siRNA, o enriquecimento específico para ICL-P foi reduzido. Quando as mesmas amostras foram imunoprecipitadas utilizando um anticorpo anti-IgG, foi detectada amplificação mínima por PCR. Por fim, nesta figura, a eletroforese em gel de agarose bidimensional demonstra a modificação arquitetônica dos plasmídeos contendo ICL direcionado por TFO mediante superenrolamento negativo pela HMGB1 em extratos de células HeLa.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente cinco dias, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar que todas as lavagens devem ser feitas na câmara fria, pois lavagens à temperatura ambiente podem aumentar o sinal de fundo. Após este procedimento, outros métodos, como o esgotamento mediado por siRNA de proteínas, seguido por ensaios de triagem de mutações, podem ser realizados para responder perguntas como: a proteína de interesse está envolvida na reparação do DNA?Ou será que altera significativamente os espectros de mutação durante o processo? Esta técnica abriu caminho para o estudo da associação entre proteínas e danos no DNA em locais específicos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a associação de proteínas estruturais com alvos de ligações cruzadas no DNA e, posteriormente, determinar o efeito dessa associação sobre a topologia do DNA.Não se esqueça de que trabalhar com brometo de etídio pode ser extremamente perigoso, e, portanto, equipamentos de proteção adequados devem sempre ser usados durante a realização deste experimento.

tools-to-study-role-architectural-protein-hmgb1-processing-helix

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.

Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

Microirradiation do laser é uma ferramenta útil para estudos de reparo de ADN em células vivas. Uma abordagem metodológica para o uso de lasers UVA para induzir várias lesões do ADN é mostrada. Otimizamos a um método para microirradiation local que mantém o ciclo celular normal; assim, as células irradiadas prosseguir através de mitose.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

O presente protocolo destaca um método modificado para detectar e quantificar ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) e suas modificações pós-traducionais (MPTs), incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação induzida por inibidores de topoisomerase e por formaldeído, permitindo assim o estudo da formação e reparo de DPCs e suas MPTs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápido para a detecção de interação proteica em locais de dano ao DNA.

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

Este protocolo demonstra a realização de um ensaio de molécula única para visualização ao vivo do desenrolamento do DNA por CMG helicase. Ele descreve (1) a preparação de um substrato de DNA, (2) a purificação de Drosophila melanogaster CMG helicase marcada com fluorescência, (3) a preparação de uma célula de fluxo microfluídico para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) e (4) o ensaio de desenrolamento de DNA de molécula única.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Apresentamos um método rápido e eficiente para detectar quebras comuns de locais frágeis por meio da imunoprecipitação nativa da cromatina γH2A.X (ChIP). Essa abordagem reduz significativamente o tempo e a mão de obra associados aos ensaios tradicionais de γH2A.X ChIP, mantendo alta reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados.

Capturando quebras de local frágeis comuns por γH2A nativo. X ChIP

Aprenda a estudar a associação de proteínas arquiteturais ao dano específico de DNA usando ensaios de imunoprecipitação de cromatina modificados e ensaios de superenrolamento de DNA em células humanas. Este método auxilia na descoberta de novos alvos farmacológicos para terapia do câncer.

Ferramentas para estudar o papel da HMGB1 Protein Architectural no processamento de Helix distorcendo, DNA Site-specific intercadeias Crosslinks (Vídeo) | JoVE Journal

Ferramentas para estudar o papel da HMGB1 Protein Architectural no processamento de Helix distorcendo, DNA Site-specific intercadeias Crosslinks

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