Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

O objetivo geral do CARA é fornecer uma avaliação semiquantitativa de médio rendimento da atividade dos compostos contra micobactérias replicantes e não replicantes. A principal vantagem dessa técnica é que, como substituto da UFC, o CARA permite testar rapidamente a dependência de dose e tempo de um composto. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da descoberta de medicamentos para tuberculose, como determinar se um composto é bacteriostático ou bactericida contra bactérias replicantes e se é bactericida contra bactérias não replicantes.

Demonstrando o método estará Julia Roberts, associada em nosso laboratório. Adicione 450 mililitros de água a um copo de vidro de um litro ou 900 mililitros de água a um frasco Erlenmeyer de dois litros. Inclua uma barra de agitação autoclavável no copo ou balão.

Em seguida, adicione um pó Middlebrook 7H11, carvão ativado a uma concentração final de 0,4% e uma solução de glicerol a 50% para obter uma concentração final de 0,2%. Cubra a abertura do frasco ou béquer com papel alumínio e prenda ao vidro com fita adesiva de autoclave. Depois de autoclavar o meio, resfrie-o a aproximadamente 55 a 65 graus Celsius em uma placa de agitação magnética ajustada para velocidade baixa para manter o carvão em suspensão.

Enquanto trabalha assepticamente em uma coifa de biossegurança com placa de agitação magnética, remova a folha do meio e adicione 100 ou 50 mililitros de suplemento OADC ao frasco de dois litros ou copo de um litro, respectivamente, e continue a misturar. Usando uma pipeta multicanal com oito ou 12 pontas de filtro, encha uma microplaca de 96 poços com 200 microlitros de carvão vegetal 7H11-OADC do reservatório ou béquer do reagente, trabalhando rapidamente para evitar a solidificação do ágar e a formação de bolhas. Coloque pilhas de microplacas CARA em sacos plásticos que possam ser fechados novamente para evitar que sequem e armazene-as a quatro graus Celsius.

Inocular tubos de centrífuga de fundo redondo ou cônicos de polipropileno contendo quatro ou 20 mililitros, respectivamente, de Middlebrook 7H9-ADN ou 7H9-OADC com M. smegmatis a um OD580 de 0,01 a 0,1. Incubar as culturas de M. smegmatis a 37 graus Celsius e 20%O2 com agitação, expandindo as culturas para a fase mid-log ou um OD580 aproximado de 0,5. Para configurar um experimento de concentração inibitória mínima sob condições replicantes e não replicantes, distribua 200 microlitros de células em 7H9-ADN a um OD580 de 0,01 em todos os poços de uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo transparente.

Para o ensaio não replicante, use PBS contendo 0,02% de tiloxapol para lavar as células duas vezes. E use meio não replicante para ressuspender as células. Use meio não replicante para diluir as células até um OD580 de 0,1 e adicione nitrato de sódio a uma concentração final de 0,5 a 5 milimolares de um estoque molar recém-preparado.

Distribua 200 microlitros de células a um OD580 de 0,1 em todos os poços de uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo transparente. Depois de preparar os agentes de teste de acordo com o protocolo de texto, adicione dois microlitros do agente de teste um nas linhas A a E e dois microlitros do agente de teste dois nas linhas E a H e misture bem. Para ensaios de replicação, incubar microplacas de M. smegmatis a 37 graus Celsius, 20%O2 e 5%CO2 por uma a 48 horas.

Nos momentos em que o CARA será usado como leitura, use uma pipeta multicanal p200 ajustada para 50 a 75 microlitros para ressuspender cuidadosamente o conteúdo do poço da placa de ensaio estilo MIC90 pipetando para cima e para baixo cinco a 10 vezes. Em seguida, use as pontas da pipeta para girar suavemente o conteúdo dos poços em movimentos circulares. Transfira 10 microlitros do conteúdo do poço de ensaio não diluído para os poços correspondentes da microplaca CARA, evitando respingos durante as transferências, garantindo que a alíquota de 10 microlitros seja localizada no meio dos poços da microplaca CARA.

Com fita adesiva, amarre pilhas de microplacas CARA e coloque-as em um saco plástico que possa ser fechado novamente. Incubar as microplacas de M.smegmatis CARA a 37 graus Celsius com 20%O2 por um a dois dias para placas replicantes e por dois a três dias para placas não replicantes. Quando um filme de crescimento bacteriano ou colônias macroscópicas maiores forem visíveis nos poços de controle negativo, use um único conjunto de 12 ponteiras p200 com uma pipeta multicanal para dispensar 40 microlitros de PBS estéril ao longo da lateral dos poços e permitir que o PBS se distribua pelo topo das microcolônias de ágar/bactérias.

Prepare o reagente de revelação CARA misturando cinco miligramas de resazurina e 50 mililitros de 5%Tween80 em PBS. Adicione 50 microlitros de reagente revelador CARA recém-preparado a cada poço da microplaca CARA. Em seguida, balance as placas para frente e para trás algumas vezes para ajudar a distribuir o reagente pelo ágar e pelo tapete bacteriano em cada poço.

Coloque as placas em um saco plástico que possa ser fechado novamente e incube a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos para M. smegmatis. Antes de ler a fluorescência, coloque as microplacas CARA em uma capa de biossegurança por 15 minutos em temperatura ambiente com as tampas removidas. Ao usar espectrofotômetros BSL3 fora de um gabinete de biossegurança, cole um adesivo de PCR de qualidade óptica sobre a placa e use uma toalha de papel macia para selar firmemente pressionando suavemente a superfície do adesivo.

Determine a fluorescência por leitura superior com excitação a 530 nanômetros e emissão a 590 nanômetros. Não é necessário deixar a placa em branco. Para analisar os dados, plote a concentração do inibidor no eixo X como uma escala log10 e a fluorescência no eixo Y em uma escala linear.

Consulte o protocolo de texto para obter detalhes adicionais. A concentração do agente de teste que resulta na falha da fluorescência CARA em subir acima dos níveis de fundo é o CARA-MBC maior que igual a 99, que é mostrado aqui. O subscrito maior que igual a 99 indica que o CARA-MBC fornece uma concentração estimada do agente de teste, que dá origem a uma morte bacteriana maior que igual a dois log10.

Suspeita-se que os compostos exerçam um efeito pós-antibiótico se exibirem uma janela estática, definida como um deslocamento maior que quatro vezes para a direita entre as curvas MIC e CARA. A janela estática indica que uma molécula ativa contra a replicação de M. tuberculosis pode ser bacteriostática em vez de bactericida. Para moléculas com um potente efeito pós-antibiótico, as janelas estáticas podem ser difíceis de observar e são aparentes apenas após a inspeção de um eixo Y expandido para fluorescência CARA, como visto aqui.

Moléculas ativas replicantes e não replicantes testadas por MIC90 e CARA são mostradas aqui. Enquanto a isoniazida e a linezolida parecem ter atividade contra bactérias não replicantes pelo ensaio MIC90, o CARA sugere que elas são inativas nas condições não replicantes testadas. Neste experimento CARA, a exposição de M. smegmatis a concentrações crescentes de rifampicina revelou um impacto em menos de uma hora e exibiu atividade bactericida crescente entre três e 24 horas, matando mais de dois a três log10 em aproximadamente 10 microgramas por mililitro em 24 horas.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente duas horas para preparar placas, menos de uma hora para transferir células para placas CARA e aproximadamente uma a duas horas para desenvolver e medir a fluorescência de placas CARA, se for feito corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar o CARA como um ensaio preditivo para determinar se um composto tem atividade bactericida ou bacteriostática contra micobactérias que estão se replicando ou não se replicando. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como configurar um CARA e analisar dados de uma maneira que ajude a prever o tipo de atividade de um composto.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.