Name: Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a realizar o ensaio CARA para avaliar a atividade de compostos contra micobactérias replicantes e não replicantes. Este método semi-quantitativo de médio rendimento acelera a descoberta de fármacos contra tuberculose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Somos gratos a Kristin Burns-Huang para análise de peritos do manuscrito e J. David Warren (Weill Cornell Medical College) para obter ajuda química durante o desenvolvimento da CARA. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Accelerator TB Drogas da Fundação Bill e Melinda, a Abby e Howard Programa P. Milstein em Translational Medicine, e um TB Unidade de Investigação NIH (U19 AI111143). O Departamento de Microbiologia e Imunologia é suportado pelo Randolph Hearst Fundação William. SSK foi apoiada por K08AI108799 concessão NIH.

1. Preparação de microplacas CARA <ol><li> Autoclave a 900 ml de agar Middlebrook 7H11 contendo 0,2% de glicerol e 0,4% de carvão activado em um balão de 2 L de Erlenmeyer, ou, alternativamente, em 450 ml de 1 L proveta de vidro. Incluem uma grande barra de agitação autoclavable no frasco ou copo. Cobrir a abertura do frasco ou copo com folha de alumínio e anexar ao vidro com fita autoclave. </li><li> Arrefece-se até tocar (aproximadamente 55-65 ° C) numa placa de agitação magnética regulada para uma velocidade baixa para manter o carvão vegetal em suspensão. </li><li> Execute todas as etapas subsequentes de forma asséptica em uma capa de biossegurança que tem uma placa de agitação magnética. </li><li> Retire o papel alumínio. Adicionam-se 100 ml OADC suplemento (suplemento OADC, quando utilizado a 10%, produz concentrações médias finais de 0,2% de dextrose, 0,5% de albumina, 0,085% de NaCl, 0,0005% de ácido oleico, e 0,4 mg / ml de catalase) ao balão de 2 L de Erlenmeyer , ou 50 ml OADC a uma proveta de L, e continuar a misturar. </li><li> Se estiver usando uma garrafa de Erlenmeyer, despeje cerca de 25-40 ml de 7H11-OADC carvão em um reservatório de reagente estéril. Se usando o copo, o que não é necessária a utilização de um reservatório de reagente. </li><li> Encha uma microplaca de 96 poços com 200 ul / poço de 7H11-OADC-carvão a partir do recipiente de reagente ou copo. Trabalhar rapidamente para evitar a solidificação ágar e introdução de bolhas. Evitar salpicos fora meio sólido dos poços, como que podem ser uma fonte de contaminação por fungos. Usando uma pipeta de canais múltiplos, utilizar um conjunto de 12 pontas de filtro para a transferência de 7H11-OADC-carvão para as 8 linhas (AH) da placa de 96 poços. NOTA: O meio solidifica rapidamente. Para evitar o entupimento pontas de pipeta, alterá-los com freqüência. </li><li> Alternativamente, despeje CARA microplacas utilizando uma pipeta multicanal electrónica P1000 com pontas com filtro para ajudar na preparação de vários pratos. NOTA: Devido ao baixo volume de poços, o agar em CARA microplacas solidifica a poucos minutos do vazamento. </li><li> pilhas local de CARA microplacas em ba plástico hermeticamente fechadogs para evitar que sequem. </li><li> Loja CARA microplacas a 4 ° C. </li></ol> 2. Configurar Replicar e Não-replicante MIC 90 Assays <ol><li> Inocular M. tuberculosis, M. bovis BCG ou M. smegmatis a uma DO 580 de 0,01-0,1 e expandir até à fase mid-log (OD 580 ~ 0,5) em meio Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol, 0,2% de dextrose , 0,5% de albumina, e 0,085% de NaCl) ou 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol e 10% de suplemento OADC). </li><li> Crescer M. tuberculosis e M. bovis BCG como ~ 20 ml de pé culturas em frascos de cultura celular e M. smegmatis com agitação em polipropileno de fundo redondo (4 ml de cultura) ou 50 ml tubos de centrífuga cónico (10-20 ml de cultura). Incubar micobactérias patogénicas, a 37 ° C com 20% de O 2 e CO 2 a 5%, e M. smegmatis, a 37 ° C com 20% de O 2. </li><li> Configurar uma mínima inibitóriaconcentração (MIC 90) experimento de estilo sob replicante e não replicar condições (Figura 2). Nota: Os agentes de teste são geralmente ensaiados em duplicado ou quadruplicado para permitir o teste 4, 2 ou compostos, respectivamente, por 96 poços de microplacas. Por exemplo, em uma placa de 96 poços, um agente de teste pode ser ensaiado nas linhas AD e outras em fiadas EH. O DMSO (veículo) é nas colunas 1, 2 e 12, e a série de diluição do agente de teste é executado a partir da coluna 3 (concentração mais baixa) a coluna 11 (concentração máxima). MIC 90 ensaios -estilo tipicamente empregam uma série de diluição de 2 vezes. Existem inúmeros modelos não-replicante disponíveis para micobactérias 14-16,18,24,25 e para fins ilustrativos, estamos usando um modelo multi-stress de não-replicação 6,8,9. <ol><li> Para o ensaio de replicação, distribuir 200 ul em células 7H9-ADN a uma DO 580 de 0,01 em todos os poços de uma placa de 96 poços clara de fundo, de cultura de tecidos tratados. </li> &lt;li&gt; Para o ensaio não replicante, lavar as células duas vezes em fosfato tamponado salino (PBS) contendo 0,02% de tiloxapol, e Ressuspender as células em meio não-replicantes (0,05% KH 2 PO 4, 0,05% de MgSO4, 0,005% de citrato de amónio férrico , 0,0001% de ZnCl2, 0,1% de NH 4 Cl, 0,5% de BSA, NaCl a 0,085%, 0,02% tiloxapol, 0,05% de butirato; pH ajustado para 5,0 com NaOH a 2 N). <ol><li> Dilui-se as células até uma OD 580 de 0,1 em meio não-replicantes e adicionar NaNO2 a partir de um estoque 1 M preparada de fresco para uma concentração final de 0,5 mM. </li><li> Distribuir 200 ul de células a uma DO 580 de 0,1 em todos os poços de uma placa de 96 poços clara de fundo, de cultura de tecidos tratados. NOTA: Preparar diluições dos compostos como soluções de reserva de 100 vezes em DMSO. Assim, uma placa de MIC típico testar o impacto de uma molécula numa concentração final 0,4-100 ug / ml exigiria soluções de reserva de 0,04-10 mg / mL em DMSO. </li></ol></li><li> Adicionar 2 mL de diluções de agente de teste 1 em linhas AE e 2 ul de diluições do agente de teste 2 em linhas EH. Homogeneizar. </li><li> Adicionar 2 controle do veículo ul (normalmente DMSO) em poços de controlo, colunas 1, 2, 12 (linhas AH). Homogeneizar. </li><li> Para cada experiência, incluem, pelo menos, um controlo positivo, tal como a rifampicina de 0,004 a 1 ug / mL (ensaio de replicação) e / ou 0,08 a 20 ug / mL (ensaio de não reprodução). NOTA: A utilização de 6-bromo-1H-indazol-3-amina 9 a 0,1 a 25 ug / ml é recomendado como um composto de controlo que tem selectiva, a actividade dependente de NaNO2 no modelo multi-stress de não-replicação. </li><li> Para replicar ensaios, incubar microplacas a 37 ° C em 20% de O2 e 5% de CO 2 durante 7 dias (M. tuberculosis e M. bovis BCG) ou (1-48 hr M. smegmatis). Para o modelo de multi-stress de não replicação, incubar microplacas durante 7 dias a 37 ° C em 1% de O2 e 5% de CO 2 (&lt;em&gt; M. tuberculosis e M. bovis BCG). </li></ol></li></ol> 3. A inoculação de CARA Microplates <ol><li> Em pontos de tempo em que o CARA serão utilizados como um-para ler, cuidadosamente ressuspender bem o conteúdo da placa de ensaio de estilo MIC 90 utilizando uma pipeta multicanal P200 fixada em 50-75 ul. Pipeta cima e para baixo pelo menos 5-10 vezes e rode suavemente o conteúdo do poço em um movimento circular usando as pontas de pipeta. </li><li> Transferência de 10 ml de conteúdos ensaio bem para a microplaca CARA. Assegure-se que a ordem dos conteúdos dos poços na placa de ensaio corresponde à ordem dos conteúdos dos poços da microplaca Cara. Evitar respingos durante as transferências e certifique-se os 10 ml são vistos no meio dos poços CARA microplacas. Confirme as 10 jul absorve na microplaca CARA. NOTA: Não há diluições necessárias antes de células na CARA microplacas manchas. </li><li> pilhas de vinculação de CARA microplacas com fita placa eem seguida, coloque em um saco de plástico hermeticamente fechado. Incubar CARA microplacas a 37 ° C com 20% de O2 (M. smegmatis) ou 1% de O2 e 5% de CO 2 (M. tuberculosis e M. bovis BCG). </li><li> Para o M. tuberculosis e M. bovis BCG, replicando ensaios: incubar durante 7 dias; para o M. tuberculosis e M. bovis BCG não replicante ensaios, incubar durante 10 dias; M. smegmatis, replicando ensaios, incubar durante 1-2 dias; M. smegmatis, ensaios não-replicantes, incubar 2-3 dias. NOTA: Os tempos são estimativas e podem ser alteradas em conformidade para replicar diferente, não replicantes, e condições de estresse. </li></ol> 4. Desenvolver CARA Microplates <ol><li> Desenvolver o CARA microplacas quando um filme de crescimento bacteriano, ou maior, de colónias macroscópicas, são visíveis nos poços (veículo) de controlo negativo. NOTA: Após a incubação prolongada, cara poços, muitas vezesparecer seca e nós recomendamos a pré umectantes poços conteúdos com PBS estéril. Isto serve para impedir que o carvão de absorver resazurina, o que pode levar a baixa fluorescência ou variação poço-a-poço. </li><li> Usando um conjunto único de 12 P200 dicas com uma pipeta de canais múltiplos, dispensar 40 ul de PBS estéril ao longo do lado dos poços e deixar o PBS para distribuir através da parte superior das microcolônias agar / bacterianos. </li><li> Prepare CARA desenvolvimento de reagente através da mistura de 5 mg de resazurina (0,01% final) e 50 ml de 5% Tween 80 em PBS. Vortex e o filtro esterilizado. NOTA: Uma alternativa CARA reagente revelador pode ser preparado por mistura de preparados comercialmente resazurina solução líquida a 1: 1 (vol / vol) com 10% de Tween 80 em PBS. </li><li> Adicionar 50 ul de reagente recentemente preparado desenvolvimento CARA a cada poço da microplaca CARA utilizando uma pipeta de 12 canais. placas de rock e para trás algumas vezes para ajudar a distribuir o reagente em todo o tapete de agar e bacteriana em cada poço. </li><li> Coloque as placas ind saco selado plástico e incuba-se a 37 ° C durante pelo menos 30 min para M. smegmatis e de 45-60 min para o M. tuberculosis ou M. bovis BCG. NOTA: Se os poços de controlo de veículo deixar de ficar rosa dentro da primeira hora, as placas podem ser re-ensacado e incubou-se durante longos períodos de tempo. </li><li> Antes da leitura da fluorescência, colocar CARA microplacas em uma capa biosegurança durante 15 min à temperatura ambiente com as tampas removidas. Ao usar espectrofotômetros BSL3 fora de uma cabine de segurança biológica, aderir um adesivo PCR qualidade óptica através da placa e lacre firmemente pressionando suavemente na superfície da etiqueta com uma toalha de papel macio. </li><li> Determinar a fluorescência através de topo ler com excitação a 530 nm e emissão a 590 nm. Não é necessário para inibir a placa. </li></ol> Análise 5. Os dados <ol><li> Lote concentração de inibidor no eixo-X numa escala de log de fluorescência 10 e no eixo dos Y em uma escala linear. Use uma dispersãotrama empregando um ajuste de curva, como &quot;log de inibidor versus inclinação variável-resposta (4 parâmetros)&quot;. pontos de dados trama como meio ± erro padrão. </li></ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+approaches+to+anti-infective+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fresh approaches to anti-infective therapies.</a> Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).</li>
<li>Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tuberculosis+persistence%2C+latency%2C+and+drug+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance.</a> Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> Lancet. , 497-500 (1944).</li>
<li>Bryk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+nonreplicating+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Selective killing of nonreplicating mycobacteria.</a> Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).</li>
<li>Gold, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+drug+sensitizes+Mycobacterium+tuberculosis+to+endogenous+and+exogenous+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).</li>
<li>Gold, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+semi-quantitative+assay+to+discriminate+among+compounds+with+activity+against+replicating+or+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).</li>
<li>Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGold%2C+B+%22Mycobacteria+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).</li>
<li>Warrier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Novel+Anti-mycobacterial+Compounds+by+Screening+a+Pharmaceutical+Small-Molecule+Library+against+Nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).</li>
<li>Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZheng%2C+P+%22J.+Med.+Chem%22">J. Med. Chem</a>. Chem, J. .M. ed. , (2014).</li>
<li>Darby, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+screen+for+inhibitors+of+pH+homeostasis+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 8, e68942(2013).</li>
<li>Darby, C. M., Nathan, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis+by+8-hydroxyquinoline%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ade+Carvalho%2C+LP+%22ACS+Med.+Chem.+Lett%22">ACS Med. Chem. Lett</a>. 2, 849-854 (2011).</li>
<li>Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antibiotic+susceptibilities+of+starved+Mycobacterium+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).</li>
<li>Grant, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis+using+a+carbon+starvation+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model.</a> ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptomycin-starved+Mycobacterium+tuberculosis+18b%2C+a+drug+discovery+tool+for+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).</li>
<li>Mak, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+to+identify+inhibitors+of+ATP+homeostasis+in+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Cho, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-oxygen-recovery+assay+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).</li>
<li>Franzblau, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).</li>
<li>Rebollo-Lopez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+50+new%2C+drug-like+compounds+and+their+computational+target+predictions+for+open+source+anti-tubercular+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery.</a> PLoS One. 10, e0142293(2015).</li>
<li>Tasneen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+nitroimidazoles+PA-824+and+TBA-354+to+the+activity+of+novel+regimens+in+murine+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).</li>
<li>Grosset, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+clofazimine+activity+in+a+second-line+regimen+for+tuberculosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).</li>
<li>Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+bacterial+survival+and+phagocyte+function+with+a+fluorescence-based+microplate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay.</a> Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+small+molecule+with+activity+against+drug-resistant+and+persistent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).</li>
<li>Wayne, L. G., Hayes, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+sequential+study+of+shiftdown+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+two+stages+of+nonreplicating+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence.</a> Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).</li>
<li>Barry, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarry%2C+AL+%22Methods+for+determining+bactericidal+activity+of+antimicrobial+agents%3A+approved+guideline%22">Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline</a>. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse para divulgar.

O CARA foi originalmente desenvolvido para aliviar um gargalo no progredindo não replicantes ou moléculas dual-ativo 7. A CARA serve como um passo intermédio entre a confirmação de concentração-resposta de visitas de rastreio primário e ensaios de CFU (Figura 1). Uma vez que uma única placa CARA pode substituir inúmeras placas de microtitulação necessárias para preparar diluições em série e placas de Petri contendo ágar utilizado para enumerar bactérias sobreviventes, o CARA fornece um meio simples de avaliar rapidamente a atividade de um molécula e testar múltiplas variáveis ​​de uma só vez, incluindo concentração de composto e tempo de exposição ao composto. Num ensaio de CFU, além de diluições em série, que muitas vezes variam até 10 vezes de 6, a placa de agar tipicamente dilui moléculas por um ~ 800 vezes adicional (10 ul Onto 8 ml numa placa de Petri de estilo de tri). Nosso em duas fases, ensaio de triagem multi-stress para compostos ativos na não-replicante M. tuberculosis tem um factor de transição de 5 vezes, isto é, um composto presente no estágio de não reprodução do ensaio está presente a um quinto da concentração original no (replicação) da fase de ensaio 6-9 excrescência. Os atenua CARA carry-over efeitos sequestrando moléculas pequenas com carvão ativado. A maioria dos medicamentos contra a tuberculose e candidatos clínicos ligam carvão activado rapidamente e completamente, com a excepção do aminoglicósido estreptomicina 7. Inclusão de carvão ativado em placas de agar para ensaios CFU impedido inibição do crescimento bacteriano, ou morte bacteriana, por realizadas-over TMC207 e PA-824 7,21,22. Assim, em virtude de incorporação de carvão activado no ágar bacteriológico, o CARA não é dependente de diluições em série de células e agente de teste. O CARA pode ajudar a prever o impacto bacteriostático ou bactericida de replicar ativos e impacto bactericida de ativos não-replicante. em geral, o CARA é usado em paralelo com o MIC padrão 90 ensaios. O poder preditivo da CARA vem comparando MIC 90 e os resultados CARA (Figura 2 e Tabela 1). Quando usadas para estudar agentes anti-micobacterianos, a CARA pode prever com precisão a actividade bactericida que está a replicar (Figura 4a), replicando bacteriostático (Figura 4b), bactericida não replicante (Figura 4C), ou dupla activa (Figura 4d). O CARA também permite avaliação simples da actividade de um composto através tanto da dose e do tempo. Os ensaios de CFU por si só requerem uma grande quantidade de esforço e de material para avaliar a actividade de um composto sobre uma ampla gama de doses e tempos, mas a tarefa torna-se controlável quando resultados CARA limitar a gama de condições para aquelas em que o composto é demonstravelmente activa (Figura 5 ). Enquanto o CARA tem utilidade no estudo da acção de umNTI-infecciosos em micobactérias, o ensaio tem limitações. A CARA tem uma gama dinâmica estreita (3/2 log 10) e pode não ser apropriado para as condições em que se antecipa que não pode ser mais do que 2 a 3 log 10 morte bacteriana. previsões CARA requerem estudos adicionais utilizando um método mais rigoroso e preciso para enumerar os números bacterianos, tais como um ensaio de CFU. O efeito pós-antibiótico de alguns anti-infecciosos, tais como PAS, pode confundir o CARA como uma ferramenta preditiva para distinguir entre compostos com actividade bactericida e bacteriostática contra M. tuberculosis replicar 7. Há duas recomendações para melhorar a qualidade da CARA. Primeiro, é preciso derramar CARA microplacas rapidamente antes que os solidifica de ágar, mantendo a precisão volumétrica e evitar espirrar fora de micropoços. Independentemente do número de placas necessárias, recomendamos que 0,5 a 1 L de meio de lotes para ajudar a manter o médio na forma líquida para a duração do tempo requerido para placas de verter. Trocando as pontas com frequência durante o preenchimento microplacas com meio evita usar dicas parcialmente obstruídas. Em segundo lugar, deve-se minimizar a variabilidade artifactual na fluorescência entre repetições. Microcolônias micobacterianas, em particular para micobactérias patogénicas, tais como M. tuberculosis, muitas vezes crescem de forma irregular. Por exemplo, microcolônias que crescem na superfície de agar podem variar em tamanho, a forma, a altura, ou pode estender-se para as paredes interiores dos poços das microplacas. Um desafio é cobrir todos os bacilos uniformemente com o reagente em desenvolvimento. Outro obstáculo é que após incubação prolongada a 37 ° C, o meio bacteriológico sólido da CARA microplacas pode tornar-se seca e propenso a absorção do reagente revelador. Desde carvão activado pode ligar-se resazurina e extinguir a fluorescência 7, pode haver uma variação poço-a-poço devido a poços secos absorvem a resazurina e a solução de revelação Charcoa activadal têmpera resazurina fluorescência. Pré-molhar a superfície de todos os poços da microplaca CARA com PBS imediatamente antes de adicionar o reagente de desenvolvimento de mitiga ambos estes problemas - o reagente de desenvolvimento vai chegar a todas as colónias de micobactérias da mesma forma, e a resazurina permanece segura acima do carvão activado. O CARA pode ter aplicações na identificação e caracterização de fenótipos dos mutantes de micobactérias, ou de médio rendimento ensaios de descoberta de drogas para outras espécies bacterianas.

Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, podem sobreviver em um host em um estado latente que é refractário à erradicação antibiótico. Fenotípica (não-genética) resistência da M. tuberculosis durante a infecção se acredita ser devido, em parte, às populações de bacilos não replicantes 1,2. Classe persistentes I exibem resistência aos medicamentos fenotípica surgem através de mecanismos estocásticos rara entre grandes populações de células sensíveis a drogas 3,4. persistentes de classe II são tornados não-replicante por fatores de imunidade do hospedeiro, incluindo tensões externas em microambientes encontrados durante a infecção. Desenvolvemos recentemente um modelo in vitro de Classe II não replicante persistência para imitar as condições confrontados por M. tuberculosis em macrófagos activados e granulomas. O modelo multi-stress de Classe II persistência inclui condições que o crescimento lento, tal como uma fonte de carbono do ácido gordo, e completamente Halcrescimento T, tal como acidez suave (pH 5,0), hipoxia (1% de O2), e o óxido nítrico e outros intermediários reactivos de azoto 5-9. Triagem em larga escala empregando este modelo multi-stress de não-replicação, e outros modelos não-replicantes Classe II, rendeu diversas moléculas cuja actividade é dirigida contra o Estado não replicante 5-7,9-18. As mesmas telas não replicantes também revelou uma categoria de moléculas que possuem atividade contra bacilos de multiplicação e não replicantes, denominado &quot;dual ativos&quot; 7,10,12,19,20. Descoberta de drogas anti-bacteriana na fase de hit-to-lead implica extensa caracterização de moléculas candidatas para escolher leads para a expansão hit, caracterização farmacológica preliminar, a identificação do alvo, e estudos preliminares de eficácia in vivo. Como passo inicial, anti-infecciosos são classificados por seu mecanismo bacteriostático ou bactericida de ação e, se bactericida, wmorte bacteriana hether é tempo e / ou dependente da concentração. O ensaio de formação de colónias unidade (CFU) é o método padrão clássico, ouro para abordar estas questões. No ensaio de CFU, as bactérias são expostas a um agente de teste, após o que se alíquotas são removidas, diluídas em série, e aliquotas de diluições são espalhadas em meio bacteriológico sólida e incubados para permitir o crescimento de células sobreviventes. Finalmente, as colónias bacterianas são enumerados. O ensaio de CFU requer um grande número de placas de microtitulação para diluir as células de petri e placas contendo agar para enumerar colónias sobreviventes. O ensaio CFU para lenta micobactérias de crescimento é prejudicado por seu tempo lento geração (18-24 h), o que requer cerca de 3 semanas para que as colónias a aparecer em placas. Além disso, o espaço da incubadora é muitas vezes limitada em especializados biossegurança de nível-3 instalações. Enquanto pesado, ensaios de CFU são o padrão de ouro para caracterizar o impacto das moléculas não-replicantes e dual-ativos na mycobacterI a. Ensaios não replicantes são sujeitos a altas taxas de falso-positivos como muitos são acoplados a replicação de ensaios para avaliar a viabilidade celular 6-8. Por exemplo, um composto que tem uma actividade potente contra a replicação de M. tuberculosis (um &quot;replicar activo&quot;) pode falhar para matar durante o ensaio não replicante, e ainda assim pode matar em virtude da transição a partir da fase de não reprodução do ensaio para a fase de recuperação do ensaio, que é conduzida em condições que suportam a replicação ( &quot;replicar condições&quot;). Composto transitar complica ainda mais a análise de moléculas ativas dupla, tornando-se difícil distinguir se a atividade foi replicar, não replicantes, ou duplo. Para resolver os problemas descritos acima, foi desenvolvido o c harcoal um gar r esazurin um ssay (CARA) para uma rápida contagem, semi-quantitativa de espécies de micobactérias tais como M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. smegmatis e 7 (Figuras 1 e 2). Em soluções tampão in vitro, carvão activado sequestra rapidamente a maioria das drogas convencionais utilizadas no tratamento da tuberculose 7. O carvão ativado em CARA microplacas liga compostos que podem transportar mais de uma microplaca de ensaio, e esta característica da CARA elimina a necessidade de diluir em série conteúdos ensaio bem antes de enumeração 7,21,22. O número de microcolónias micobacterianos sobre a superfície de agar de CARA microplacas é estimada pela adição de resazurina, um corante azul, cuja forma reduzida, resorufina, é uma molécula de rosa, cuja fluorescência é medida por espectrofotometria de um 23. CARA microplacas são incubadas durante 1-2 dias de M. smegmatis e de 7-10 dias para as micobactérias de crescimento lento, tais como M. tuberculosis e M. bovis BCG. O CARA tem uma faixa dinâmica estreita do ~ 2-3 log 10 diferência em CFU. Quando usado em vez de um ensaio CFU, uma única microplaca CARA substitui cerca de cinco placas de 96 poços utilizados para diluições em série e as placas de agar 120 tri-estilo utilizados para o chapeamento. Interpretação dos dados CARA ajuda a orientar estudos posteriores, determinando que a incubação tempos e concentrações de compostos para testar em ensaios baseados em CFU mais trabalhoso.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>Beckton Dickinson</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11</td><td>Beckton Dickinson</td><td>298810</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>BSA, choque térmico</td><td>Roche</td><td>3118958001</td><td></td></tr><tr><td>carvão ativado</td><td>Sigma</td><td>C5510</td><td></td></tr><tr><td>PBS, Ca2+ e Mg2+ de Dulbecco Free</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>entre 80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>tiloxapol</td><td></td><td></td> Nitrito de sódio Sigma <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>rifampicina</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>6-bromo-1H-indazol-3-amina</td><td>Alfa Aesar</td><td>H34095</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio monobásico&nbsp; &nbsp;</td><td>Sulfato de magnésio Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>, heptahidratado&nbsp;</td><td>Citrato</td> de amônio férrico Sigma <td>M1880</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sulfato</td> de zinco Sigma <td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>, heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de amônio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>ácido butírico, líquido</td><td>Sigma</td><td>B103500</td><td></td></tr><tr><td>resazurina em pó</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>solução preparada de resazurina</td>Adesivos de PCR <td>Invitrogen</td><td>DAL1100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Espectrofotômetro Denville</td><td>B1212-5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>96 poços, microplacas tratadas com cultura de tecidos</td><td>Reservatórios de reagentes Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR&nbsp;</td><td>89094-678</td><td></td></tr><tr><td>sacos de plástico reutilizáveis</td><td>VWR&nbsp;</td><td>395-94602</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo de polipropileno de 14 ml</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Frasco de cultura de células</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>microplaca de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo plano e transparente Microplaca de 96 poços</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 para OS X</td><td>GraphPad</td><td>http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização do carvão agar resazurina ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Há uma necessidade urgente de descobrir e progredir anti-infecciosos que encurtam a duração do tratamento da tuberculose (TB). Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, é refractário à quimioterapia rápida e duradoura, devido à presença de bacilos que exibem resistência a drogas fenotípica. O c harcoal um gar r esazurin um ssay (CARA) foi desenvolvido como uma ferramenta para caracterizar moléculas ativas descobertos por campanhas de rastreio de alto rendimento contra replicar e não replicante M. tuberculosis. Inclusão de carvão activado em meio agar bacteriologic ajuda a atenuar o impacto do composto carry-over, e elimina a exigência de células antes da mancha em CARA microplacas pré-diluir. Após um período de incubação de 7-10 dias a 37 ° C, a redução da resazurina por microcolônias micobacterianas que crescem na superfície de poços CARA permite semi-quantitativa assessment do número de bactérias através de fluorometria. O CARA detecta aproximadamente 2-3 log 10 diferença no número de bactérias e prevê uma concentração bactericida mínima levando a ≥99% a morte bacteriana (MBC ≥99). A CARA ajuda a determinar se uma molécula está activa em bacilos que estão a replicar, não replicantes, ou ambos. experiências piloto utilizando o CARA facilitar a identificação de qual a concentração de agente de teste e o tempo de exposição ao composto requerem avaliação adicional por meio de ensaios de formação de colónias (CFU) da unidade. Além disso, o CARA pode prever se replicar são activos bactericida ou bacteriostático.

CARA resultados antecipados estão descritos na Figura 2 e resumidos na Tabela 1. Para as células replicar, o CARA é executado em paralelo com um padrão de MIC 90 ensaios, e para ensaios não-replicante, o CARA é executado em paralelo com um ensaio MIC 90 adaptada que é acoplado a uma fase conseqüência. A concentração de agente de teste que resulta em falha de Cara-de fluorescência a subir acima dos níveis de fundo é a cara-MBC ≥99 (Figura 3a). O &quot;≥99&quot; subscrito indica que a cara-MBC proporciona uma concentração estimada de agente de teste que dá origem a ≥2 log10 morte bacteriana (≥99% de mortes). O ensaio líquido caldo MIC 90 é incapaz de distinguir entre atividade bactericida e bacteriostática e esta distinção tem de ser resolvido por um ensaio CFU. Deconvenção, o limite que distingue bactericida da atividade bacteriostática para slow-micobactérias de crescimento é de cerca de 2-3 log 10 mortes causadas por 7 dias 7,26. Uma vez que a faixa dinâmica da CARA também é 2-3 log de 10 mortes, o CARA pode fornecer uma estimativa da atividade bactericida ou bacteriostático. A CARA facilmente identifica alguns agentes activos de replicação como bacteriostática devido a falha destes compostos para diminuir CARA fluorescência para os níveis de fundo (Figura 2). No entanto, alguns compostos com actividade bacteriostática contra M. tuberculosis replicar ter um efeito pós-antibiótico potente, o que significa que eles continuam a inibir novo crescimento de bactérias durante a fase de recuperação, mesmo na ausência do composto de reporte. Este efeito pode ser difícil reconhecer no ensaio CARA. Os compostos são suspeitos de exercer um efeito pós-antibiótico se eles exibem uma &quot;janela estática&quot;, definida como uma mudança&gt; 4 vezes para a direita entrn as curvas MIC e Cara (Figura 3b). A janela estático indica que uma molécula activa contra a replicação de M. tuberculosis podem ser bacteriostáticos em vez de bactericida. Em alguns casos, as janelas estáticas são aparentes apenas após a inspeção de um eixo Y expandida para CARA fluorescência (Figura 3c e 3d). 90 Cara e dados de MIC são geralmente representados graficamente em conjunto (Figura 4). Os dados representativos para moléculas replicating- e não replicantes-activos testados por MIC 90 e Cara são mostrados na Figura 4. Existem 4 grandes classes de actividade de moléculas: 1) replicando bactericida (demonstradas com isoniazida, Figura 4a); 2) replicação bacteriostático (demonstrado com linezolida, Figura 4b); 3) não replicar bactericida (demonstrado com oxifenbutazona, Figura 4c); e, 4) repbactericida licating-activo (bacteriostáticos ou bactericidas) e não replicante (demonstrado com PA-824, Figura 4D). Importante, as Figuras 4A e 4B demonstram que enquanto a isoniazida e linezolida parecem ter actividade contra bactérias não replicantes pelo ensaio MIC 90, o CARA sugere que eles são inactivos sob as condições não-replicante testados. Para testar a utilidade da CARA predizendo o impacto tempo e dependente da concentração de uma molécula, replicando M. smegmatis foi exposta a concentrações crescentes de rifampicina (Figuras 5a - d), e em vários momentos entre 1-24 horas, as alíquotas foram manchados em placas de Cara. Estes dados indicaram que a rifampicina exercido um impacto tão cedo quanto de 1 hora (figura 5a), apresentado o aumento da actividade bactericida entre 3 e 24 horas (figuras 5B-d), e matou ≥2-3 log 10 em ~ 10 ug / ml, por dois4 h (Figura 5D). Uma experiência semelhante testando quadruplicado de um veículo de controlo e 9 as concentrações de droga, e em 4 pontos de tempo, seriam proibitivos por um ensaio padrão baseado em CFU. Assim, o CARA tem um papel na descoberta de drogas como um meio-débito, mecanismo rápido para identificar um perfil de actividade da molécula. previsões CARA devem ser rigorosamente avaliados utilizando um ensaio CFU padrão. A adição de 0,4% de carvão activado para placas de Petri para a análise de CFU pode ajudar a melhorar a correlação de dados de cara, e pode resultar em contagens de CFU mais precisos, a magnitude da correcção sendo geralmente proporcional à potência do composto 21,22. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig1.jpg" /> Figura 1: O CARA é uma ferramenta preditiva na descoberta de medicamentos. Este diagrama resume a utilidade do CARA como umestágio intermediário entre a seleção da droga (screening ponto único, cherry-picking e ensaios de dose-resposta) e ensaios demoradas hit-to-lead (ensaios de UFC ea identificação do alvo). [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig2.jpg" /> Figura 2: Representação esquemática do ensaio em caldo MIC 90 e Cara com os resultados esperados. Ambos os MIC 90 e Cara resultados são apresentados para 8 actividades possíveis. A codificação de cores para MIC 90 poços é branco (sem crescimento) e marrom (crescimento), e para CARA microplacas é preto (ausência de fluorescência) e rosa (fluorescência resorufina). Os dados são hipotéticas. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig3.jpg" /> Figura 3: Especializada termos Cara e definições. A concentração bactericida mínima de uma molécula que resulta em níveis de fluorescência de fundo CARA é a cara-MBC ≥99 (a). Sob condições de replicação, um deslocamento ≥4 vezes da cara-≥99 MBC para a direita da MIC 90 geralmente indica actividade bacteriostática e é chamada uma &quot;janela estática&quot; (b). Para moléculas com um efeito pós-antibiótico potente, janelas estáticos podem ser difíceis de observar, (c) e requeremexpansão do eixo Y (CARA fluorescência) para visualizar (d). Os dados são hipotéticas. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig4.jpg" /> Figura 4: MIC ilustrativa 90 e CARA resultados para selecionar compostos. Dados para o MIC 90 (vermelho) e Cara (azul) são demonstradas por (uma) isoniazida (INH), (b) linezolida, (c), oxifenbutazona, e (d) PA-824. De tipo selvagem de M. tuberculosis H37Rv foi exposta aos compostos durante 7 dias sob condições de replicação padrão ou o modelo multi-stress de não replicação 7-9.<html> MIC 90 e Cara ensaios foram realizados como se mostra na Figura 2. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig5.jpg" /> Figura 5: dose e actividade dependente do tempo de rifampicina. O não-patogénico, de crescimento rápido M. smegmatis foi exposta a concentrações crescentes de rifampicina sob condições de replicação e alíquotas foram amostrados para Cara em 1 (a), 3 (b), 6 (c) e 24 (d) h. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7].com / files / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54690/54690tbl1.jpg" /> Tabela 1: Resumo dos resultados esperados na Figura 2. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690tbl1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a>

O charcoal agar resazurin assay (CARA) é um método semiquantitativo de médio rendimento para avaliar a atividade de agentes de teste contra micobactérias que são replicantes, não replicantes ou ambas. O CARA permite uma avaliação rápida da atividade dependente do tempo e da concentração e identifica os parâmetros a serem seguidos pelos ensaios de unidade formadora de colônias (UFC).

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

O objetivo geral do CARA é fornecer uma avaliação semiquantitativa de média escala da atividade de compostos contra micobactérias replicantes e não replicantes. A principal vantagem dessa técnica é que, como substituto da UFC, o CARA permite testar rapidamente a dependência da dose e do tempo de um composto. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de descoberta de fármacos para tuberculose, como determinar se um composto é bacteriostático ou bactericida contra bactérias replicantes e se é bactericida contra bactérias não replicantes.A demonstrar o método estará Julia Roberts, uma colaboradora do nosso laboratório. Adicione 450 mililitros de água a um béquer de vidro de um litro ou 900 mililitros de água a um frasco Erlenmeyer de dois litros. Inclua uma barra de agitação autoclavável no béquer ou frasco.Em seguida, adicione o pó Middlebrook 7H11, carvão ativado, a uma solução de glicerol a 50%, até atingir uma concentração final de 0,4%, e ajuste a solução de glicerol a 50% para obter uma concentração final de 0,2%. Cubra a abertura do frasco ou béquer com papel alumínio e fixe ao vidro com fita para autoclave. Após a autoclavação do meio, resfrie-o até aproximadamente 55 a 65 graus Celsius em uma placa de agitação magnética regulada em baixa velocidade para manter o carvão em suspensão.Enquanto trabalha assépticamente em uma capela de segurança biológica que possui uma placa de agitação magnética, remova o papel alumínio do meio e adicione 100 ou 50 mililitros do suplemento OADC ao frasco de dois litros ou ao béquer de um litro, respectivamente, e continue a misturar. Usando uma pipeta multicanal com oito ou 12 ponteiras com filtro, preencha uma placa de microplaca de 96 poços com 200 microlitros por poço de 7H11-OADC-carvão ativado proveniente do reservatório de reagentes ou do béquer, trabalhando rapidamente para evitar a solidificação do ágar e a formação de bolhas. Coloque pilhas de microplacas CARA em sacos plásticos reutilizáveis para evitar dessecação e armazene-as a quatro graus Celsius.Inocule tubos c&ocirc;nicos de centr&iacute;fuga de fundo redondo de polipropileno contendo quatro ou vinte mililitros, respectivamente, de Middlebrook 7H9-ADN ou 7H9-OADC com M. smegmatis em uma OD580 de 0,01 a 0,1. Incube os cultivos de M. smegmatis a 37 graus Celsius e 20% O2 com agita&ccedil;&atilde;o, expandindo os cultivos at&eacute; a fase logar&iacute;tmica m&eacute;dia ou uma OD580 aproximada de 0,5. Para montar um experimento no estilo de concentra&ccedil;&atilde;o inibit&oacute;ria m&iacute;nima sob condi&ccedil;&otilde;es de replica&ccedil;&atilde;o e n&atilde;o replica&ccedil;&atilde;o, distribua 200 microlitros de c&eacute;lulas em 7H9-ADN com OD580 de 0,01 em todas as cavidades de uma placa de 96 po&ccedil;os com fundo transparente e tratada para cultura de tecidos.Para o ensaio de não replicação, use PBS contendo 0,02% de tioloxapol para lavar as células duas vezes. E use meio de não replicação para ressuspender as células. Use meio de não replicação para diluir as células até uma OD580 de 0,1 e adicione nitrato de sódio até uma concentração final de 0,5 a 5 milimolar, a partir de um estoque recém-preparado de um molar.Distribua 200 microlitros de células com uma DO580 de 0,1 para todas as cavidades de uma placa de 96 poços com fundo transparente e tratado para cultura de tecidos. Após preparar os agentes de teste de acordo com o protocolo descrito no texto, adicione dois microlitros do agente de teste um nas linhas A a E e dois microlitros do agente de teste dois nas linhas E a H, e misture bem. Para ensaios em replicação, incube as microplacas de M. smegmatis a 37 graus Celsius, 20% O2 e 5% CO2 por um a 48 horas.Nos momentos em que o CARA for utilizado como leitura, use uma pipeta multicanal p200 ajustada em 50 a 75 microlitros para ressuspender cuidadosamente o conteúdo dos poços da placa do ensaio no estilo MIC90, pipetando para cima e para baixo de cinco a dez vezes. Em seguida, use as ponteiras da pipeta para agitar suavemente o conteúdo dos poços em movimento circular. Transfira 10 microlitros do conteúdo dos poços do ensaio sem diluição para os poços correspondentes da microplaca CARA, evitando respingos durante as transferências, garantindo que a alíquota de 10 microlitros seja depositada no centro dos poços da microplaca CARA.Com fita adesiva para placas, fixe pilhas de microplacas CARA e, em seguida, coloque-as em um saco plástico com fechamento hermético. Incube as microplacas CARA de M. smegmatis a 37 graus Celsius com 20% de O₂ por um a dois dias para as placas com replicação e por dois a três dias para as placas sem replicação. Quando uma película de crescimento bacteriano ou colônias macroscópicas maiores forem visíveis nos poços do controle negativo, utilize um único conjunto de 12 ponteiras p200 com uma pipeta multicanal para dispensar 40 microlitros de PBS estéril ao longo da lateral dos poços e permita que o PBS se distribua sobre a superfície do ágar/colônias microbianas bacterianas.Prepare o reagente revelador CARA misturando cinco miligramas de resazurina e 50 mililitros de Tween80 a 5% em PBS. Adicione 50 microlitros do reagente revelador CARA recém-preparado a cada poço da microplaca CARA. Em seguida, agite suavemente as placas de um lado para o outro algumas vezes para ajudar a distribuir o reagente por toda a camada de ágar e o tapete bacteriano em cada poço.Coloque as placas em um saco plástico com fechamento hermético e incube a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos para M. smegmatis. Antes de ler a fluorescência, coloque as microplacas CARA em uma cabine de segurança biológica por 15 minutos à temperatura ambiente com as tampas removidas. Ao utilizar espectrofotômetros BSL3 fora de uma cabine de segurança biológica, adicione um adesivo PCR de qualidade óptica sobre a placa e use uma toalha de papel macia para selar firmemente, pressionando suavemente sobre a superfície do adesivo.Determine a fluorescência por leitura superior com excitação em 530 nanômetros e emissão em 590 nanômetros. Não é necessário fazer o branco da placa. Para analisar os dados, plote a concentração do inibidor no eixo X em escala log10 e a fluorescência no eixo Y em escala linear.Consulte o protocolo em texto para obter detalhes adicionais. A concentração do agente em teste que resulta na falha da fluorescência do CARA em aumentar acima dos níveis de fundo é a CMB-CARA maior ou igual a 99, mostrada aqui. O subscrito maior ou igual a 99 indica que a CMB-CARA fornece uma concentração estimada do agente em teste, que resulta em uma redução bacteriana maior ou igual a dois log10.Desconfia-se de que compostos exerçam um efeito pós-antibiótico se exibirem uma janela estática, definida como um deslocamento superior a quatro vezes para a direita entre as curvas de MIC e CARA. A janela estática indica que uma molécula ativa contra o M.tuberculosis em replicação pode ser bacteriostática em vez de bactericida. Para moléculas com um efeito pós-antibiótico potente, as janelas estáticas podem ser difíceis de observar e tornam-se aparentes apenas após a inspeção de um eixo Y expandido para a fluorescência CARA, como visto aqui.Moléculas ativas replicantes e não replicantes testadas pelo MIC90 e CARA são mostradas aqui. Embora a isoniazida e a linezolida pareçam ter atividade contra bactérias não replicantes pelo ensaio de MIC90, o CARA sugere que elas são inativas sob as condições não replicantes testadas. Neste experimento de CARA, expor M. smegmatis a concentrações crescentes de rifampicina revelou um impacto em apenas uma hora e exibiu atividade bactericida crescente entre três e 24 horas, matando mais de dois a três log10 em aproximadamente 10 microgramas por mililitro após 24 horas.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente duas horas para preparar as placas, menos de uma hora para transferir as células para as placas CARA e de uma a duas horas para desenvolver e medir a fluorescência das placas CARA, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar o CARA como um ensaio preditivo para determinar se um composto possui atividade bactericida ou bacteriostática contra micobactérias em replicação ou não replicantes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um CARA e analisar os dados de maneira a ajudar a prever o tipo de atividade de um composto.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

visualization-charcoal-agar-resazurin-assay-for-semi-quantitative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo mostra o Ensaio de Resazurina de Ágar Carvão (CARA) para avaliar a atividade de compostos antimicrobianos contra Mycobacterium tuberculosis. O CARA auxilia na avaliação da eficácia desses compostos, medindo seu impacto no crescimento bacteriano e distinguindo entre efeitos bactericidas e bacteriostáticos.

Um ensaio de resazurina de ágar carvão para avaliar a atividade do composto de teste contra micobactérias

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar a eficácia de medicamentos contra a infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  É gerado um modelo de infecção in vitro contendo agregados de Mtb/macrófagos que mimetiza a infecção in vivo. Após a introdução de antibióticos adequados, sua eficácia é testada por meio do ensaio de resuzarina para monitorar a sobrevivência das bactérias com o aumento das concentrações de drogas.

Um ensaio para avaliar a eficácia do medicamento contra um modelo de infecção por Mycobacterium tuberculosis

Este vídeo demonstra um ensaio em caldo para determinar a eficácia do antibiótico contra o Mycobacterium tuberculosis. A cultura bacteriana é incubada com diferentes concentrações de um antibiótico bactericida. A eficácia bactericida é medida avaliando a presença de bactérias viáveis usando um ensaio de resazurina.

Avaliando a eficácia de um composto de teste contra micobactérias em caldo

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Novos modelos e ensaios que melhorariam o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para a próxima geração de medicamentos antituberculose são altamente desejáveis. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, barato e compatível com BSL-2 para avaliar a eficácia do medicamento contra Mycobacterium tuberculosis que pode ser facilmente adaptado para triagem de alto rendimento.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose

A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

Este estudo desenvolveu um ensaio para triagem de alto rendimento contra Mycobacterium abscessus com uma cepa repórter dupla recém-criada, usando fluorescência e luminescência para avaliar a viabilidade bacteriana rapidamente. Este protocolo será relevante para pesquisadores que pretendem rastrear novos medicamentos contra essa bactéria resistente a medicamentos.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Aqui, apresentamos um protocolo para identificar potenciais candidatos a medicamentos antituberculosos por meio de triagem fenotípica, abrangendo a síntese química de um composto de 4-aminoquinolina, a determinação de sua concentração inibitória mínima contra Mycobacterium tuberculosis e a avaliação de sua citotoxicidade em linhagens celulares de mamíferos.

Identificação de Potenciais Candidatos Anti-TB: Um Guia Passo a Passo para Síntese, Determinação de CMI e Avaliação de Citotoxicidade em Células de Mamíferos

Aprenda a realizar o ensaio CARA para avaliar a atividade de compostos contra micobactérias replicantes e não replicantes. Este método semi-quantitativo de médio rendimento acelera a descoberta de fármacos contra tuberculose.

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

Explorar mais vídeos