LED Thermo Flow - Combinando optogenética com Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste método é estimular substâncias opticamente controladas durante as medições de citometria de fluxo. Este novo dispositivo pode ajudar a responder a questões-chave no campo da sinalização celular, combinando o poder de substâncias opticamente controladas com citometria de fluxo. Pela primeira vez, as ferramentas optogenéticas podem ser caracterizadas e analisadas usando citometria de fluxo.

Nenhum método estabelecido comparável existia até hoje. Para começar, suspenda os linfócitos Ramos B transduzidos na concentração de um milhão de células por mililitro e transfira-os para um tubo de vidro FACS. Em seguida, troque o O-ring preto do citômetro de fluxo por um O-ring de borracha e aplique graxa de silicone para criar uma vedação melhor.

Insira o tubo de vidro em um citômetro de fluxo e coloque o protótipo de LED ao redor do tubo com as luzes apagadas. Meça a intensidade de fluorescência de Dronpa no canal GFP. A etapa mais crítica do procedimento é o manuseio dos tubos de vidro.

Os tubos de vidro FACS são muito frágeis e, portanto, recomenda-se praticar a inserção dos tubos de vidro no citômetro antes de fazer experimentos. Em seguida, acenda a luz LED de 500 nanômetros na parte externa do tubo e continue medindo a intensidade de fluorescência de Dronpa. Aumente a intensidade das luzes LED até que a intensidade de fluorescência de Dronpa diminua, a fim de estimar a intensidade mínima de luz necessária, a fim de medir a fotocomutação da proteína Dronpa-Linker-Dronpa.

Em seguida, ligue a luz LED de 400 nanômetros do protótipo na parte externa do tubo e continue medindo a intensidade de fluorescência do Dronpa. Aumente a intensidade da luz das luzes LED de 400 nanômetros até que a intensidade da fluorescência Dronpa aumente. Comece seguindo as instruções de design e fabricação no protocolo de texto que acompanha para fabricar as camadas interna e externa do dispositivo LED de fotocomutação.

Insira os LEDs de comprimento de onda de 400 e 500 nanômetros nos canais do dispositivo. Cole-os no lugar e conecte-os conforme as instruções. Esses comprimentos de onda específicos serão usados para alternar as proteínas de fusão Dronpa-Linker-Dronpa entre seus estados escuro e claro.

Em seguida, monte o dispositivo e certifique-se de que seja à prova d'água para evitar vazamentos antes de ligar o transformador. Após a montagem do dispositivo, colha os linfócitos Ramos B e suspenda-os em uma densidade de três a dez milhões de células por mililitro. Transfira 600 microlitros das células para um tubo FACS de vidro.

Coloque-os no gelo e proteja as células da luz até que sejam medidos. Conecte o dispositivo montado a uma bomba de água aquecida e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Em seguida, insira cuidadosamente o tubo FACS de vidro no dispositivo e conecte-o ao citômetro de fluxo.

Registre a intensidade fluorescente de Dronpa no canal GFP. O design desses dispositivos optogenéticos inclui uma câmara que pode ser conectada a um suprimento de água circulante para manter a temperatura da amostra em um valor constante. Embora o dispositivo emitisse três comprimentos de onda diferentes, apenas um aumento marginal de temperatura foi observado na amostra FACS, ao fluir água a 37 graus Celsius através do dispositivo.

A construção de fusão Dronpa-Linker-Dronpa foi clonada e transduzida em células Ramos B. Quando direcionado para o estado monômero por uma fonte de luz de 500 nanômetros, a intensidade da emissão diminui. Então, uma vez que a fonte de luz é trocada para a luz de 400 nanômetros, o monômero Dronpa é rapidamente alterado para o estado de dímero e a intensidade aumenta rapidamente.

Usando este dispositivo, a proteína de fusão citosólica Dronpa-Linker-Dronpa foi capaz de ser fotocomutada várias vezes. A mudança para o estado escuro ocorre lentamente, enquanto a mudança para o estado claro acontece quase instantaneamente. A recuperação espontânea da fluorescência de Dronpa no escuro mostra que a fotocomutação eficiente para a forma brilhante requer iluminação específica e ocorre apenas lentamente espontaneamente.

A análise cinética mostra que a velocidade de fotocomutação é em geral muito reprodutível e que, mesmo após uma longa incubação no escuro, apenas cerca de dez por cento da fluorescência é recuperada sem fotochave. Seguindo este procedimento, qualquer análise de citometria de fluxo, incluindo medições de fluxo de cálcio, pode ser realizada para explorar a funcionalidade da ferramenta optogenética escolhida. Após seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da optogenética explorarem a fiação das vias de sinalização celular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer um protocolo de fotocomutação para sua ferramenta optogenética específica. Não se esqueça de que a luz ultravioleta pode ser extremamente perigosa e a precaução, como óculos de proteção, deve sempre ser usada durante a realização deste procedimento.