Name: Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a visualizar linfócitos produtores de IL-22 em tecidos de camundongos usando um modelo transgênico repórter. Este método permite rastrear citocinas in vivo e estudar respostas imunes em doenças inflamatórias intestinais.

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Agradecemos a Kelli Czarra e Megan Karwan pela assistência técnica animal, Kathleen Noer e Roberta Matthai pela assistência à citometria de fluxo e Donna Butcher e Miriam R. Anver pela análise patológica. Este projeto foi apoiado por uma doação da Ely and Edythe Broad Foundation (para Scott Durum) e foi financiado no todo ou em parte com fundos federais do National Cancer Institute, National Institutes of Health, sob o Contrato No. HHSN261200800001E (MRA).

Todos os animais receberam a atenção adequada de acordo com os procedimentos experimentais descritos no Guia de 2011 para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório Comité das Frederick National Laboratory for Cancer Research. 1. Geração de IL-22-tdTomato Mice repórter por BAC recombineering NOTA: Os ratos devem estar inconsciente e não se movem em resposta a um estímulo nocivo. Esterilizar a área cirúrgica com 70% de etanol e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos usando um esterilizador de esferas de vidro. <ol><li> Purifica-se o DNA de BAC (RP23-401E11, comprimento clone 228391 pb), utilizando um método de extracção alcalina 10, 11. Caracterizar o clone BAC por Spel digestão de 5 ug de RP23-401E11 para confirmar o tamanho correcto do gene alvo. NOTA: O DNA BAC foi digerido em 14 fragmentos. </li><li> Inserir o gene repórter TdTomato no sítio Not I / Sal I do shuttle vector PLD53SC-A-GFP-B11 e substituir o gene da GFP no mesmo local. Em seguida, utilizando RP23-401E11 BAC como molde, amplificar as caixas de homologia (A e B) para o primeiro exão traduzido de IL-22 (exão 1) por PCR (95 ° C, 2 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg, e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min). Num sistema de reacção de PCR de 50 uL, adicionar 50 ng (1 pi) de DNA de BAC, 0,5 ul de iniciadores (10 uM), 40 ul de PCR Supermix alta fidelidade, e 8 mL de H 2 O. NOTA: Os iniciadores para as caixas A e B são como se segue: Uma caixa para a frente: 5&#39;-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG e reverso: 5&#39;-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; Caixa de B Forward: 5&#39;-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA e Reverse: 5&#39;-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Os locais das enzimas de restrição (Asc I e Pac I) estão sublinhados. </li><li> Ligadura 500 ng de Asc I-digerido A e 500 ng de Fragm B Pac I-digeridoentos em 50 ng de PLD53SC-ATB (tdTomato) vector a 16 ° C durante 1 h. </li><li> Transformar o vector PLD53SC-ATB purificada em células competentes BAC-11 e cultura deles em meio Luria-Bertani (LB) placas de agar com cloranfenicol (20? G / ml) e ampicilina (30 ug / ml) a 37 ° C. Escolha dois a três colónias de co-integrar a partir das placas principais CH / Amp. </li><li> Inocular cada colónia em 1 ml de LB suplementado com 20 ug / ml de cloranfenicol e incubar durante 1 hora a 37 ° C e 225 rpm. Espalhe 100 ul de cada mistura sobre uma placa de LB-agar (10 g de peptona 140, 5 g de extracto de levedura, 12 g de ágar e 1 L de água; pH 7,5) suplementado com cloranfenicol e 4-4,5% de sacarose. Incubar a cultura durante a noite a 37 ° C. </li><li> Escolha ambas as colônias grandes e pequenos e replate-los em duas placas LB-ágar com cloranfenicol. Em seguida, expor as placas com ou sem luz UV durante 30 segundos e escolher as colónias sensíveis aos raios UV para uma análise mais aprofundada. </li><li> Identificar o DNA BAC modificado por PCR usando tdTomato / IL-22 iniciador heterozigotos (Forward: 5 &#39;ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT; Reverso: 5&#39; TGT AAT CGG ggA TGT CGG C). As condições de ciclos térmicos são as seguintes: 95 ° C durante 2 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 56 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg; e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min. </li><li> Confirmar a sequência da área modificada do BAC por sequenciação BAC direta da grande-prep BAC DNA 12. </li><li> Anestesiar um rato receptor com uma dose de 0,25% tribromoetanol para dentro da cavidade peritoneal, quando da instalação do micro-injectadas em ratinhos zigotos / 6c C57BL pseudo-grávida. </li><li> Linearizar a IL-22-tdTomato BAC construção (10 ug) por digestão com 5 ul de restrição endonucleasePi-Scel em 100 ul do sistema de reacção e microinject o DNA de BAC linearizado em ovos fertilizados de ratinhos C57BL / 6 fêmeas na fase pronuclear 13. screen ratinhos transgénicos por análise de mancha de Southern de DNA isolado a partir de biópsias da cauda usando os procedimentos padrão. </li></ol> Preparação 2. uma única célula de baços, timo, linfonodos e placas de Peyer NOTA: ratinhos repórter de IL-22-tdTomato foram mantidas no National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). O método de eutanásia está em conformidade com as orientações AVMA mais recentes sobre a eutanásia. Todos os ratinhos foram sacrificados usando inalação de CO 2 14. <ol><li> Euthanize um IL-22-tdTomato do mouse em uma câmara de CO 2 e colocá-lo em uma almofada limpo. Esterilizar a pele do abdômen por pulverização álcool 70% e cortá-la aberta. Remover o baço no flanco esquerdo e o timo por trás do esterno. </li><li> Para colher os nós mesentericlymph (localizada no tecido mesentérica) e placas de Peyer (pequenos lymphoidnodules toda a região do íleo do intestino delgado), pegue a mesentérica branco perolado nodos perto de tele parede do intestino delgado dissecar usando fórceps com pontas finas-ponto serrilhadas primeiro e, em seguida, remover todo o intestino delgado e cólon para fora do corpo. Encontrar as manchas ovais estendidas (placas de Peyer) ao longo do intestino e cortá-los com tesoura. Moer estes tecidos linfóides (gânglios linfáticos e placas de Peyer) individualmente entre duas lâminas foscas em uma suspensão de uma única célula em soro fetal de bovino / 1% de PBS (FBS) a tampão em gelo. </li><li> Picar o baço ou tecidos do timo utilizando o mesmo método que no passo 2.2. Centrifugar a suspensão do baço durante 8 min a 500 xg e 4 ° C. Adicionar 1 ml de tampão de lise ACK por baço para os sedimentos celulares. </li><li> Misture bem e deixe-os repousar durante 1 min. Adicionar 9 ml de tampão de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) a cada amostra. Girar para baixo por centrifugação durante 8 min a 500 xg e 4 ° C para remover os glóbulos vermelhos. NOTA: Não adicionar tampão de lise ACK para as células do timo. </li><li> Ressuspender os leucócitos, resultando em 5 ml de PBS e Pass as células através de um coador de células de 100 um. Recolher os sedimentos celulares por centrifugação a 500 xg durante 8 minutos. </li><li> Ressuspender as células em 5 ml de meio RPMI ou em tampão FACS e contar as células viáveis, utilizando 0,4% de corante azul de tripano solução / PBS. </li></ol> 3. Isolamento de Intraepithelial linfócitos e lâmina própria células dos intestinos <ol><li> Abra a pele abdominal como no passo 2.1 cortar o intestino delgado, do duodeno (ao lado do estômago) para íleo (junto ao apêndice), e todo o cólon, bem acima do ânus. Remover o tecido adiposo extra e utilizando fórceps mesentéricos. Colocar os intestinos imediatamente em PBS arrefecido em gelo. </li><li> Procure placas de Peyer (pequenos nódulos ásperas) ao longo da região distal do intestino delgado. Retire as massas usando uma pinça andopen intestino longitudinalmente com uma tesoura. Lave bem o intestino com 10 ml de PBS gelado. </li><li> Incubar os tecidos em 20 ml de tampão de pré-digestão (5 mM de EDTAe ditiotreitol 1 mM em solução salina equilibrada de Hank (HBSS)) durante 30 min a 37 ° C com rotação lenta (50 rpm) num agitador. Depois de cada uma das incubações 2, remover a camada de células epiteliais, contendo os linfócitos intraepiteliais (IELS), por agitação em vórtice intensa (30 segundos a 12000 rpm) e transmitir todos os tecidos através de um filtro de células de 100 um. </li><li> Adicionar 20 ml de solução de EDTA novo para o tecido para segunda incubação durante 30 min a 37 ° C. Passar as fracções IEL através de um filtro de células de 100 um e reuni-los com as fracções anteriores. Manter os fragmentos restantes do intestino em gelo a ser tratada no passo 3.9. </li><li> Centrifugar as fracções IEL reunidas a 800 xg durante 5 min a 4 ° C. Lavam-se as fracções reunidas IEL com 10 ml de HBSS / 5% de FBS e colocá-los para baixo durante 5 min a 800 xg e 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células em 8 ml de meio de 44% de sílica coloidal 15, cobrindo-as de forma sílica coloidal 5 ml de 67%. Centrifugar a 44% / 67gradiente de mistura de células 0,5% durante 20 min à temperatura ambiente e 1500 x g. </li><li> Recolher as células IEL da banda na interface. Em primeiro lugar, remover a camada superior do sobrenadante (cerca de 5 ml) com 1 ml da pipeta. Em seguida, IELs colheita na interfase do gradiente médio de sílica coloidal. </li><li> Lavar as IELs por adição de 10 ml de meio RPMI. Rodar as células para baixo durante 5 min a 800 xg e 4 ° C. Ressuspender as IELs em 5 ml de meio RPMI para o passo 3.15. </li><li> Para o isolamento dos linfócitos da lâmina própria (LPLs), mediu os fragmentos de tecido do intestino a partir do passo 3.4 em pequenos pedaços com uma tesoura (1 mm) e digerir os pedaços com 10 ml de tampão de digestão (0,05 g de colagenase, 0,05 g de ADNasel, e 0,3 g de dispase II em RPMI / FBS a 5%) durante 15-20 min a 37 ° C. </li><li> Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 uM. O sobrenadante de escoamento contém o LPL libertado. </li><li> Totalmente digerir os fragmentos do intestino, repetindo os passos 3,9-3,10 (normalmente, eles devem serrepetido 3 vezes). Cada vez, reunir os sobrenadantes contendo o LPLs. </li><li> Recolher as células por centrifugação durante 5 min a 1500 xg e a temperatura ambiente e ressuspender as pastilhas em RPMI / FBS a 5%. Passá-las através de um filtro de células 40 ^ m. </li><li> Ressuspender as células em peletes de 10 ml da fracção de 40% de um gradiente de meio de 40:80 de sílica coloidal e sobrepô-las em 5 ml da fracção de 80% em um tubo de 15 ml. </li><li> Realizar a separação por gradiente de densidade por centrifugação durante 20 min a 1500 xg e 15 temperatura ambiente. </li><li> Recolhe-se o LPLs, tal como descrito na etapa 3.7. Lavá-los uma vez com 10 ml de PBS e ressuspender as pastilhas em 1 ml de / 1% de FBS meio RPMI tampão ou PBS. </li><li> Contar as células viáveis ​​(tanto IELS e LPLs) usando de 0,4% trypan solução corante azul / PBS. </li></ol> 4. Expressão de IL-22-tdTomato na colite <ol><li> Preparar suspensões de células de baço de ratinhos individuais de IL-22-TdTomato a uma concentração de 1 x 10 &lt;sup&gt; 7 células / ml em PBS estéril, como descrito nos passos 2,1-2,4. </li><li> Purificar as células T CD4 + usando o mouse CD4 celular método de isolamento de 10 Negativos. Classificá-los com anti-CD4-APC (clone RM4-5, 0,5 ul / 1 x 10 6 células em PBS / 1% de tampão FBS) e anti-CD45RB com FITC (clone 16A, 0,5 mL / 1 x 10 6 células em PBS / 1% de tampão FBS) por incubação a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Rodar as células para baixo durante 5 min a 500 xg e 4 ° C. Lavam-se as células com 2 ml de tampão de PBS / 1% de FBS e ressuspender-los em 1 ml de tampão de coloração de FBS / PBS a 1%. </li><li> Executar as células T marcados numa máquina de citometria de fluxo 16. Portão as células em uma população de células T e classificar células duplamente positiva altas CD4 + CD45RB (o comprimento de onda detectado a 488 nm e 633 nm) lasers. </li><li> Colher as células separadas por centrifugação durante 5 minutos a 500 xg e 4 ° C. Ressuspender os sedimentos celulares em tampão PBS estéril a 1 x 10 6 </sup&gt; células / ml. Injetar as células (0,5 x 10 6) para o peritônio ofeach RAG1 - rato destinatário - /. </li><li> Sacrifício dos ratinhos receptores sob CO 2 em vários pontos de tempo. Colher os nódulos linfáticos mesentéricos e os intestinos grosso e delgado, conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2. Coloque cada nó de linfa mesentérica e corte-aberto intestino (papel / intestino / papel sanduíche) em paraformaldeído a 4% (PFA; lidar com sob um exaustor) durante a noite para reparar os tecidos. Substitua o PFA com 18% de sacarose durante 16-24 horas e depois congelar os tecidos para seccionamento. </li><li> Usar a máquina de criostato para cortar o tecido 17, 18, 19. Aquecer as secções de tecido para a temperatura ambiente durante cerca de 60 min e colocá-los em acetona durante 10 min à temperatura ambiente. Seca-se-lhes à temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min. </li><li> Adicionar FBS em excesso, removê-lo com uma pipeta e adicionar anti-RFP na proporção de 1: BSA 200 de diluição em 0,1% / 1x PBS. Incubar o anticorpo a 37 ° C durante 60 min. </li><li> Lavar as secções em PBS 1x durante 10 min e aplicar o anticorpo secundário correspondente (de cabra anti-coelho 568) para o tecido, diluído 1: 300 em 1% BSA / PBS 1x, durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas em 1x PBS por 10 min, limpe-os secar e adicione lamelas. </li><li> Visualize todas as amostras com um microscópio fluorescente sob iluminação consistente (RFP: filtro de excitação 540-580 nm) usando a objetiva de 40X. </li></ol>

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<li>Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75, 274-282 (1993).</li>
<li>Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+in+the+intestine%3A+a+balancing+act+between+effector+and+regulatory+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).</li>
<li>Ahlfors, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+fate+reporter+reveals+origin+and+control+of+IL-22+production+in+homeostasis+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection.</a> J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

IL-22 desempenha um papel essencial na inata defesa e tecido hospedeiro remodelação. IL-22 produtoras de células foram identificados ex vivo por coloração intracelular. No entanto, continua a ser difícil de controlar a expressão de IL-22 in situ, quer no seu estado normal ou em condições inflamatórias. Este protocolo descreve um novo método para desenvolver um modelo de ratinho repórter de IL-22, o que nos permite localizar as células que expressam o repórter in vivo. A codificação TdTomato ge...

expressão específica do tipo celular de genes repórter é útil para identificar as células que expressam activamente o alvo em tecidos sob estados homeostáticos e perturbados. Também permite a purificação destas células, que permanecem viáveis, para estudar as suas outras propriedades. Reporter ratinhos foram utilizados para elucidar o mecanismo de acção de citoquinas factores de transcrição específicos, e elementos reguladores. Estratégias anteriores 1, 2, 3, em grande medida invocado batendo o repórter para o locus alvo no cromossoma do rato, um procedimento demorado e dispendioso. Assim, um método mais simples para a geração de ratinhos repórter é desejável. Citocinas são uma classe ampla de pequenas proteínas excretadas / péptidos que regulam as respostas imunitárias através da sinalização intercelular. A interleucina 22 (IL-22) é uma citoquina com muitos relataram actividades, incluindo fu barreiranction, reparação de tecidos, e inflamação 4. Embora a IL-22 foi inicialmente descoberto como um produto de células T 5, relatórios subsequentes demonstraram a sua expressão em células assassinas naturais (NK) em seres humanos e ratinhos 6 7 e em outras classes de linfócitos inatas 8. Apesar de extensa observação da IL-produzindo-22 células, visualização de IL-22 estimulação exigido anteriormente ex vivo e permeabilização a manchas com anticorpos. Portanto, o romance IL-22 ratos repórter seria uma ferramenta muito útil para investigar a função da IL-22 nos processos homeostáticos e patogênicos. Aqui, nós desenvolvemos um modelo de ratinho transgénico repórter simplificado para observar as células IL-22 produtoras in vivo e in vitro. Usando um método TAS recombineering 9, que inserida a sequência de ADNc com poli A tdTomato fragmentos do sinal para a IL-22 locnós e substituído exão 1. As outras regiões, exons, e elementos reguladores não traduzidas não foram perturbado, uma vez que gostaria de imitar a regulação natural da IL-22, tanto quanto possível. O local de inserção repórter interrompe a sequência de sinal, resultando na acumulação do repórter no interior das células que produzem, ao contrário de IL-22 em si, que é rapidamente segregada. Este novo método também pode ser aplicado para a geração de ratinhos repórter de outras proteínas secretadas.

<table><tbody><tr><td>RP23-401E11 BAC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RPCI23. C</td><td>Precisa de ID do gene: 50929</td></tr><tr><td>NucleoBond BAC 100</td><td>Takara Clontech</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790020</td><td></td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10855-001</td><td>1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Extrato de Levedura, 5 g de cloreto de sódio&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-rato CD3</td><td>eBioscience</td><td>11-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato CD4</td><td>eBioscience</td><td>17-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MCD4530</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato CD45RB</td><td>eBioscience</td><td>11-0455</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato RFP</td><td>Abcam Abcam</td><td>Ab62341</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175145</td><td>KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare life sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II (protease neutra, grau II)</td><td>Microscópio</td> de fluorescência invertida Roche <td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>IX70</td><td>Olympus</td><td></td><td>Pedir orçamento</td></tr><tr><td>Microscópio Nikon Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td>Pedir orçamento</td></tr><tr><td>Dynal shaker</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>61050-10</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Pedir orçamento</td></tr><tr><td>LSRII SORP/citometria de fluxo</td><td>Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td></td><td>Pedir orçamento</td></tr></tbody></table>

visualização de il-expressando-22 linfócitos usando ratos repórter

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

ratinhos repórter têm sido amplamente utilizados para se observar a localização da expressão de genes alvo. Este protocolo centra-se em uma estratégia para estabelecer um novo modelo de rato transgénico repórter. Escolhemos para visualizar a expressão do gene interleucina (IL) 22 porque esta citoquina tem actividades importantes no intestino, onde contribui para a reparação de tecidos danificados por inflamação. Sistemas repórter oferecem vantagens consideráveis sobre outros métodos de identificação de produtos in vivo. No caso de IL-22, outros estudos havia células a partir de tecidos isolado pela primeira vez e, em seguida, re-estimularam as células in vitro. IL-22, que é normalmente secretada, foi aprisionado no interior das células utilizando um medicamento, e coloração intracelular foi usada para visualizar. Este método identifica células capazes de produzir IL-22, mas não determinar se eles estavam fazendo isso in vivo. O design repórter inclui a inserção de um gene para uma proteína fluorescente (tdTomato) para o gene de IL-22 de tal waY que a proteína fluorescente não pode ser segregada e, portanto, permanece preso no interior das células que produzem in vivo. Produtores fluorescentes podem então ser visualizado em secções de tecidos ou por meio de análise ex vivo através de citometria de fluxo. O processo de construção efectiva para o repórter incluídos recombineering um cromossoma artificial bacteriano que continha o gene de IL-22. Este cromossoma manipulado foi então introduzido no genoma do rato. Homeostático de IL-22 de expressão de repórter foi observada em diferentes tecidos de rato, incluindo o baço, timo, nódulos linfáticos, placas de Peyer, e no intestino, por análise de citometria de fluxo. A colite foi induzida por células T (CD4 + CD45RBhigh) de transferência, e expressão repórter foi visualizado. As células T positivas foram pela primeira vez presente nos linfonodos mesentéricos, e então eles acumulada no interior da lâmina própria das distais pequenos tecidos do intestino e cólon. A estratégia utilizando BACs deu expressão repórter boa fidelidade em relação a IL-22 expression, e é mais simples do que os procedimentos knock-in.

Um murino IL-22 do transgene repórter foi criada usando recombineering para modificar um cromossoma artificial bacteriano transportando o locus de IL-22. A Figura 1 mostra um diagrama de vector contendo o gene de pBACe3.6 sacBII, um marcador de selecção positiva, e o gene de resistência ao cloranf enicol antibiótico 11. Após a introdução tdTomato ao exão 1, a sequência do péptido de sinal foi interrompido, tal como mostrado na Fig...

Descrevemos aqui um modelo de camundongo repórter transgênico para visualizar as células produtoras de IL-22 dentro de diferentes tecidos de camundongos. Este método pode ser usado para rastrear a localização de outras citocinas ou proteínas secretas no camundongo.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

O objetivo geral deste procedimento de modificação genética de camundongos é identificar, purificar e caracterizar células imunes produtoras de IL-22. As células do sistema imunológico liberam mediadores chamados citocinas, que são responsáveis por nos defender contra agentes estranhos como bactérias e restaurar tecidos danificados. A IL-22 é uma dessas citocinas e tem sido atribuída a muitas atividades, desde o reparo tecidual até a patologia.E vários tipos diferentes de células no sistema imunológico foram relatados como capazes de produzi-lo. Então, para esclarecer quais células realmente produzem IL-22, desenvolvemos um novo camundongo repórter de IL-22. Isso nos permitiu identificar produtores relevantes de IL-22 in vivo em camundongos em condições normais e em um modelo de doença inflamatória intestinal.Também usamos células repórter para purificar os expressores de IL-22 para determinar suas outras propriedades. O método de geração de camundongos repórteres é brevemente delineado e os métodos de análise são descritos. Os métodos descritos podem ser aplicados a outros genes para fins de identificação dos expressores e purificação de células expressivas viáveis para posterior

visualization-of-il-22-expressing-lymphocytes-using-reporter-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este procedimento descreve a detecção e isolamento de leucócitos do mouse TH17 que ativamente secretam IL-17 com a estimulação.

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

A imagem intravital estável de alta resolução de células imunes no fígado é um desafio. Aqui, fornecemos um método altamente sensível e confiável para estudar a migração e as interações célula-célula de células imunes no fígado de camundongo por longos períodos (cerca de 6 horas) por microscopia de varredura a laser multifotônica intravital em combinação com monitoramento de terapia intensiva.

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

O método aqui descrito permite a visualização da ativação da inflamação dependente do promotor de IL-8 nos pulmões de camundongos através de imagem de bioluminescência não-invasiva (BLI). O mesmo animal pode ser submetido a BLI várias vezes por até dois meses a partir do momento da entrega da construção repórter de luciferase.

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Este protocolo descreve a quantificação de alvos múltiplos de citocinas simultaneamente em sobrenadantes de cultura de tecidos coletados de rato estimulada splenocytes usando multiplex do grânulo imunoensaio baseado em plataforma e um citômetro de fluxo.

Multiplexar Cytokine perfilação de Mouse estimulada Splenocytes usando uma plataforma baseada em Cytometric Bead imunoensaio

Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Aqui, nós descrevemos um método confocal simples da imagem latente para visualizar a localização in situ das pilhas que secretoras a gama do interferon do citocinas em órgãos lymphoid secundários murino. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de outras citocinas em diversos tecidos.

Imagem latente da produção in situ da gama do interferon no spleen do rato depois da infecção dos monocytogenes de Listeria

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

As células T e ILC2 que expressam IL-9 são induzidas durante a infecção por N. brasiliensis , mas sua caracterização tem sido amplamente negligenciada no intestino infectado devido à sua baixa frequência e cinética diferencial. Este protocolo descreve o isolamento dessas células de diferentes órgãos-alvo e a confirmação de sua identidade via citometria de fluxo em diferentes estágios de infecção.

Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis

Descrevemos um método para utilizar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de camundongos por meio de citometria de fluxo para transferência de células adotivas. Este protocolo tem como objetivo verificar a citotoxicidade específica de TILs contra tumores em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico, fornecendo informações sobre o desenvolvimento de terapias celulares adotivas para câncer de pâncreas.

Isolamento baseado em citometria de fluxo e avaliação terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor em um modelo de câncer de pâncreas em camundongo

Aprenda a visualizar linfócitos produtores de IL-22 em tecidos de camundongos usando um modelo transgênico repórter. Este método permite rastrear citocinas in vivo e estudar respostas imunes em doenças inflamatórias intestinais.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

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