Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

O objetivo geral deste procedimento de modificação genética de camundongos é identificar, purificar e caracterizar células imunes produtoras de IL-22. As células do sistema imunológico liberam mediadores chamados citocinas, que são responsáveis por nos defender contra agentes estranhos como bactérias e restaurar tecidos danificados. A IL-22 é uma dessas citocinas e tem sido atribuída a muitas atividades, desde o reparo tecidual até a patologia.

E vários tipos diferentes de células no sistema imunológico foram relatados como capazes de produzi-lo. Então, para esclarecer quais células realmente produzem IL-22, desenvolvemos um novo camundongo repórter de IL-22. Isso nos permitiu identificar produtores relevantes de IL-22 in vivo em camundongos em condições normais e em um modelo de doença inflamatória intestinal.

Também usamos células repórter para purificar os expressores de IL-22 para determinar suas outras propriedades. O método de geração de camundongos repórteres é brevemente delineado e os métodos de análise são descritos. Os métodos descritos podem ser aplicados a outros genes para fins de identificação dos expressores e purificação de células expressivas viáveis para posterior caracterização.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia sobre as atividades biológicas da IL-22 e as propriedades das células que a produzem. Demonstrando o procedimento comigo estarão Julie Hixon, bióloga, Caroline Andrews, pós-doutoranda, e Wenqing Li, cientista da equipe, todos do laboratório do Dr. Durham. Depois de inserir o gene repórter tdTomato em um vetor de transporte, substituindo o gene GFP no mesmo local, use o cromossomo artificial bacteriano apropriado ou o modelo BAC para amplificar as caixas de homologia A e B para o primeiro éxon traduzido de IL-22 em um sistema de reação de PCR de 50 microlitros.

Em seguida, transforme os vetores purificados em células bacterianas competentes para BAC em placas de ágar Luria-Bertani ou LB contendo cloranfenicol e ampicilina a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, inocular duas a três colônias em um mililitro de caldo LB, suplementado com cloranfenicol a 37 graus Celsius e 225 rpm. Após uma hora, espalhe 100 microlitros de cada mistura em uma placa de ágar LB suplementada com cloranfenicol e sacarose para uma cultura noturna a 37 graus Celsius.

Na manhã seguinte, coloque novamente as colônias grandes em uma nova placa de ágar LB com cloranfenicol e as pequenas colônias em outra placa de ágar LB e exponha as placas à luz ultravioleta por 30 segundos. Em seguida, selecione uma colônia sensível aos raios UV e use um primer heterozigoto tdTomato IL-22 para confirmar a presença do DNA BAC modificado por PCR. Depois de remover o baço e o timo, use uma pinça de dissecção serrilhada de ponta fina para colher os linfonodos mesentéricos brancos perolados próximos à parede do intestino delgado.

Em seguida, remova todo o intestino delgado e cólon e use uma tesoura para extrair as manchas ovais de Peyer estendidas ao longo do intestino. Quando todos os tecidos linfáticos tiverem sido coletados, triture os linfonodos mesentéricos e as placas de Peyer entre duas lâminas foscas em PBS suplementadas com FBS em gelo. Depois de gerar suspensões individuais de células únicas do baço e do timo da mesma maneira, centrifugue as células do baço seguidas da lise de glóbulos vermelhos esplênicos com um mililitro de tampões de lise ACK baço.

Após um minuto, restaurar a isotonicidade com nove mililitros de PBS e centrifugar novamente as células. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS e filtre as células através de um filtro de células de 100 mícrons. Em seguida, recolher as células por outra centrifugação, ressuspendendo o pellet em cinco mililitros de meio RPI para enumeração por exclusão de azul de tripano.

Depois de colher o intestino delgado do duodeno para o íleo, juntamente com todo o cólon, use uma pinça para remover o tecido adiposo e mesentérico extra do intestino e coloque imediatamente o tecido intestinal em PBS gelado. Use uma pinça para colher as manchas de Peyer ao longo da região distal do intestino delgado. Em seguida, use uma tesoura para abrir o intestino longitudinalmente e lave bem o tecido com 10 mililitros de PBS gelado.

Transfira a amostra para 20 mililitros de tampão pré-digestão por duas incubações de 30 minutos a 37 graus Celsius e 50 rpm em um agitador, agitando o tecido por 30 segundos a 12.000 rpm e pressionando todos os fragmentos através de um filtro de células de 100 mícrons no final de cada incubação para coletar a camada de células epiteliais. Em seguida, adicione 20 mililitros de solução fresca de EDTA à pasta celular por mais 30 minutos de incubação com agitação a 37 graus Celsius, filtrando e resfriando as células epiteliais intestinais no final da incubação, conforme demonstrado. Coloque os fragmentos intestinais restantes no gelo e colete as células epiteliais intestinais agrupadas por centrifugação, seguida de uma lavagem em 10 mililitros de HBSS suplementado com FBS.

Ressuspenda o pellet lavado em oito mililitros de meio de sílica coloidal a 44% e cubra a suspensão celular com cinco mililitros de meio de sílica coloidal a 67%. Separe as células por centrifugação e use uma pipeta de um mililitro para remover os cinco mililitros superiores do meio de separação de células. Em seguida, colete as células na interface e lave as células epiteliais intestinais em 10 mililitros de meio RPMI, ressuspendendo o pellet em cinco mililitros de RPMI fresco.

Depois de preparar suspensões únicas de células do baço de camundongos IL-22 td-Tomato, como acabamos de demonstrar. Ressuspenda as células em uma concentração de uma vez 10 elevado à sétima células por mililitro em PBS estéril e use o método de isolamento negativo de células CD4 de camundongo para purificar as células T CD4 positivas. Em seguida, rotule as células T com anticorpos anti-CD4 e anti-CD45RB por 30 minutos a quatro graus Celsius.

No final da incubação, colete as células por centrifugação seguida de uma lavagem em dois mililitros de PBS suplementado com FBS. Ressuspenda o pellet lavado em um mililitro de PBS e FBS frescos e classifique as células T marcadas por citometria de fluxo por sua coexpressão CD4 e CD45RB. Quando todas as células tiverem sido separadas, colete-as por centrifugação e ressuspenda o pellet em uma concentração de um vezes 10 a seis células por mililitro em PBS estéril para injeção das células em receptores de camundongos knockout RAG1.

Para criar o transgene repórter murino de IL-22, a recombinação foi usada para modificar um cromossomo artificial bacteriano que carrega o gafanhoto IL-22 que também contém um marcador de seleção positivo e um gene de resistência a antibióticos cloranfenicol. Após a introdução do tdTomato no exon1, a sequência do peptídeo sinal foi interrompida, aprisionando o repórter tdTomato dentro das células que expressam IL-22 e permitindo sua detecção e isolamento por citometria de fluxo. Para testar a fidelidade dos repórteres de IL-22, os esplenócitos gerados in vitro podem ser cultivados em condições Th22 ou neutras com a expressão de IL-22 tdTomato aparente por citometria de fluxo e microscopia fluorescente.

In vivo, os repórteres de IL-22 detectaram em diferentes tecidos de camundongos sob condições homeostáticas com a maior parte do sinal observado nas células da lâmina própria do intestino, mas não no linfonodo axilar, baço ou timo. Em um modelo de colite de camundongo induzida pela transferência de células T altas CD4RB CD4RB positivas repórter para camundongos knockout RAG1, os repórteres tdTomato são visualizados pela primeira vez nos linfonodos mesentéricos, mas seu eventual acúmulo na lâmina própria do intestino delgado distal e tecidos do cólon. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de escolher o clone BAC correto.

Após este procedimento, outros métodos, como o estabelecimento de modelos de infecção pulmonar ou cutânea, podem ser realizados usando este camundongo repórter para responder a perguntas adicionais sobre o papel da IL-22 na defesa do hospedeiro e no reparo tecidual. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem a função das proteínas secretadas que demonstram uma baixa expressão usando um modelo de camundongo como este. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar um camundongo repórter transgênico e identificar genes repórter de IL-22 in vitro e in vivo.