A técnica de rim perfundidos rato isolado

O objetivo geral deste protocolo é analisar a função renal isolada em um rim de camundongo perfundido ex vivo. Excluindo a influência da pressão arterial, hormônios ou sistema nervoso autônomo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave da Nefrologia.

Dando dentro da função de órgão isolado e servindo como uma ferramenta elegante para estudar a lesão renal aguda. A principal vantagem do IPK é que a função do órgão é estudada na ausência de influências sistêmicas. Depois de preparar o camundongo para a cirurgia, usando uma tesoura, faça uma laparotomia média da crista púbica até o esterno.

Primeiro abra a pele e depois os músculos abdominais. Em seguida, remova os intestinos e coloque-os no lado esquerdo do mouse, lateral do abdômen. Agora, libere a bexiga do tecido conjuntivo e exponha os ureteres e a uretra.

Para esses procedimentos, coloque todas as ligaduras usando suturas 5-0. A primeira ligadura a ser colocada é ao redor do ureter esquerdo. Feche bem com um nó cirúrgico duplo.

Em seguida, coloque uma ligadura ao redor da uretra usando a mesma técnica. Em seguida, coloque uma ligadura de laço ao redor de toda a bexiga, mas deixe-a desamarrada. Com as três primeiras suturas no lugar, use uma tesoura de olho para fazer uma incisão de um milímetro de comprimento na bexiga.

Nesta incisão, coloque uma cânula feita de dois centímetros de tubo PE-50. Agora feche a ligadura que laça a bexiga, prendendo a cânula. Com a bexiga canulada, agora corte o ureter esquerdo e a uretra distal das ligaduras.

A bexiga agora deve estar presa apenas ao ureter direito e deve se mover livremente. Em seguida, remova os tecidos conjuntivos e a gordura ao redor da aorta abdominal. Em seguida, coloque ligaduras ao redor do ponto médio da aorta exposta e logo abaixo do diafragma entre a artéria mesentérica superior e o tronco celíaco.

Mantenha cada um deles solto também. Em seguida, coloque uma ligadura ao redor da artéria mesentérica superior. Agora, coloque uma terceira ligadura ao redor da aorta diretamente abaixo da artéria renal direita e acima da artéria renal esquerda.

Esta é a ligadura número sete. Por fim, coloque uma ligadura ao redor do pacote da veia caudal. Agora coloque uma pinça entre a ligadura número sete e a ramificação da artéria renal esquerda.

Em seguida, faça uma pequena incisão na aorta, caudal à ligadura sete, tomando cuidado para não cortar a parede dorsal e esticar a abertura com um dilatador de vaso. Na abertura, insira uma cânula PE-50 puxada de dois centímetros, empurrando a ponta apenas para dentro da braçadeira. Em seguida, abra o clamp.

Em seguida, empurre a ponta da agulha cranialmente até atingir a junção da artéria renal direita e a aorta. Agora feche a ligadura sete e, em seguida, feche a ligadura no ponto médio da aorta abdominal. Prossiga abrindo o baú com uma tesoura dissecando o diafragma.

Em seguida, com um único corte, separe a aorta, a veia cava, o coração e os nervos vegetativos. Agora, inicie o controle de pressão da bomba de perfusão e mantenha a pressão média entre 80 e 100 milímetros de mercúrio. Agora, feche as três ligaduras desatadas restantes ao redor do pacote da aorta e da veia caudal.

Usando uma tesoura, libere o rim direito do tecido conjuntivo circundante e libere-o da cápsula adiposa. Corte a aorta proximalmente à ligadura entre a artéria mesentérica superior e o tronco celíaco. Em seguida, corte a artéria mesentérica superior distalmente à ligadura ao redor da artéria mesentérica superior.

Agora, remova o feixe de vasos de suporte renal, tomando cuidado para não cortar os próprios vasos. Em seguida, corte o fígado na conexão com o rim, mas deixe uma pequena parte do fígado presa a ele, de modo que a veia cava seja mantida aberta por ele. O próximo passo é remover o feixe de rim do mouse.

Agora, deixe o rim na câmara e remova o mouse. Na conexão entre o fígado e o rim, coloque uma ligadura de laço. Em seguida, canule a veia cava com uma linha venosa e feche a ligadura do laço.

O rim agora deve ficar estável na caixa. O fluxo venoso através da linha venosa deve começar imediatamente. O fluxo de urina começará após aproximadamente três minutos.

O peristaltismo do ureter deve começar imediatamente e permanecer estável por pelo menos uma hora. Feche a caixa. A preparação está concluída e deve permanecer viável por pelo menos uma hora.

Após o uso do método descrito em camundongos C57 black 6, a viabilidade tecidual de quatro rins foi testada após uma hora de perfusão contínua. A pressão foi mantida em 100 milímetros contínuos de mercúrio. O fluxo de perfusato e a resistência vascular permaneceram estáveis em todos os quatro rins.

A taxa de filtração glomerular foi avaliada usando a depuração de inulina FITC destinada a aumentar com o tempo, mas não significativamente. A excreção fracionada de sódio e potássio foi avaliada após 55 minutos de perfusão. Esses parâmetros aumentaram em comparação com a situação in vivo.

Após 55 minutos, a molalidade dos mictórios não se elevou acima da osmolalidade do fluxo venoso. Os rins foram então fixados e sua ultraestrutura foi avaliada com ETM. Os glomérulos nos segmentos S1 dos túbulos proximais pareciam praticamente inalterados.

Alguns, mas não todos os segmentos S2, S3 dos túbulos proximais nos membros ascendentes espessos que não estavam próximos aos feixes vasculares mostraram sinais de danos aos órgãos. Após uma inspeção mais detalhada, os túbulos contorcidos distais e os ductos coletores não mostraram sinais de necrose. No geral, os rins espelharam o que é relatado para rins perfundidos isolados de ratos.

Após este procedimento, métodos de análise como imagem ou fatos seguidos de análise de proteínas ou RNA podem ser realizados no tecido para obter mais informações.