Name: A técnica de rim perfundidos rato isolado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a técnica de rim perfundido isolado de rato para estudar função renal ex vivo sem influências sistêmicas. Este método permite investigar lesão renal aguda em nefrologia por uma hora.

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Os autores gostariam de agradecer a Hans-Joachim Schurek pelos inestimáveis conselhos científicos. Os autores gostariam de agradecer a Monique Carrel e Michèle Heidemeyer pela excelente assistência técnica, David Penton Ribas e Nourdine Faresse pela leitura crítica do manuscrito e a Carsten Wagner e Jürg Biber pelo anticorpo NaPi-2a. Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional Suíço de Competência em Pesquisa "Kidney.CH" e por uma bolsa de projeto (310030_143929/1) da Fundação Nacional de Ciência da Suíça.

Todos os procedimentos que envolvem animais descritos neste manuscrito foram conduzidos de acordo com a lei suíça e aprovado pela administração veterinária do Cantão de Zurique, Suíça. 1. Preparação Tampão <ol><li> Preparar soluções 1 - 4 e a solução de hormônio antidiurético (ADH) (Tabela 1). </li><li> Prepara-se o tampão de diálise (Tabela 1). NOTA: Este é o tampão utilizado como o tampão de diálise durante a perfusão. Mais tarde, os eritrócitos serão diluídas neste tampão para formar o perfusato final. </li><li> preparação de eritrócitos. <ol><li> Dilui-se 250 ml de concentrado de eritrócitos humana (material testado obtido a partir do banco de sangue local) para 500 ml com tampão de diálise. Centrifugar a 2000 xg durante 8 minutos. Remover o tampão, tomando cuidado para não remover quaisquer eritrócitos. 3x. </li></ol></li><li> Prepara-se o (albumina de soro de bovino; BSA) de albumina de tampão. <ol><li> Em 200 ml de dialysitampão s, dissolver 44 g de BSA usando uma barra de agitação. Filtra-se a solução com papel de filtro. </li></ol></li><li> Prepara-se o perfusado. <ol><li> Filtrar os eritrócitos a partir do passo 1.3.1 através de papel de filtro para o tampão de BSA. Encha até um volume total de 800 ml com tampão de diálise. NOTA: Este é o perfusato final. O hematócrito agora deve situar-se entre 8 e 12%. O perfusato pode ser armazenado durante até 12 h a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Início de Diálise e Oxigenação <ol><li> Ligar o banho de água em torno do reservatório maior tampão, menor do reservatório tampão, e a câmara de humidade (uma pequena câmara, de parede dupla trazida a 37 ° C e 100% de humidade para realizar mais tarde, o rim) a 37 ° C (Figura 2) . </li><li> Encher o reservatório de tampão de maior com o tampão de diálise e o reservatório menor com o perfusato. </li><li> Ligue a 5% de CO 2/95% O 2 afluxo de gás para o tampão de diálise. </li><li> Ligar diálise contínua do perfusado contra o tampão de diálise. Tome o cuidado de usar tubos de diálise baixo fluxo. Vá para a Etapa 3. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Figura 2: Desenho esquemático do circuito de perfusão. Esquema mostra os principais componentes do circuito de perfusão e a direcção do fluxo tampão. Todos os componentes rodeados por azul escuro são mantidos a 37 ° C com um banho de água / termostato. 1: tampão de diálise de pelo menos 3 vezes o volume de tampão de perfusão é continuamente borbulhada com 95% de O2 / 5% de CO 2. 2: tampão de diálise e tampão de perfusão são continuamente dialisada contra o outro num tubo de diálise por uma bomba de rolos. 3: througho constante Devido a esta diálise, o tampão de perfusão é enriquecida com 9% de O2 / 5% de CO 2 e de electrólitos são mantidos níveisperfusão ut. 4: Uma bomba de cilindro impele o tampão de perfusão para o rim. 5: Uma Windkessel remove as ondas peristálticas e funciona como uma armadilha de bolhas. 6: transdutor de pressão (ligados a 4. (bomba de roletes) para manter a pressão contínua, permitindo o fluxo alternando livremente). 7: Durante a perfusão, o rim permanece numa câmara húmida para 100% de humidade atmosférica e 37 ° C Temperatura de rim. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 3. Cirúrgica Procedimento Parte 1 (para um diagrama de todas as ligaduras, consulte a Figura 3) Nota: Executar todas as ligaduras usando 5-0 fio cirúrgico. <ol><li> Anestesiar um rato por injecção intraperitoneal (10 mL / g de peso corporal, de 20 mg / ml de cetamina e 1 mg / ml de xilazina dissolvido em 0,9% de NaCl). Confirmar profundidade suficiente de AnesthAIAS por testar a ausência de reflexos traseira pés. </li><li> Corrigir o rato em decúbito dorsal na câmara húmida. Proteger os olhos com pomada veterinário. Coloque uma seringa de 1 ml abaixo da coluna vertebral para elevar os vasos lombares. </li><li> Realizar uma laparotomia mediana da crista púbica para a abertura do esterno primeira a pele, em seguida, os músculos abdominais, com uma tesoura. </li><li> Remover o intestino e colocá-lo no lado esquerdo da lateral do mouse a partir do abdômen. </li><li> Libertar a bexiga de tecido conjuntivo e explorar ambos os ureteres e uretra. </li><li> Coloque uma ligadura em torno do ureter esquerdo (ligadura I). Fecha-o. </li><li> Colocar uma ligadura em torno da uretra (ligadura II). Fecha-o. </li><li> Coloque um &quot;laço&quot; ligadura em torno de toda a bexiga (ligadura III). </li><li> Faça uma incisão na bexiga 1 mm. </li><li> Canular a abertura com dois centímetros PE 50 tubos. </li><li> Fechar ligadura III em torno do tubo. </li><li> Cortar o uréter esquerdo e uretra distai das ligaduras. o bladder agora está ligado ao ureter direito apenas e movimentando-se livremente. </li><li> Desmarque a aorta abdominal de tecido conjuntivo e gordura. </li><li> Coloque uma ligadura meados de aorta abdominal (ligadura IV). </li><li> Colocar uma ligadura em torno da aorta abaixo do diafragma entre a artéria mesentérica superior e o tronco celíaca (V ligadura). </li><li> Colocar uma ligadura à volta da artéria mesentérica superior (VI ligadura). </li><li> Coloque uma ligadura da aorta imediatamente abaixo do direito e acima da artéria renal esquerda (VII ligadura). </li><li> Coloque uma ligadura em torno do pacote de caudal veia (veia) (VIII ligadura). Vá para a Etapa 4. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Figura 3: Desenho esquemático das ligaduras colocadas durante a cirurgia. Vista do abdómen aberto após a laparotomia. O intestino é movido para fora para a esquerda. L e R indicam o rim esquerdo eo direito. olinhas pretas mostram a área da respectiva laqueação. Ligaduras primeira colocação e depois fechada, na sequência indicada no texto. X marca a localização da incisão para canulação da aorta. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 4. Priming do circuito de perfusão <ol><li> Inicie a bomba rotativa e encher o tubo com perfusato. Tome cuidado para esvaziar todas as bolhas de ar. </li><li> Encha o dispositivo Windkessel a cerca de nível médio com perfusato. </li><li> Calibra-se o transdutor de pressão até 0 mm de Hg quando toda a tubagem é cheio e o fluxo é 0. Manter a agulha de perfusão, a nível renal durante este tempo. </li><li> Manter o fluxo em um nível mínimo constante (0,6 ml / min) e vá para a Etapa 5. </li></ol> 5. Surgical Procedimento Parte 2 <ol><li> Coloque um grampo entre ligadura IV ea ramificação da rena esquerdal artéria. </li><li> Faça uma pequena incisão no caudal aorta de ligadura IV, tomando cuidado para não cortar a parede dorsal. </li><li> Dilatar a abertura da aorta com um vaso dilatador. </li><li> Canular a aorta, com uma agulha (2 cm de comprimento, puxado PE 50), empurrando a ponta apenas para o grampo. </li><li> Abra o grampo. </li><li> Empurrar a ponta da agulha cranialmente até atingir a junção da artéria renal direita e da aorta. </li><li> Fechar ligadura VII. </li><li> Fechar ligadura IV. </li><li> Abra o peito com uma tesoura dissecando o diafragma. Com um único corte, separe a aorta, a veia cava, coração e nervos vegetativos. Com este passo, o animal foi sacrificado através de exsanguinação sob anestesia profunda rápida contínua. </li><li> Iniciar o controle da pressão da bomba de perfusão. Manter a pressão média entre 80 e 100 mmHg. </li><li> Fechar V. ligadura </li><li> Fechar ligadura VI. </li><li> Fechar ligadura VIII. </li><li> Livre do rim direito de tissu conjuntivoe e sua incorporação na cápsula adiposo com uma tesoura. </li><li> Corte a aorta proximal à ligadura V. </li><li> Corte da artéria mesentérica superior distalmente à ligadura VI. </li><li> Cortar o feixe vascular-sustentável rim para fora, tomando cuidado para não cortar os próprios vasos. </li><li> Cortar o fígado na ligação para o rim. Cuidar para libertar o rim, mas deixa uma pequena parte do aderente fígado a ele, de modo que a veia cava é mantida aberta por ela. </li><li> Pegue o pacote de rim para fora do mouse. Remover o rato da câmara úmida. </li><li> Coloque um &quot;laço&quot; ligadura à volta da ligação de fígado e rim (IX ligadura). </li><li> Canular a veia cava com uma linha venosa (dois centímetros PE 50). </li><li> Fechar ligadura IX. fluxo venoso através do cateter venoso deve começar imediatamente. </li><li> Feche a câmara úmida. </li></ol> 6. As análises a jusante <ol><li> Durante a hora seguinte, monitorar continuamente o fluxo sanguíneo e intravasculpressão de ar 15. Recolhe fluxo venoso, que pode ser utilizado para análise de, por exemplo, a libertação de renina renal 7. Coleta de urina para análise da concentração de eletrólitos e taxa de filtração glomerular 14. Após 1 hora de perfusão, os rins podem ser snap-congelados por western blot ou ser fixado para a imagem latente aproxima 16. </li></ol>

<ol><li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrel%2C+A+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 81 (2112), 621-623 (1935).</li>
<li>Skutul, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkutul%2C+K+%22%C3%9Cber+Durchstr%C3%B6mungsapparate+Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22">Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv</a>. 123 (4-6), 249-273 (1908).</li>
<li>Nizet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+kidney%3A+possibilities%2C+limitations+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results.</a> Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).</li>
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<li>Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost%2C+small+volume+circuit+for+autologous+blood+normothermic+perfusion+of+rabbit+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Art+Org%22%5BJournal%5D)">A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs.</a> Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).</li>
<li>Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+Ex+Vivo+Kidney+Perfusion+for+the+Preservation+of+Kidney+Grafts+prior+to+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation.</a> J Vis Exp. (101), e52909(2015).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSong%2C+JJ+%22Nature+Med%22">Nature Med</a>. 19 (5), 646-651 (2013).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22JASN%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+IPK%3A+A+Powerful+Tool+to+Partially+Characterize+Renal+Reperfusion+and+Preservation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Transplant+J%22%5BJournal%5D)">Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury.</a> Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).</li>
<li>Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin40+is+essential+for+the+pressure+control+of+renin+synthesis+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion.</a> Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).</li>
<li>Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mineralocorticoid+receptor+%28MR%29+regulates+ENaC+but+not+NCC+in+mice+with+random+MR+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22%5BJournal%5D)">The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion.</a> Pflüger's Archiv. , (2016).</li>
<li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+kidney+slices+%28PCKS%29+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li>
<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes e nada mais a divulgar.

O mouse rim isolado perfundido é uma ferramenta para o estudo da função renal em um ambiente controlado ex vivo, durante 1 hora, fazendo a ponte entre experiências in vivo em animais intactos, o que pode ser falho pelo impacto de vários fatores sistêmicos e experimentos in vitro em segmentos dos néfrons isolados ou células cultivadas, o que necessariamente negligenciam o impacto da estrutura de órgãos intactos na função. Há, ao conhecimento dos autores, nenhuma técnica alternativa com a qual p...

A perfusão isolada de órgãos tem sido objecto de um esforço contínuo entre os fisiologistas por muitas décadas 1. A técnica permite que a função do órgão, sem influências sistêmicas, tais como pressão arterial, hormônios ou nervos, a ser estudado. Carl Eduard Loebell é considerado para ser o primeiro a ter descrito a perfusão bem sucedida de um rim isolado, em 1849 2. Desde então, o aparelho de perfusão foi submetido refinamento significativa. Frey e Gruber introduzido um pulmão artificial para bombas de oxigenação e pulsátil para perfusão contínua 2. Enquanto os primeiros pesquisadores estudaram principalmente os rins de mamíferos de grande porte, ou seja, porcos e cães 2 3 -o primeiro relatório do uso de rins de ratos, por Weiss et al. , Foi um marco no estudo da perfusão-mamífero-órgão pequeno 4. Schurek et ai. relataram a necessidade de adição de eritrócitos de mamífero para o perfusato se tubular renal suficienteoxigenação deveria ser alcançado 5. Crítico para experiências a longo prazo foi a introdução de diálise contínua do tampão pelo mesmo grupo de pesquisa 6. Em 2003, Schweda et al. foram os primeiros a relatar um rim do rato funcional isolado perfundido (MIPK) 7, posteriormente refinado por Rahgozar et al. 18 e Lindell et ai. 14. Embora tecnicamente mais exigente do que o de rato perfundido isolado de rim, o uso do MIPK carrega a vantagem de permitir o uso de uma grande variedade de ratinhos geneticamente alterados. Este artigo apresenta os dados sobre o método dos autores para perfusão isolados de rato rins durante 1 h. O método permite a avaliação contínua da taxa renal fluxo, resistência vascular, liberação de hormônio, gasometria, análise de urina, bem como a aplicação de medicamentos. Seguindo o procedimento, rins podem ser processadas para análise molecular e bioquímica, ser fixo por microscopia, outransplantado para um rato receptor (Figura 1). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Figura 1: Visão geral do Possível entrada / saída para o rim isolado perfundido. BGA: Hemogasometria. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Esta técnica provavelmente vai receber uma atenção crescente nos próximos anos, como muitas aplicações inovadoras estão sendo discutidas com o alvorecer da perfusão renal normotérmica prolongado antes do transplante (com ou sem a aplicação de anti-rejeição ou drogas edição do genoma) 8, 9, 10 , 11, a bioengenharia dos rins inteiros de andaimes descelularizados 12, bem como a aplicação de doses elevadas de corantes fluorescentes para a imagem latente multiphoton 13 </sup&gt;. Também é um modelo ideal com o qual se estudar o papel de genes específicos durante a lesão renal aguda 14. Um protocolo de passo-a-passo é dado para permitir que outros laboratórios para realizar isolado rato perfusão renal com sucesso. Em primeiro lugar, a composição e preparação do buffer é especificado. Em seguida, a cirurgia é descrito em pormenor e os passos críticos são mostrados. Em terceiro lugar, os dados são apresentados que são representativos de uma preparação bem sucedida: o fluxo sanguíneo renal, resistência vascular, taxa de filtração glomerular, e eletrólitos fraccionada medições funcionais de viabilidade e eletrônica de transmissão micrografias da morfologia dos diferentes segmentos dos néfrons de Rins todos excreção- fixado após 1 hora de perfusão.

<table><tbody><tr><td><forte>Circuito de perfusão:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara úmida 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cânula com cesto e porta lateral</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Termostato TC120-ST5&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Bomba de rolos Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório encamisado para solução tampão 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório encamisado para solução tampão 0,5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor de Pressão APT300&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transdutor</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servo controlador</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>Aquisição de dados HSE-USB</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Dialisador de baixo fluxo Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE-Tubing para canulação da aorta 1,19 mm I.D. x 1,70 mm O.D.</td><td>Commodities Científicas Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes tampão:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sal monossódico de ácido L-glutâmico hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio de ácido L-(-) málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sódio-L-lactato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>sal de sódio de ácido alfa-cetoglutárico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Uréia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 6H2O&nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&euml; n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hormônio Antidiurético dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro usado para filtração de eritrócitos</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Análise:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiômetro Microscópio Eletrônico ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Médico:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a técnica de rim perfundidos rato isolado

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Este é um pré-requisito para o estudo da fisiologia do órgão isolado e para muitas aplicações inovadoras que possam ser possíveis no futuro, incluindo decellularization perfusão de bioengenharia nos rins ou a administração de anti-rejeição ou drogas edição do genoma em altas doses para preparar o rim para transplante. Durante o tempo da perfusão, o rim pode ser manipulada, a função renal pode ser avaliada, e vários produtos farmacêuticos administrados. Após o procedimento, o rim transplantado ou pode ser processado para a biologia molecular, bioquímica, ou microscopia. Este artigo descreve o perfusado e da técnica cirúrgica necessária para a perfusão ex-vivo de rins de rato. Os detalhes do aparelho de perfusão são dados e os dados são apresentados mostrando o vESPONSABILIDADE da preparação do rim: fluxo sangüíneo renal, resistência vascular, e urina dados como funcionais, micrografias eletrônicas de transmissão de diferentes segmentos dos néfrons como leituras morfológicas e Western blot de proteínas de transporte de diferentes segmentos dos néfrons como leitura molecular.

Com o método descrito, rins isolados do rato podem permanecer viáveis ​​durante pelo menos 1 h. Foi testada a viabilidade dos tecidos depois de 1 hora de perfusão contínua com funcional (fluxo sanguíneo renal e resistência vascular, gasometria do fluxo venoso, taxa de filtração glomerular, urinário fraccionada Na + e K + excreção, e osmolaridade urinária) e morfológico (eletrônica de transmissão microscopia, TEM) em quatro métodos rins de tipo selvagem C57BL / 6. Al...

O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Os tampões e técnica cirúrgica encontram-se descritos em pormenor.

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

O objetivo geral deste protocolo é analisar a função renal isolada em um rim de camundongo perfundido ex vivo. Excluindo a influência da pressão sanguínea, hormônios ou sistema nervoso autônomo. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave da Nefrologia.Fornecendo subsídios sobre a função de órgãos isolados e servindo como uma ferramenta elegante para estudar lesão renal aguda. A principal vantagem do IPK é que a função orgânica é estudada na ausência de influências sistêmicas. Após preparar o camundongo para cirurgia, usando tesoura, realize uma laparotomia média da crista púbica até o esterno.Primeiro, abra a pele e, em seguida, os músculos abdominais. Em seguida, remova os intestinos e coloque-os no lado esquerdo do camundongo, na posição lateral em relação ao abdômen. Agora, libere a bexiga do tecido conjuntivo e exponha ambos os ureteres e a uretra.Para esses procedimentos, posicione todas as ligaduras utilizando suturas 5-0. A primeira ligadura a ser colocada é ao redor do ureter esquerdo. Feche firmemente com um nó cirúrgico duplo.Em seguida, posicione uma ligadura ao redor da uretra utilizando a mesma técnica. Depois, coloque uma ligadura em laço ao redor de toda a bexiga, mas deixe-a desatada. Com os três primeiros pontos no lugar, use tesoura de olho para fazer uma incisão de um milímetro de comprimento na bexiga.Na incisão, posicione uma cânula feita de dois centímetros de tubo PE-50. Em seguida, feche o laço que prende a bexiga, fixando a cânula. Com a bexiga canulada, corte agora o ureter esquerdo e a uretra distalmente aos laços.A bexiga deve agora estar ligada apenas ao ureter direito e deve mover-se livremente. Em seguida, remova os tecidos conjuntivos e a gordura ao redor da aorta abdominal. Depois, coloque ligaduras ao redor do ponto médio da aorta exposta e logo abaixo do diafragma, entre a artéria mesentérica superior e o tronco celíaco.Mantenha cada um desses frouxos também. Em seguida, coloque uma ligadura ao redor da artéria mesentérica superior. Agora, coloque uma terceira ligadura ao redor da aorta diretamente abaixo da artéria renal direita e acima da artéria renal esquerda.Esta é a ligadura número sete. Finalmente, coloque uma ligadura ao redor do pacote da veia caudal. Agora posicione um clamp entre a ligadura número sete e o ramo da artéria renal esquerda.Em seguida, faça uma pequena incisão na aorta, caudal à ligadura sete, tomando cuidado para não cortar a parede dorsal e alargue a abertura com um dilatador de vasos. Na abertura, insira uma cânula PE-50 esticada de dois centímetros, empurrando a ponta até entrar ligeiramente na pinça. Em seguida, abra a pinça.Em seguida, avance a ponta da agulha cranialmente até alcançar a junção da artéria renal direita e a aorta. Agora feche a ligadura sete e, em seguida, feche a ligadura no ponto médio da aorta abdominal. Prossiga abrindo o tórax com tesoura, dissecando o diafragma.Então, com um único corte, separe a aorta, a veia cava, o coração e os nervos vegetativos. Agora, inicie o controle de pressão da bomba de perfusão e mantenha a pressão média entre 80 e 100 milímetros de mercúrio. Em seguida, feche as três ligaduras restantes ainda não amarradas ao redor do pacote da aorta e da veia caudal.Usando tesoura, solte o rim direito do tecido conjuntivo circundante e libere-o da cápsula adiposa. Corte a aorta proximalmente à ligadura entre a artéria mesentérica superior e o tronco celíaco. Em seguida, corte a artéria mesentérica superior distalmente à ligadura ao redor da artéria mesentérica superior.Agora, remova o feixe de vasos de suporte do rim, tomando cuidado para não cortar os próprios vasos. Em seguida, corte o fígado na conexão com o rim, mas deixe uma pequena parte do fígado aderida a ele, de modo que a veia cava permaneça aberta por sua sustentação. O próximo passo é remover o feixe renal do camundongo.Agora, deixe o rim na câmara e remova o camundongo. Na conexão entre o fígado e o rim, coloque uma ligadura de laço. Em seguida, canule a veia cava com uma linha venosa e feche a ligadura de laço.O rim agora deve estar estável na caixa. O fluxo venoso através da linha venosa deve iniciar imediatamente. O fluxo urinário iniciará após aproximadamente três minutos.A peristalse do ureter deve iniciar imediatamente e permanecer estável por pelo menos uma hora. Feche a caixa. O preparo está agora completo e deve permanecer viável por pelo menos uma hora.Após utilizar o método descrito em camundongos C57 black 6, a viabilidade tecidual de quatro rins foi testada após uma hora de perfusão contínua. A pressão foi mantida constantemente em 100 milímetros de mercúrio. O fluxo do perfusato e a resistência vascular permaneceram estáveis em todos os quatro rins.A taxa de filtração glomerular foi avaliada por meio da depuração de inulina marcada com FITC, que se destinava a aumentar ao longo do tempo, mas sem significância. A excreção fracionária de sódio e potássio foi avaliada após 55 minutos de perfusão. Esses parâmetros aumentaram em comparação com a situação in vivo.Após 55 minutos, a molalidade da urina não aumentou acima da osmolalidade do fluxo venoso. Os rins foram então fixados e sua ultraestrutura foi avaliada por MEV. Os glomérulos nos segmentos S1 dos túbulos proximais pareciam amplamente inalterados.Alguns, mas não todos, segmentos S2 e S3 dos túbulos proximais nas alças ascendentes espessas que não estavam próximos aos feixes vasculares apresentaram sinais de dano orgânico. Ao examinar mais atentamente, os túbulos contornados distais e os ductos coletores não mostraram sinais de necrose. De modo geral, os rins refletiram o que é relatado para rins isolados e perfundidos de rato.Após este procedimento, métodos de análise como imagens ou coleta de dados seguidos por análise de proteínas ou RNA podem ser realizados no tecido para obter informações adicionais.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um modelo murino precisa de lesão renal aguda (IRA) devido à isquemia é uma ferramenta importante para investigar lesão renal aguda e, eventualmente, encontrar ferramentas terapêuticas para tratar a lesão renal. O sistema de suspensão de peso oferece uma ferramenta para a oclusão da artéria renal imediata e confiável e reperfusão sem causar congestão renal.

Uso de um sistema de suspensão de peso para oclusão da artéria renal isolada

Neste vídeo, descrevemos o procedimento de extração renal do espaço retroperitoneal do camundongo. O rim extraído pode ainda ser microdissecado para obter um rim intacto sem cápsula renal e a camada de gordura circundante.

Extração de rim intacto de camundongo: uma técnica para obter rim sem cápsula renal de modelos murinos

Este vídeo descreve o método para isolar glomérulos intactos dos rins de camundongos. Os glomérulos encapsulados e descapsulados assim obtidos podem ser usados para a cultura de conseqüências de células epiteliais parietais do rim murino.

Isolamento de glomérulos: uma técnica para obter glomérulos intactos do rim murino

Descrevemos modelos de lesão renal por isquemia e reperfusão induzida moderada e grave em que os ratos submetidos a clampeamento do pedículo renal unilateral seguido de nefrectomia contralateral simultânea ou tardia, respectivamente. Estes modelos consistentemente dar origem a uma disfunção renal e fibrose pós-lesão, mas a gravidade da lesão e sobrevivência dependem de fundo, idade e equipamento cirúrgico mouse.

Isquemia-reperfusão modelo de lesão renal aguda e Pós Lesão fibrose em camundongos

Técnicas confiáveis e eficientes para o isolamento de células imunes renais são necessárias para aplicações a jusante. Isso requer a marcação de anticorpos de superfície de um pequeno número de células imunes renais. Aqui, descrevemos um método conciso para isolamento de células imunes renais que aparentemente atinge esse objetivo.

Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes

Este protocolo fornece uma abordagem econômica para isolar e caracterizar pilhas do rato primária renal tubular que podem posteriormente ser sub cultivadas para avaliar funções biológicas renal ex vivo, incluindo bioenergética mitocondrial.

Isolamento, caracterização e alto Throughput análise de fluxo extracelular de Mouse primária Renal Tubular as células epiteliais

Aqui nós apresentamos um protocolo para murino na vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular com biotina. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar endógena imunoprecipitação da proteína de interesse.

Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

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Este artigo apresenta um modelo isquêmico de DRC usando IRI renal unilateral com nefrectomia contralateral realizada um dia antes da coleta da amostra; esse protocolo permite avaliação funcional baseada em soro, alta sobrevivência e patologia reprodutível da DRC em 28 e 42 dias, proporcionando uma plataforma versátil para estudos mecanicistas e intervencionistas.

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Um sistema de imagem de contraste a laser foi utilizado para monitorar as mudanças no fluxo sanguíneo microvascular renal durante a isquemia-reperfusão unilateral renal após a resseção do rim direito em camundongos.

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A técnica de rim perfundidos rato isolado

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