Name: Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a preparar amostras com baixo número de células para análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Este método eficiente e reprodutível permite visualizar estruturas celulares em contexto fisiológico.

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Agradecemos ao Núcleo de Pesquisa em Patologia pela assistência nos estudos de análise de microscópio eletrônico no Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati. O trabalho foi apoiado pelo NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 ao MDF).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê de animais institucional a Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati. Para este estudo, as células estaminais hematopoiéticas foram isoladas a partir da medula óssea de ratinhos C57BL / 6 com idade consanguínea 2 - 4 meses. Separação de células utilizando FACS após coloração da BM com diferentes fabricantes de superfície, incluindo Linhagem, c-kit, Sca-1, Flt3 e CD34 foi utilizada para a purificação de HSC baseado em Lin Sca-1 + Flt3 c-kit + - estratégia gating - CD34 como protocolo padrão descrito anteriormente 8. CUIDADO: Vários produtos químicos altamente tóxicos são utilizados durante este procedimento. Estes são tóxico por inalação e contato com a pele. Por favor, use luvas e vestuário de protecção. Trabalhar no exaustor ao trabalhar com esses produtos químicos. 1. células, a fixação, coloração e Pré-incorporação <ol><li> Classificar 10.000 células-tronco hematopoéticas (usando Lin - Sca-1 <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating estratégia; LT-HSC população) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 600 ul de Iscove modificado por Dulbecco Médio (IMDM) com soro fetal bovino a 10%, utilizando FACS. </li><li> Girar HSCs ordenadas a 1.000 xg durante 10 min num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, utilizando uma centrífuga com baldes swing-out. Remova o meio por aspiração suave e deixar 200 ï¿½ de meio nos tubos em cada etapa. Nesta fase, o sedimento celular permanece invisível no tubo. </li><li> Fixar as células por adição de 0,2 ml de solução fixadora 2x à temperatura ambiente (TA) durante 1 h 1,9. <ol><li> Faça a solução fixadora fresco antes da utilização. Em 1x, a solução é composta por 3% de paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,1 M. </li></ol></li><li> Centrifugar as células a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C, utilizando uma centrífuga com baldes swing-out. </li><li> Lavar as células com 600 uL de tampão de 0,1 M de cacodilatousando centrifugação e deixar tampão 200 ul no tubo após centrifugação. </li><li> Corar as células fixadas pela adição de 200 ul de solução de 2 mg / ml de azul de Evans em tampão cacodilato e incubar durante 20 min à TA. As células serão de cor azul. </li><li> Lavar as células 3 vezes com 600 ul de tampão de cacodilato 0,1 M utilizando a centrifugação e deixar tampão 200 ul no tubo de cada vez. </li><li> Re-suspender as células em 200 ul de tampão e transferir a suspensão de células para um tubo de 0,5 ml. Centrifugar a 1.000 xg durante 10 min usando uma centrífuga de bancada. Remover tampão suavemente, sem perturbar o sedimento celular pequena agora visível, e deixar tampão 50 ul no tubo. </li><li> Adicionar 200 mg de baixo ponto de fusão de agarose a 5 ml de tampão de cacodilato 0,1 M no tubo de 15 ml de uma solução de agarose a 4%. Derreter a agarose por transferência do tubo de água fervente em uma garrafa de vidro de 100 ml e manter morno até ser utilizado. </li><li> Adicionar 200 mL de 4% baixo ponto de fusão agarose dissolvido em cacodyla 0,1 Mtampão TE para a suspensão de células em tubos de 0,5 ml e imediatamente centrifugar a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C usando uma centrífuga de bancada. </li><li> Depois de confirmar que as células sedimentadas no fundo do tubo de 0,5 ml em agarose semi-sólida após a centrifugação, transferir imediatamente o tubo a 4 ° C ou de gelo durante 20 minutos para solidificar a agarose. Este passo é muito crítica, como um pequeno agregado de células visíveis nesta etapa resulta num bom grupo de células sob o microscópio electrónico. </li><li> Transferir cuidadosamente a agarose solidificada contendo o sedimento de células a partir do tubo de plástico para uma placa de Petri de 35 mm contendo tampão usando uma agulha de 27 G 3,10. </li><li> Aparar a agarose solidificadas contendo o sedimento de células em um pedaço de cerca de 1 - 2 mm com um bisturi. Transferir o pedaço de agarose contendo o sedimento de células para um novo tubo de 1,5 mL. </li><li> Lave 2 - 3 vezes usando 600 ul de tampão de 0,1 M de cacodilato, adicionando e removendo tampão que usa a pipeta sem centrifugação. Use este pedaço de agarose contendo o sedimento de células para o próximo passo. Nesta etapa, a amostra pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite, antes de passar ao passo seguinte. </li></ol> 2. Osmification, desidratação, Embedding <ol><li> Remover o tampão de cacodilato a partir do tubo de 1,5 ml com o sedimento celular contendo agarose, utilizando uma pipeta. Adicionar 1,0 ml de 1% de tetróxido de ósmio (OsO4) solução num exaustor de fumos, e incubar durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Lavar três vezes com 600 ul de tampão de cacodilato 0,1 M e transferir a amostra para um frasco de cintilação de 20 ml de vidro com uma tampa. </li><li> Processar a amostra para a desidratação, infiltração e embutir em resina (por exemplo, LX-112) com as mudanças de série dos seguintes soluções em uma placa de 6 bem. Mover a peça de agarose de células-pellet usando uma pinça. <ol><li> Imergir a amostra em 25% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Imergir a amostra em 50% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Imergir a amostra em 75%etanol à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Imergir a amostra em 95% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Imergir a amostra em 100% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min, duas vezes. </li><li> Imergir a amostra em etanol: resina (3: 1) à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Imergir a amostra em etanol: resina (1: 1) à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Imergir a amostra em etanol: resina (1: 3) à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Imergir a amostra de resina pura à temperatura ambiente durante 60 min, duas vezes. </li></ol></li><li> Transferir a amostra para a parte inferior da ponta em forma de pirâmide do molde de borracha com a pinça e cuidadosamente adicionar mais resina pura no topo da amostra para encher o molde. Incubar a amostra a 60 ° C durante 72 horas, para a polimerização da resina. </li><li> Retirar a pirâmide de resina polimerizada a partir dos moldes, torcendo o molde de borracha. Um pequeno aglomerado negro de células devem ser visíveis na pirâmide resina polimerizada, conforme descrito anteriormente 7. Anexar a pirâmide de resina polimerizada no cilindro de montagem usando cianoacrilato. </li></ol><ol><li> Apare o bloco de pirâmide com uma lâmina de barbear e uma faca de diamante após a montagem do bloco em um ultra-micrótomo. Adicione uma forma trapezoidal de largura curto com a parte superior e a parte inferior do bloco paralelas entre si, e com os lados uniformemente inclinada. Esta forma de pirâmide ajuda para o seccionamento em série. </li><li> Além disso, cortar o bloco em torno do pellet celular com a faca de diamante e remover os perfis de plástico ao redor do pedaço de agarose pellet celular. </li><li> Corte 1 mm seções usando um ultra-micrótomo. Mova os 1 mm seções do barco da água para uma lâmina de vidro usando uma ferramenta de cílios e uma ferramenta alça de metal conforme relatado anteriormente 7. seções de transferência em slides e slides de transferência para a placa de aquecimento (37 ° C) para a secagem. </li><li> Adicionar uma gota de solução de azul de toluidina para as secções, utilizando uma seringa equipada com filtro de 0,22 um e incubar durante 3 min. Lavar as lâminas com água destilada e let as secções secar. Verifique com um microscópio de luz para identificar a posição das células. </li><li> Cortar seções ultra-finas (70 - 100 nm) usando uma faca de diamante. Mova 2 - 3 seções sobre grelhas de 200 malha do barco da água para uma placa de Petri de vidro usando uma ferramenta de cílios. </li><li> Transferir a placa de Petri de vidro contendo grades com secções sobre uma placa quente a 30 ° C para secar secções durante 30 min. </li><li> Corar as grades com gotas de 1% de acetato de uranilo à TA durante 10 min e, em seguida, lavar em água destilada 6 - 8 vezes. Mancha com citrato de chumbo de Reynolds, à TA, durante 5 min e lavar em água destilada 6 - 8 vezes. Transferir a placa de Petri de vidro contendo as grades sobre uma placa quente a 37 ° C para secar secções. </li><li> Analisar as seções com um microscópio eletrônico, a 80 kV 7. </li></ol>

<ol><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ulstract+Res%22%5BJournal%5D)">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li>
<li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li>
<li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li>
<li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+%28TEM%29+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+between+formaldehyde%2C+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide%2C+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li>
<li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils%3A+immunocytochemical%2C+molecular%2C+and+biochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Este método permite a análise TEM em números de celulares de baixo, usando Evans coloração azul e agarose a incorporação de localizar um pellet de células pequenas durante a desidratação, inclusão em resina e seccionamento processos. É importante notar que mantém agrupamentos de células em conjunto e preserva a ultra-estrutura celular, o que é desejável para examinar várias células para quantificação de dados. Em estudos TEM, um sedimento celular, contendo milhões de células é muitas vezes n...

Detalhes ultra-estruturais e sub-organela das células foram revelados principalmente por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) estudos de tecidos ou pellets de células 1,2. peças sólidas de tecidos pode ser facilmente utilizada para estudos de microscopia electrónica. No entanto, análises de MET 1,3 em células em suspensão e necessitam de permanecer desafiador números elevados de células, isto é, milhões de células. Devido a isso, análises de ultra-estruturais das populações de células raras em suspensão, por exemplo, células estaminais hematopoiéticas (HSCs), não são facilmente avaliados. Várias tentativas para análise de TEM de amostras usando escassos cytospin ou monocamada abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativa do número limitado de células. Deste modo, a exigência de um elevado número de células limita a utilização desta ferramenta poderosa para compreender os detalhes ultraestruturais subcelulares de populações de células raras. Uma limitação fundamental para estudos TEM com um número limitado de célulass em suspensão, é a localização das células para o processamento e, portanto, a partir de estudos TEM células limitadas com tamanhos especialmente pequenos permanecem desafiador. Várias abordagens alternativas foram adotadas para contrariar esta limitação: a BSA / bisacrilamida (BSA-BA) polimerização mediada de suspensão de células, a coloração das células com um corante para torná-los visíveis num suporte de película fina incluindo lamelas, e analisa MET a partir de preparações de Cytospin 4-6. No entanto, o sucesso muito limitado foi alcançado, como muito poucas células foram encontrados nas secções após ultra-seccionamento. O principal desafio de identificar células esparsas persiste porque a monocamada de células permanece praticamente invisível no gel solidificado para seccionamento. Além disso, a preparação Cytospin de células pode alterar a sua organização celular devido ao espalhamento das células e a fragilidade da estrutura celular. Por conseguinte, estes inconvenientes inerentes garante uma nova abordagem para a realização de estudos de MET a partir de populações de células raras com maisconsistência. Para ultrapassar este problema, nós descrevemos um método novo e preparação de amostras alternativa para estudos TEM de populações de células raras 7. Aqui, descrevemos um protocolo de preparação da amostra eficiente para realizar TEM de amostras biológicas escassos com resultados qualitativos e quantitativos consistentes. O azul de Evans foi realizada a coloração após a fixação de localizar um pequeno agregado de células a partir de células baixo número, ou seja, 10.000 tronco hematopoiéticas da medula óssea e células progenitoras que de outra forma teriam permanecido invisível, e o sedimento foi incorporado em agarose antes de processos de desidratação e de resina de incorporação. Este método agrupa as células em conjunto e permite a análise eficiente da ultra-estrutura e organização subcelular das células estaminais hematopoiéticas (identificado como Lin - Sca-1 + c-kit + Flt3 - CD34 -; HSC), um raro 0,2 - população de células 0,5% na medula óssea. Este pro experimentalprotocolo pode ser útil para realizar estudos ultra-estruturais e obter resultados quantitativos sobre muitas populações raras, mas muito importantes.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeído 20% aquoso Soln</td><td>microscopia eletrônica Sciences</td><td>15713</td><td>CAUTION Tóxico por inalação, contato com a pele. Use luvas, use exaustor.</td></tr><tr>Ciências aquosas <td>16350</td>CAUTION da <td>microscopia</td> eletrônica <td>de Gluteraldeído 70% Soln</td><td> Use luvas, use exaustor.</td></tr><tr><td>Tampão de cacodiladato</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>12300</td><td>Faça tampão de cacodiladato 0,1 M (pH 7,4) em água destilada, armazene a 4 ° C. <forte>CUIDADO< / forte> Irritante por inalação ou contato com a pele, use luvas e trabalhe em capela de exaustão.</td></tr><tr><td>Evans Azul</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Tetraóxido de ósmio</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>19130</td><td>1 g em 50 ml de tampão de cacodiladato 0,1 M para fazer 2% de estoque de OsO4, <forte>CUIDADO</forte> Muito tóxico por inalação ou contato com a pele, oxidante forte, use roupas de proteção, proteção para os olhos, use exaustor.</td></tr><tr><td>LX-112 Kits de Incorporação (LADD&reg;)< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DDSA (anidrido dodecenilsuccínico)</td> <td>LADD</td><td>21340</td><td>Misture 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 juntos e, em seguida, adicione 1,4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (anidrido metil Nadic)</td> <td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Resinas epóxi Epon 812 (LX-112)</td> <td>LADD</td><td>21310</td> <td>< forte > CUIDADO < / forte> Tóxico por inalação, contato com a pele. Use luvas, roupas de proteção, use exaustor.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimetilaminometil)fenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de chumbo de Reynolds (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>CUIDADO Tóxico por inalação, evite o contato com a pele ou os olhos.</td></tr><tr><td>Acetato de uranilo (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>CUIDADO Tóxico por inalação, evite o contato com a pele ou os olhos.</td></tr><tr><td>Meio Dulbecco's Modificado de Iscove (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composição: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glicose, Ca, Mg, piruvato de grama etc. Para detalhes https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Molde de ponta de pirâmide&nbsp;</td><td>Cilindros de montagem Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-micrótomo&nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 grades de malha (nikil)</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico</td><td>Hitachi modelo H-7650&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de mecanismo de captura de imagem</td><td>AMT-600&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico de 35 mm</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super cola Cianoacrilato&nbsp;</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear Frascos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de cintilação de vidro&nbsp;</td><td>Fisher científico&nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Ferramenta <td></td><td></td><td></td>de <td>cílios</td></tr><tr><td>Ferramenta de laço de metal&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de análise tem

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornece detalhes sobre a organização celular e ultra-estrutura. No entanto, a análise TEM de populações de células raras, especialmente as células em suspensão, tais como células estaminais hematopoiéticas (HSCs), permanece limitada devido à exigência de um elevado número de células durante a preparação da amostra. Há um cytospin ou monocamada algumas abordagens para a análise de MET a partir de amostras escassos, mas estas abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativos do número limitado de células. Aqui, uma abordagem alternativa e inovadora para preparação de amostras em estudos TEM é descrito para populações de células raras que permite a análise quantitativa. Um número de células relativamente baixa, ou seja, 10.000 HSCs, foi utilizado com sucesso para a análise de TEM em comparação com os milhões de células, tipicamente utilizados para estudos TEM. Em particular, Evans azul coloração foi realizada após paraformaldeído-glutaraldeído (PFA-GA) de fixação para visualizar o pequeno pel celularvamos, o que facilitou a incorporação de agarose. Aglomerados de numerosas células foram observadas em seções ultra-finas. As células tinham uma morfologia bem conservada, e os detalhes de ultra-estruturais das mitocôndrias e vários complexos de Golgi eram visíveis. Este protocolo eficiente, fácil e reprodutível permite a preparação da amostra a partir de um número de células de baixo e pode ser usado para a análise TEM qualitativa e quantitativa sobre as populações de células raras a partir de amostras biológicas limitados.

Um protocolo eficiente e consistente para a preparação da amostra para realizar a análise TEM de baixo número de células é descrito. Coloração pós-fixação com azul de Evans e da transferência de células para um tubo de 0,5 ml de microcentrífuga ajudou a visualizar o pequeno pellet celular 7. Osmification com tetróxido de ósmio em agarose levou a uma detecção fácil do sedimento celular escuro durante a desidratação e a incorporação. <p class="jove_content" fo:keep-together....

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar amostras com baixo número de células para análise de microscopia eletrônica de transmissão (MET).

Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar amostras com baixo número de células para realizar análise por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de forma eficiente e reprodutível. Este método pode auxiliar na revelação de todas as estruturas de células reais e em condições fisiológicas mais próximas da realidade no campo biomédico. A principal vantagem desta técnica é que tanto resultados qualitativos quanto quantitativos podem ser obtidos a partir de baixos números de células de maneira reprodutível.Para começar, utilize fatos para separar 10.000 células-tronco hematopoiéticas, ou HSCs, em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL contendo 600 microlitros de meio dulbecco modificado isocoves com 10% de FBS. Usando uma centrífuga com rotor de balde oscilante, centrifugue as HSCs separadas a 1.000 × g durante 10 minutos.Utilize aspiração suave para remover todo o meio, exceto 200 microlitros. Para fixar as células, adicione 0,2 mL de solução fixadora recém-preparada a duas vezes a concentração, e incube à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, adicione 600 microlitros de tampão cacodilato 0,1 molar para lavar as células.Centrifugue as células novamente, desta vez a 30 graus Celsius. Em seguida, após a centrifugação e remoção de todo o tampão, exceto 200 microlitros, adicione 200 microlitros de azul de evans a dois miligramas por mililitro em tampão cacodilato e incube à temperatura ambiente por 20 minutos para coloração das células. Use 600 microlitros de tampão cacodilato 0,1 molar para lavar as células três vezes.Em seguida, re-suspenda as células nos 200 microlitros restantes de tampão antes de transferir a suspensão celular para um tubo de 0,5 mL. Nesta etapa, o pellet deve ser visível no tubo. Com uma centrífuga de bancada, gire as células a 1.000 × g por 10 minutos.Em seguida, remova cuidadosamente o tampão sem perturbar o pequeno pellet celular agora visível, deixando 50 microlitros de tampão no tubo. Prepare uma solução de agarose a 4%, adicionando 200 miligramas de agarose de baixo ponto de fusão a cinco mililitros de tampão cacodilato 0,1 molar em um tubo de 15 mL. Derreta a agarose transferindo o tubo para água em ebulição em um frasco de vidro de 100 mL.Adicione 200 microlitros da solução de agarose ao tubo com a suspensão celular. Imediatamente, centrifugue a 1.000 × g e 30 °C por 10 minutos. Após confirmar que as células foram sedimentadas na agarose semissólida no fundo do tubo, transfira imediatamente o tubo para 4 °C ou gelo por 20 minutos para solidificar a agarose.Usando uma agulha de 27 mm, transfira cuidadosamente o agarose solidificado, contendo o pellet celular, para uma placa de Petri plástica de 35 mL contendo tampão cacodilato 0,1 molar. Com um bisturi, corte o agarose solidificado contendo o pellet celular em um único pedaço de cerca de um a dois milímetros. Em seguida, transfira-o para um novo tubo de 1,5 mL.Adicione 600 microlitros de tampão cacodilato 0,1 molar e lave o pellet celular de agarose utilizando uma pipeta para adicionar e remover o tampão. Remova o tampão do pellet celular de agarose e, em uma capela, usando roupas protetoras e luvas, adicione um mililitro de solução de tetróxido de ósmio a 1%. Incube o pellet celular a quatro graus Celsius por uma hora.Após a incubação, lave a amostra três vezes. Transfira-a para um frasco de cintilação de vidro de 20 mL com tampa. Em seguida, desidrate a amostra utilizando uma série de etanol.Em seguida, infiltre a amostra em concentrações crescentes de resina LX 112 em etanol antes de incubá-la duas vezes em resina a 100%, durante 60 minutos cada vez. Usando pin&ccedil;as, transfira cuidadosamente a amostra para o fundo de um molde de borracha com formato de ponta de pir&acirc;mide e adicione resina pura sobre a amostra para preencher o molde. Incube a amostra a 60 graus Celsius por 72 horas para polimerizar a resina.Quando a resina for polimerizada, remova-a dos moldes girando o molde de borracha. Um pequeno aglomerado preto de células deve ser visível na pirâmide de resina polimerizada. Use cianoacrilato para fixar a pirâmide de resina polimerizada em um cilindro de montagem para o corte.Após montar o bloco em um ultramicr&otom;o, utilize uma l&acirc;mina de barbear e uma faca de diamante para aparar o bloco em forma de pir&acirc;mide, criando uma forma trapezoidal curta e larga, com a parte superior e inferior do bloco paralelas entre si e com lados uniformemente inclinados. Em seguida, use a faca de diamante para aparar o bloco ao redor do pellet celular e remover as se&ccedil;&otilde;es de pl&aacute;stico ao redor do fragmento de pellet celular em &aacute;gar. Com o ultramicr&otom;o, corte se&ccedil;&otilde;es de um micr&ocirc;metro e utilize uma ferramenta de c&iacute;lio e um la&ccedil;o met&aacute;lico para transferir as se&ccedil;&otilde;es do banho de &aacute;gua para uma l&acirc;mina de vidro.Em seguida, coloque as lâminas em uma placa aquecedora a 37 graus Celsius para secar. Usando uma seringa com filtro de 0,22 micrômetro, adicione uma gota de solução de azul de teluitina às seções e incube por três minutos. Depois, com água destilada, enxágue as lâminas e deixe as seções secarem.Após a secagem, verifique as seções em um microscópio óptico para identificar a posição das células. Em seguida, use uma lâmina de diamante para cortar seções ultrfinas. Depois, com uma ferramenta de cerda de cílio, transfira duas a três seções para grades de 200 malhas a partir do banho de água e coloque-as em uma placa de Petri de vidro.Transfira a placa com as grades para uma placa aquecedora a 30 graus Celsius durante 30 minutos para secar as seções. Adicione gotas de acetato de uranila 1% e incube à temperatura ambiente por 10 minutos para corar as grades. Em seguida, use água destilada para lavar de seis a oito vezes.Contracolorir com citrato de chumbo de Reynolds à temperatura ambiente por cinco minutos antes de lavar de seis a oito vezes. Transfira a placa de Petri de vidro contendo as grades para uma placa aquecedora a 37 graus Celsius para secar as seções. Finalmente, analise as seções com um microscópio eletrônico a 87 quilovolts.Mostradas aqui em baixa ampliação, há seções semifinas coradas com azul de toluidina provenientes de blocos contendo um pequeno pellet celular que confirmam um agrupamento de células. Esta imagem de maior ampliação mostra a morfologia intacta das células. Esta figura representa um campo de visão geral do agrupamento celular a partir de seções ultrfinas coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo e analisadas por microscopia eletrônica.É mostrado aqui um único HSC, demonstrando que a morfologia e a ultraestrutura das células foram bem preservadas. Uma micrografia eletrônica de maior ampliação, altamente detalhada, de um HSC individual mostra as ultraestruturas intracelulares. Além disso, imagens de alta ampliação revelaram estrutura e integridade bem preservadas de organelas subcelulares, como as mitocôndrias.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco a seis horas, e para coloração azul avançada, inclusão em agarose e posterior processamento normal em MET, serão necessários de cinco a seis dias, se realizado corretamente. Assim, após assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como preparar amostras a partir de células reais para análise em MET.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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