Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

O objetivo geral deste procedimento é preparar amostras com baixo número de células para realizar a análise de TEM de maneira eficiente e reprodutível. Este método pode ajudar a revelar todas as estruturas de células reais e uma melhor configuração fisiológica no campo biomédico. A principal vantagem dessa técnica é que os resultados qualitativos e quantitativos podem ser obtidos a partir de um baixo número de células de maneira reprodutível.

Para começar, use fatos para classificar 10.000 células-tronco hematopoiéticas, ou HSCs, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Contendo 600 microlitros de isocoves modificou o meio dulbecco com 10% de FBS. Usando uma centrífuga com baldes giratórios, gire os HSCs classificados a 1.000 vezes G por 10 minutos.

Use a aspiração gentílica para remover todos, exceto 200 microlitros do meio. Para fixar as células, adicione 0,2 mL de solução fixadora de dois X recém-preparada e incube em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, adicione 600 microlitros de tampão de cacodilato 0,1 molar para lavar as células.

Centrifugue as células novamente, desta vez a 30 graus Celsius. Em seguida, após a centrifugação e removendo todos, exceto 200 microlitros de tampão, adicione 200 microlitros de dois miligramas por mililitro de azul de evans em tampão de cacodilato e incube em temperatura ambiente por 20 minutos para corar as células. Use 600 microlitros de tampão cacodilato 0,1 molar para lavar as células três vezes.

Em seguida, ressuspenda as células nos 200 microlitros restantes de tampão antes de transferir a suspensão da célula para um tubo de 0,5 mL. Nesta etapa, o pellet deve estar visível no tubo. Com uma centrífuga de mesa, gire as células a 1.000 vezes G por 10 minutos.

Em seguida, remova suavemente o tampão sem perturbar o pellet de célula minúscula agora visível, deixando 50 microlitros de tampão no tubo. Prepare uma solução de agarose a 4%, adicionando 200 miligramas de agarose de baixo ponto de fusão a cinco mililitros de tampão de cacodilato molar 0,1 em um tubo de 15 mL. Derreta a agarose transferindo o tubo para água fervente em uma garrafa de vidro de 100 mL.

Adicione 200 microlitros da solução de agarose ao tubo da suspensão celular. Centrifugue imediatamente a 1.000 vezes G e 30 graus Celsius por 10 minutos. Depois de confirmar que as células foram peletizadas na agarose semissólida no fundo do tubo, transfira imediatamente o tubo para quatro graus Celsius, ou gelo, por 20 minutos para solidificar a agarose.

Usando uma agulha de calibre 27, transfira cuidadosamente a agarose solidificada, contendo o pellet celular, para uma placa de Petri de plástico de 35 mL contendo tampão de cacodilato molar 0,1. Com um bisturi, apare a agarose solidificada contendo o pellet celular em um pedaço de cerca de um a dois milímetros. Em seguida, transfira-o para um novo tubo de 1,5 mL.

Adicione 600 microlitros de tampão de cacodilato 0,1 molar e lave o pellet de células de agarose usando uma pipeta para adicionar e remover o tampão. Remova o tampão do pellet de célula de agarose e, em uma capela de exaustão, usando roupas e luvas de proteção, adicione um mililitro de solução de tetróxido de ósmio a 1%. Incubar o pellet celular a quatro graus Celsius por uma hora.

Após a incubação, lave a amostra três vezes. Transfira-o para um frasco de cintilação de vidro de 20 mL com tampa. Em seguida, desidratar a amostra usando uma série de etanol.

Em seguida, infiltre a amostra em concentrações crescentes de resina LX 112 em etanol antes de incubar em resina 100% duas vezes por 60 minutos de cada vez. Usando uma pinça, transfira cuidadosamente a amostra para a parte inferior de um molde de borracha em forma de ponta de pirâmide e adicione resina pura em cima da amostra para preencher o molde. Incube a amostra a 60 graus Celsius por 72 horas para polimerizar a resina.

Quando a resina estiver polimerizada, remova-a dos moldes torcendo o molde de borracha. Um pequeno aglomerado preto de células deve ser visível na pirâmide de resina polimerizada. Use cianoacrilato para prender a pirâmide de resina polimerizada em um cilindro de montagem para seccionamento.

Depois de montar o bloco em um ultramicrótomo, use uma lâmina de barbear e uma faca de diamante para aparar o bloco da pirâmide, fazendo uma forma trapezoidal curta e larga com a parte superior e inferior do bloco paralelas uma à outra e com lados uniformemente angulados. Em seguida, use a faca de diamante para aparar o bloco ao redor do pellet da célula e remova as seções de plástico ao redor do pedaço de agarose do pellet da célula. Com o ultramicrótomo, corte seções de um micrômetro e use uma ferramenta de cílios e um laço de metal para mover as seções do barco aquático para uma lâmina de vidro.

Em seguida, coloque as lâminas em uma placa quente a 37 graus Celsius para secar. Usando uma seringa com filtro de 0,22 micrômetros, adicione uma gota de solução de azul de teluatina aos cortes e incube por três minutos. Em seguida, com água destilada, levante as lâminas e deixe as seções secarem.

Após a secagem, verifique as seções em um microscópio óptico para identificar a posição das células. Em seguida, use uma faca de diamante para cortar seções ultrafinas. Em seguida, com uma ferramenta de cílios, mova duas a três seções para 200 grades de malha do barco aquático e coloque em uma placa de Petri de vidro.

Transfira o prato com grades para uma chapa quente a 30 graus Celsius por 30 minutos para secar as seções. Adicione gotas de acetato de uranila a 1% e incube em temperatura ambiente por 10 minutos para manchar as grades. Em seguida, use água destilada para enxaguar de seis a oito vezes.

Manchar com citrato de chumbo Reynolds em temperatura ambiente por cinco minutos antes de enxaguar seis a oito vezes. Transfira a placa de Petri de vidro contendo as grades para uma placa quente a 37 graus Celsius para secar as seções. Finalmente, analise as seções com um microscópio eletrônico a 87 quilovolts.

Mostradas aqui em baixa ampliação estão seções semifinas coradas com azul de toluidina de blocos contendo uma pequena pelota celular que confirmam um aglomerado de células. Esta imagem de maior ampliação mostra a morfologia intacta das células. Esta figura representa um campo de visão geral do aglomerado de células a partir de seções ultrafinas que foram coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo e analisadas por microscopia eletrônica.

Aqui é mostrado um único HSC, demonstrando que a morfologia e a ultraestrutura das células foram bem preservadas. Uma micrografia eletrônica altamente detalhada de maior ampliação de um HSC individual mostra as ultraestruturas intracelulares. Além disso, imagens de alta ampliação capturaram estrutura e integridade bem preservadas de organelas subcelulares, como as mitocôndrias.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco a seis horas, e para coloração avançada de azul e incorporação de agarose, e então o processamento normal de MET levará de cinco a seis dias se for realizado corretamente. Então, depois de assistir a este vídeo, você meio que tem uma boa compreensão de como preparar amostras a partir da preparação de células reais para análise de TEM.