Método de entrega directa segmentos intra-hepática Usando um modelo de rato Liver Hilar Grampo
2 de abril de 2017
Um modelo de braçadeira hilar fígado de rato original foi desenvolvido para estudar o impacto das moléculas farmacológicas no melhoramento da lesão por isquemia-reperfusão. Este modelo inclui canulação direta da oferta de portal para o segmento fígado isquêmico através de um ramo da veia portal, permitindo a entrega hepática direta.
O objetivo geral deste modelo exclusivo de grampo hilar de fígado de rato é permitir o estudo do impacto de moléculas farmacológicas de interesse na melhora da lesão de isquemia e reperfusão. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do transplante de fígado sobre quais moléculas podem ser infundidas diretamente no fígado para ajudar a mediar a lesão de isquemia e reperfusão. A principal vantagem dessa técnica é que a molécula de interesse é injetada diretamente na veia porta, reduzindo o volume de distribuição.
As implicações dessa técnica se estendem ao transplante de todos os órgãos, pois permite o teste de moléculas que podem ser adicionadas a perfusados de órgãos para redução da lesão de isquemia e reperfusão. A demonstração visual desse método é crítica devido ao pequeno tamanho do ramo da veia porta usado para a canulação. Comece confirmando o nível apropriado de sedação por pinça do dedo do pé, depois coloque o rato em uma almofada de aquecimento sob um microscópio de dissecação e contenha os membros.
Em seguida, faça uma incisão na pele abdominal da linha média do púbis ao xifóide, seguida por uma incisão semelhante no peritônio ao longo da linha alba. Entre no abdômen, tomando cuidado para não danificar a bexiga ou o intestino, e libere o fígado do peritônio anteriormente próximo ao processo xifóide. Faça uma incisão transversal através da pele e do peritônio na borda inferior do lobo direito do fígado e use uma pinça de mosquito curva para retrair o processo xifóide.
Use afastadores de costela para abrir as costelas o mais longe possível da linha média e corte os ligamentos falciforme, frênico e gástrico. Em seguida, use cotonetes estéreis umedecidos para virar o fígado para cima e cortar ligamentos adicionais conforme necessário para obter acesso à porta. Usando gaze umedecida com solução salina, gire visceralmente o fígado e, em seguida, remova o tecido conjuntivo frouxo que cobre o hilo portal e o tecido conjuntivo frouxo que cobre o comprimento da veia porta.
Usando uma pinça, empurre o tecido conjuntivo frouxo posterior à veia porta esquerda, artéria e ducto biliar para fazer uma janela e circundar frouxamente os vasos com uma sutura de Potts 4-0. Em seguida, limpe o tecido conjuntivo frouxo que cobre o ramo posterior até a veia porta no rim direito. Em seguida, use uma seringa de insulina para retirar 0,5 mililitros de sangue da veia cava inferior e transfira o sangue para um pequeno frasco.
Centrifugue a amostra e colete o soro em um novo frasco para injetáveis para congelamento instantâneo em nitrogênio líquido. Corte dois pedaços de sutura 7-0. Coloque o primeiro laço 7-0 ao redor da veia porta esquerda o mais medial possível e use uma pinça de mosquito curva para retrair a veia.
Coloque um segundo laço 7-0 frouxamente amarrado no ramo posterior da veia porta perto de sua interseção com a veia porta. Agora, carregue a bomba de infusão com uma seringa de cinco mililitros contendo três mililitros de reagente em solução salina a 0,9% e prepare o tubo. Use uma pinça microcirúrgica para agarrar a veia porta distal para reduzir o sangramento durante a canulação e use uma pequena tesoura microcirúrgica para cortar um orifício de 0,5 milímetro na veia entre a sutura de estada 7-0 e sua intersecção com a veia porta.
Usando um cateter 27-0, canule o sistema venoso portal esquerdo, inserindo o cateter além da bifurcação das veias portais esquerda e direita. Infundir um mililitro de solução salina normal para confirmar a colocação da cânula e observar o branqueamento dos lobos lateral e mediano esquerdo do fígado. Avalie manualmente se o cateter passou da decolagem da veia porta direita, mas não além da decolagem da veia porta que alimenta o lobo mediano, em seguida, aperte a sutura de Potts, prenda o cateter com a sutura 7-0 e remova a pinça da veia porta distal.
Inicie imediatamente a infusão de dois mililitros do reagente de interesse durante um período de entrega de 15 minutos, com monitoramento contínuo dos sinais vitais do animal durante toda a infusão. Uma hora após o início do tempo isquêmico, remova a sutura de Potts e o cateter e, em seguida, aperte a sutura 7-0 no ramo posterior até a veia porta. Duas horas após o início da reperfusão, retirar lentamente 0,5 mililitros de sangue da veia cava inferior, seguida de transferência lenta do sangue para um novo frasco.
Aplique uma leve pressão para parar o sangramento da veia, conforme necessário. Em seguida, centrifugue o sangue e congele metade do soro para processamento a jusante, como acabamos de demonstrar. No ponto final experimental, incise o diafragma em um círculo e corte qualquer tecido conjuntivo adicional que permaneça conectando o fígado à cavidade peritoneal.
Colete o fígado e obtenha quatro amostras grandes dos lobos esquerdo e mediano e quatro amostras grandes do lobo direito. Em seguida, coloque as amostras em frascos rotulados individuais e congele os tecidos em nitrogênio líquido para processamento a jusante. A dosagem da alanina aminotransferase sérica em animais com solução salina normal e grampeados hilares com infusão de PEG-SOD demonstra uma diferença significativa entre os níveis de expressão de enzimas hepáticas de animais de controle sérico e experimental 120 minutos após a reperfusão.
A expressão de malondialdeído tecidual no lobo direito não hilar não apresenta diferença significativa entre os grupos controle e experimental. O clamp pós-hilar esquerdo e o lobo de reperfusão, no entanto, demonstram um nível significativamente mais alto de expressão de malondialdeído tecidual em comparação com o lobo controle não reperfundido e não infundido, bem como com o lobo infundido com PEG-SOD direito. O mesmo padrão também é observado para a expressão de glutationa tecidual.
A análise de Western blot indica um aumento do nível de expressão de caspase-3 clivada no lobo esquerdo após clamp hilar e reperfusão que é diminuído em animais tratados com infusão de PEG-SOD, diferenças que são confirmadas como significativas pela densitometria. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em três horas e 30 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de obter tração substancial no ramo da veia porta para canulação ao colocar a pinça da veia porta distal.
Uma vez que esse procedimento é dominado, ele pode ser usado para explorar o impacto de uma variedade de substâncias farmacológicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como canular o sistema venoso portal esquerdo.
Visão Geral
Este artigo apresenta um modelo único de clampeamento hiliar de fígado de rato projetado para estudar os efeitos de moléculas farmacológicas na lesão por isquemia-reperfusão. O modelo permite a administração hepática direta de substâncias através da veia porta, facilitando pesquisas direcionadas no transplante de fígado.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Farmacologia
- Transplante de Fígado
Antecedentes
- A lesão por isquemia-reperfusão é uma preocupação crítica no transplante hepático.
- Compreender intervenções farmacológicas pode melhorar os resultados do transplante.
- Métodos de infusão direta podem aumentar a eficácia de agentes terapêuticos.
- A demonstração visual de técnicas cirúrgicas é essencial para a reprodutibilidade.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo para estudar agentes farmacológicos na lesão hepática por isquemia-reperfusão.
- Avaliar os efeitos diretos de moléculas infundidas na saúde hepática.
- Fornecer uma metodologia aplicável a outros cenários de transplante de órgãos.
Métodos Utilizados
- Modelo de clampeamento hiliar do fígado de rato com canulação da veia porta.
- Infusão direta de agentes farmacológicos na veia porta.
- Monitorização dos sinais vitais durante o processo de infusão.
- Coleta e análise de amostras de soro e tecidos após a reperfusão.
Resultados Principais
- Diferenças significativas nos níveis séricos de alanina aminotransferase após o tratamento.
- Aumento da expressão de malondialdeído nos lobos hepáticos tratados.
- A análise por Western blot mostrou níveis alterados de caspase-3 clivada.
- Demonstrou o potencial de agentes farmacológicos em atenuar a lesão.
Conclusões
- O modelo de pinça hilar do fígado de rato é eficaz para estudar lesão por isquemia-reperfusão.
- Técnicas de infusão direta podem aumentar a eficácia terapêutica.
- Os achados podem orientar estratégias futuras em transplante de órgãos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de clampagem hiliar do fígado de rato permite a administração direcionada de agentes farmacológicos a segmentos hepáticos isquêmicos, reduzindo a exposição sistêmica e aprimorando o entendimento mecanicista da lesão por isquemia-reperfusão. Ao permitir infusão direta no sistema venoso porta, o método viabiliza a avaliação pré-clínica de compostos citoprotetores com melhor relação sinal-ruído em desfechos tecido-específicos. Essa abordagem auxilia na redução de riscos de candidatos promissores para transplante hepático e outras estratégias de perfusão de órgãos, isolando os efeitos hepáticos de interferentes sistêmicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a administração direta de compostos experimentais ao lobo hepático isquêmico, elucidando mecanismos de ação específicos do alvo.
- Valor Operacional: Reduz o volume necessário do composto e minimiza efeitos fora do alvo, melhorando a sensibilidade do ensaio e a especificidade do alvo.
- Valor Traducional: Apoia a validação do alvo em um modelo relevante de isquemia/reperfusão (I/R), aumentando a confiança na relevância fisiopatológica antes de avançar para espécies maiores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera leituras bioquímicas quantificáveis, como níveis séricos de ALT e níveis teciduais de MDA, permitindo a triagem padronizada de compostos para atividade hepatoprotetora.
- Reprodutibilidade: O modelo cirúrgico fornece padrões consistentes de lesão isquêmica, apoiando avaliações confiáveis de resposta à dose entre lotes experimentais.
- Escalabilidade: Uma vez dominado, o procedimento permite a realização repetida de testes com múltiplos agentes farmacológicos de maneira controlada e específica por segmento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Simula a isquemia clínica quente durante a captação de órgãos e o transplante, fornecendo um modelo preditivo para lesão e disfunção do enxerto.
- Redução Mecanística de Riscos: Permite a avaliação de agentes antioxidantes e antiapoptóticos (por exemplo, PEG-SOD) sobre marcadores-chave de lesão, como caspase-3 clivada e peroxidação lipídica.
- Continuidade Pré-clínica: Facilita a otimização de compostos líderes ao associar o engajamento do alvo no fígado a desfechos funcionais na liberação de enzimas e no estresse oxidativo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo a triagem em estágios iniciais de agentes citoprotetores antes da caracterização farmacocinética ou toxicológica mais ampla.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a validação de alvos ao isolar os efeitos da droga no segmento hepático submetido à lesão por isquemia e reperfusão.
- Triagem: Permite a avaliação padronizada da eficácia de compostos por meio de parâmetros quantificáveis, como a liberação de ALT e a formação de MDA.
- Análises: Fornece leituras multiplexadas (enzimáticas, oxidativas, apoptóticas) para comparar mecanismos e potência dos compostos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a proteção hepática com desfechos relevantes para transplante, apoiando decisões de avançar ou não avançar em estratégias de preservação de órgãos.
- Reutilização Corporativa: A plataforma cirúrgica pode ser reutilizada em múltiplas campanhas de testes de compostos, maximizando o retorno sobre o investimento no desenvolvimento do modelo e no treinamento dos operadores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a variabilidade farmacocinética e concentrar-se na farmacodinâmica específica do fígado.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio do acesso vascular padronizado e da perfusão segmentar, minimizando a variabilidade entre animais.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência na identificação de compostos líderes, permitindo testes rápidos de relação estrutura-atividade em um contexto fisiopatológico relevante.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos citoprotetores para programas de transplante, fornecendo dados de mecanismo e eficácia no início da descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cânula microcirúrgica vascular e anatomia hepática de roedores.
- Depende de instrumentos de precisão, incluindo microseringas, suturas finas e sistemas de ampliação.
- Necessita cuidados perioperatórios padronizados, incluindo manutenção da temperatura e monitoramento de sinais vitais.
- A adaptação a outros lobos ou órgãos pode exigir novo mapeamento anatômico e ajuste do tamanho dos vasos.
- As limitações práticas incluem complexidade técnica e dependência do operador, o que pode afetar a reprodutibilidade entre laboratórios na ausência de treinamento rigoroso.
