Name: Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC via Artéria carótida interna (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda microcirurgia de infusão em camundongos para entrega de substâncias no cérebro via artéria carótida interna. Esta técnica minimiza trauma e preserva a integridade neuronal.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Lei Chen (Icahn School of Medicine no Mount Sinai, NY) que primeiro estabeleceu o uso deste modelo em nosso laboratório, e à Dra. Gretchen Wolff (Centro Alemão de Pesquisa do Câncer, Heidelberg, Alemanha) por divulgar a técnica em nosso laboratório. Apoiado em parte pelo HL126559, DA039576, MH098891, MH63022, MH072567, DA027569 e NSC 2015/17/B/NZ7/02985.

Os procedimentos envolvidos no protocolo seguinte foram aprovados pela Universidade de Miami Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). Além disso, todos os procedimentos estão sendo realizados em instalações aprovadas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório de Animal Care International (AAALAC). 1. Preparação de Ratos para Cirurgia <ol><li> Anestesiar rato com isoflurano misturado com o oxigênio, usando um sistema de anestesia laboratório. Use isoflurano na definição entre 4-5% e fluxo de oxigênio a 2 L / min na máquina comercial (Veja a Tabela de Materiais). Transferir o animal para a superfície da cirurgia, sob um microscópio estereoscópico, e manter a anestesia utilizando um cone de nariz (1.5 usar uma configuração de isoflurano - 2,5 e de oxigénio no fluxo de 2 L / min). <ol><li> Certifique-se de que a taxa respiratória do rato é de cerca de 1-2 respiração / seg sem ofegante. Além disso, garantir que o animal não apresenta reação estimulação bigodes e pedal reFlex (toe pitada). Monitorar a taxa de respiração e esforço durante a cirurgia, pelo menos a cada 5 min. Siga específica Animal Care Institucional e Comitê de Uso e diretrizes veterinários para monitorar anestesia roedor. </li></ol></li><li> Aplicar uma gota de lubrificante oftálmica em cada olho utilizando uma zaragatoa estéril, a fim de evitar a secura. A administração de anti-inflamatório e analgésico para aliviar o desconforto é recomendado. </li><li> Com o animal deitado de costas, manter a anestesia utilizando um cone de nariz. </li><li> Limpar a área do pescoço do animal, limpando a área três vezes com etanol a 70% e cloro-hexidina. Shave área de cirurgia do animal usando uma lâmina de barbear (detalhada abaixo). </li></ol> 2. A dissecção da artéria carótida comum (CCA) <ol><li> Execute o procedimento de microcirurgia inteira sob um microscópio estereoscópico. Utilizando uma tesoura cirúrgica e fórceps executar uma incisão na linha média raso no pescoço, a partir de cima do esterno até abaixo tele maxila (cerca de 3 a 4 cm). </li><li> Utilizando uma pinça gordos cuidadosamente separado e tecido conjuntivo para expor a traqueia. </li><li> Coloque um travesseiro (objeto redondo, cerca de 0,5 cm de diâmetro) na parte de trás do pescoço do rato para estender o pescoço, expondo ainda mais a área. </li><li> Separa-se o tecido utilizando um afastador de tecido ou ganchos. </li><li> No lado esquerdo do animal, da traqueia, cuidadosamente pinça para além do tecido conjuntivo para expor a CCA esquerda. </li><li> Usando fórceps cuidadosamente remover todo o tecido conjuntivo para expor a bifurcação CCA, e o início de ambas as artérias carótidas interna e externa. </li></ol> 3. Preparação do CCA para perfusão Substância <ol><li> Insira dois segmentos de fio de náilon (cerca de 1 cm cada) sob artéria carótida externa (ECA), usando uma pinça. </li><li> Coloque um nó permanente no ponto mais alto possível da ECA. </li><li> No ponto mais baixo possível da ECA, imediatamente acima da bifurcação CCA, lugarum nó removível. Este nó deve ser solto em comparação com o nó superior. </li><li> Feche a CCA usando um clipe de embarcação, no ponto mais baixo possível. </li><li> Fechar a artéria carótida interna (ICA), utilizando um grampo navio. </li><li> Usando microdissecção mola tesoura realizar um pequeno corte no ECA (cerca de 2 mm), entre os dois nós. </li></ol> 4. Infusion Substância via ICA <ol><li> Montar um sistema de infusão. Anexar 6 polegadas de tubulação capilar (dimensões ideais: 2,5 mm x 1,2 mm) para uma seringa de tuberculina contendo 250 ml da substância a ser infundido (drogas, patógenos, vesículas extracelulares, entre outros) e insira a ponta capilar suavemente para dentro da incisão realizada no passo 3.6. </li><li> Continue a deslizar para baixo o tubo capilar até atingir um ponto médio entre a bifurcação e o grampo de fecho do CCA. </li><li> Amarrar o nó ECA inferior. Verifique se o nó está solto o suficiente para permitir a fluidez capilar e apertado o suficiente para evitar leaking. </li><li> Remover clipe do ICA. </li><li> Gentilmente aplicar pressão para a substância pistão seringa permitindo a infusão de cerca de 10 l por segundo. </li></ol> 5. Procedimentos após a infusão <ol><li> Coloque o clipe de volta no ICA. </li><li> Remova cuidadosamente o tubo capilar. </li><li> Amarrar o nó ECA inferior completamente. </li><li> Remova clipes do ICA e do CCA. </li></ol> 6. Incisão Encerramento e cuidados pós-operatórios <ol><li> Remover afastador ou tecido ganchos e travesseiro. </li><li> área de sutura limpa utilizando solução salina estéril. </li><li> Fechar a incisão usando nylon sutura / agulha e fórceps. </li><li> Administrar anti-inflamatória e analgésica para aliviar o desconforto pós-operatório. </li><li> Coloque o animal na gaiola colocada na almofada de aquecimento durante pelo menos 1 h e recuperação do monitor. </li></ol>

<ol><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).</li>
<li>Frisella, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+recombinant+adeno-associated+virus+improves+cognitive+function+in+a+murine+model+of+mucopolysaccharidosis+type+VII%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII.</a> Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).</li>
<li>Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+growth+and+angiogenesis+around+cortical+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke.</a> Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+methotrexate+to+epidermal+growth+factor+receptor-positive+brain+tumors+by+means+of+cetuximab+%28IMC-C225%29+dendrimer+bioconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates.</a> Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).</li>
<li>Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+in+ischemic+mouse+brain+induced+by+stem+cell-derived+brain+implants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).</li>
<li>Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+and+biochemical+analysis+of+carrier-mediated+efflux+of+drugs+through+the+blood-brain+and+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+importance+in+the+drug+delivery+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain.</a> J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+gene+delivery+to+the+brain%3A+the+vascular+route%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drug and gene delivery to the brain: the vascular route.</a> Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).</li>
<li>Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrous+cycle+influences+organ-specific+metastasis+of+B16F10+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells.</a> Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).</li>
<li>Huang, R. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+targeted+to+the+brain+using+a+transferrin-conjugated+polyethyleneglycol-modified+polyamidoamine+dendrimer%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer.</a> FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).</li>
<li>Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracarotid+delivery+of+oncolytic+HSV+vector+G47Delta+to+metastatic+breast+cancer+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain.</a> Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).</li>
<li>Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+Selenium+Supplementation+Modulates+Growth+of+Brain+Metastatic+Tumors+and+Changes+the+Expression+of+Adhesion+Molecules+in+Brain+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Trace+Elem+Res%22%5BJournal%5D)">Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels.</a> Biol Trace Elem Res. , (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A microcirurgia infusão descrito aqui tem provado ser muito bem sucedida no fornecimento de substâncias exógenas de vários recursos biológicos para o SNC, impedindo a divulgação indesejada por todo o corpo 1, 12. O rompimento da barreira sangue-cérebro é uma característica patológica de várias doenças relacionadas com o SNC; Por conseguinte, a avaliação da relação de substâncias exógenas com a barreira hemato-encefálica é de grande importância e interesse. <...

Em modelos in vivo do sistema nervoso central (SNC) doenças requerem uma entrega eficaz de substâncias exógenas, tais como drogas, agentes patogénicos, ou exossomas, para o cérebro. Por isso, um método de entrega ideal deve causar o mínimo de trauma para o animal, preservar a integridade da rede neuronal, e alcançar concentrações elevadas de substâncias no cérebro 1. Vários métodos cirúrgicos de distribuição de substâncias locais foram descritos, incluindo intra-bainha, intracerebral, e as injeções intraventricular ou implantes 2, 3, 4, 5. Estas abordagens, no entanto, são consideradas traumática do sistema nervoso central, e permitir a administração de apenas baixos volumes de a substância de interesse. Além disso, tem sido sugerido que as substâncias exógenas podem ser rapidamente removidos pelo fluido cerebrospinal 6 </s-se&gt;, e uma gama baixa de penetração para o parênquima cerebral foi observada 7 quando as técnicas acima mencionadas são empregues. Métodos de entrega sistêmicas, tais como oral, pulmonar, subcutânea e intravenosa, são mais comumente usados em modelos animais, embora eles apresentam baixa eficácia na entrega das substâncias para o SNC, devido à absorção por outros órgãos 8, 9. Portanto, estas vias de administração requerem doses elevadas de substâncias administradas, aumentando o risco de efeitos colaterais e toxicidade 10, 11. Aqui, descrevemos uma técnica de microcirurgia infusão do mouse, o que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna. Além de direccionamento da entrega ao CNS, esta técnica não ultrapassar barreiras fisiológicas normais e é portanto altamente relevantes para biological processos envolvidos nas passagens de agentes terapêuticos ou agentes patogénicos para o cérebro.

<table><tbody><tr><td>Instrumento de anestesia</td><td>Vetequip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Fine Science Tool</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica de ponta reta</td><td>Fine Science Tool</td><td>00108-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica de ponta angular</td><td>Fine Science Tool</td><td>00109-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de nylon</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 104</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar (Micro-Renathane 0.010" x 0.005" por pé)&nbsp;</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE01050</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de fechamento</td><td>VWR</td><td>95057-036</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-Trifeniltetrazólio cloreto</td><td>FisherScientific</td><td>50-121-8005</td><td></td></tr></tbody></table>

técnica do mouse microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no snc via artéria carótida interna

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Modelos animais de doenças do sistema nervoso central (SNC) e, consequentemente, doenças de ruptura da barreira hematoencefálica, requerem a entrega de substâncias exógenas no cérebro. Essas substâncias exógenas podem induzir impacto prejudicial ou constituir estratégia terapêutica. Os métodos mais comuns de entrega de substâncias exógenas no cérebro são baseados em entregas sistêmicas, como vias subcutâneas ou intravenosas. Embora comumente usadas, essas abordagens têm várias limitações, incluindo baixa eficácia de entrega no cérebro. Em contraste, os métodos cirúrgicos que entregam localmente substâncias no SNC são mais específicos e impedem a absorção das substâncias exógenas por outros órgãos. Vários métodos cirúrgicos para entrega do SNC estão disponíveis; no entanto, eles tendem a ser muito traumáticos. Aqui, descrevemos uma técnica de microcirurgia de infusão de camundongo, que efetivamente fornece substâncias ao cérebro através da artéria carótida interna, com trauma mínimo e sem interferência na funcionalidade normal do SNC.

A técnica de microcirurgia infusão rato aqui descrito é muito versátil e tem sido usado para fornecer substâncias diferentes diretamente no cérebro, incluindo a entrega de células de tumor em um modelo representativo da formação de metástases cerebrais 1, 12. Esta técnica também é adequado para avaliar os aspectos patológicos de diferentes agentes patogénicos no SNC. N...

O presente protocolo descreve uma técnica de infusão de microcirurgia de camundongo, que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna.

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC via Artéria carótida interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

O objetivo geral desta técnica cirúrgica é entregar substâncias exógenas no cérebro do camundongo sem penetrar no crânio. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na neurociência sobre a ação de drogas, patógenos e exossomos no cérebro. A principal vantagem dessa técnica é que ela causa trauma mínimo ao animal, preserva a integridade da rede neuronal e atinge altas concentrações da substância no cérebro.Comece administrando isoflurano misturado com oxigênio para anestesiar o camundongo em uma câmara de indução. Após a indução da anestesia, transfira o animal para a superfície cirúrgica sob um microscópio estéreo e coloque o cone do nariz para manter um plano cirúrgico de anestesia. Certifique-se de que a frequência respiratória esteja em torno de uma a duas respirações por segundo sem ofegar.Além disso, certifique-se de que o animal não reaja à estimulação do bigode ou a uma pitada no dedo do pé. Use um cotonete estéril para aplicar uma gota de lubrificante oftálmico em cada olho para evitar o ressecamento. Depois de raspar o local da cirurgia com uma navalha, prepare a área com etanol 70% e clorexidina.Enquanto olha pelo microscópio estéreo, use tesouras cirúrgicas e f

mouse-microsurgery-infusion-technique-for-targeted-substance-delivery

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Como neurociência inquérito se torna mais sofisticada investigação, de estruturas cerebrais e circuitos exige melhores níveis de precisão e de alta resolução. Nós desenvolvemos um método para a preparação e implantação de um sistema de infusão crônica no cérebro utilizando uma microcânula borosilicato com um diâmetro da ponta de 50 microns.

Construção e Implantação de um Sistema de Microinfusion para entrega Sustentada de Agentes neuroativos.

Fonte: Zamboni, M., et al., Indução de modificação de células leptomeníngeas via injeção intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o procedimento de administração de um medicamento indutor na cisterna magna de um camundongo anestesiado. A injeção induz seletivamente a expressão de marcadores fluorescentes em células da superfície cerebral acessíveis via líquido cefalorraquidiano, confirmado por imagens de fluorescência.

Entrega de medicamentos direcionados em um modelo de camundongo via injeção de cisterna magna

Fonte: Lim, M., et al. Modelagem de metástases cerebrais por injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2022)Neste vídeo, um camundongo anestesiado é submetido a um procedimento cirúrgico no qual células cancerígenas são injetadas na artéria carótida comum (CCA) para facilitar a entrega direcionada ao cérebro. O procedimento envolve sutura e manipulação precisas das artérias carótidas para direcionar as células injetadas para a artéria carótida interna (ACI),...

Modelagem de metástase de tumor cerebral por meio de injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna

Fonte: Leda, A. R., et al. Técnica de infusão de microcirurgia de camundongo para entrega de substância direcionada no SNC através da artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra um procedimento microcirúrgico projetado para facilitar a infusão direcionada de uma substância de teste no cérebro através da artéria carótida interna (ACI). O procedimento envolve sutura precisa e manipulação vascular para restringir temporariamente o fluxo sanguíneo, garantindo uma entrega...

Entrega de substâncias direcionadas ao cérebro do camundongo por meio de infusão na artéria carótida interna

Hemato-encefálica ruptura da barreira auxilia a distribuição de certas drogas para o cérebro. Manitol entregue intra-arterialmente células vizinhas encolhe vasos sanguíneos, a fim de interromper a barreira física.

Modelo de ratos de sangue-cérebro Rompimento de barreira para permitir alvejado Neurovascular Therapeutics

Metástases cerebrais tornou-se uma necessidade médica não atendida urgente como a sua incidência tem aumentado enquanto as opções terapêuticas têm permanecido paliativos. Criando modelos animais experimentais de metástase cerebral através de injecção arterial intracarotídeo de células cancerosas facilita estudos sobre os mecanismos da biologia da doença e avaliação de novos regimes de intervenção.

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Um método para fornecer células-tronco neurais, adaptáveis para soluções ou suspensões injetáveis, através da artéria carótida comum (mouse) ou artéria carótida externa (rato) após o derrame isquêmico ser relatado. As células injetadas são distribuídas amplamente por todo o parenchyma cerebral e podem ser detectadas até 30 d após o parto.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

O reparo da artéria intracarótida em um modelo de camundongo após a injeção retorna o fluxo sanguíneo para a artéria sem afetar negativamente a distribuição do material injetado. O reparo no local da injeção facilita as injeções subsequentes através da mesma artéria e previne a isquemia cerebral em cepas de camundongos que não possuem um Círculo de Willis completo.

Facilitando injeções intracarotídeas repetidas em modelos de camundongos por uma nova técnica de reparo no local da injeção

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a função das células imunes após AVC isquêmico usando análise de citometria de fluxo em um modelo de mini-AVC. Este método permite o exame detalhado das interações neuroimunes e pode ser adaptado para estudar outras doenças neurodegenerativas, aprimorando nossa compreensão das respostas imunes na patologia do AVC.

Isolamento e Avaliação por Citometria de Fluxo de Interações Neuroimunes em Modelo Murino Mini-AVC

Aprenda microcirurgia de infusão em camundongos para entrega de substâncias no cérebro via artéria carótida interna. Esta técnica minimiza trauma e preserva a integridade neuronal.

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