Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC via Artéria carótida interna
31 de janeiro de 2017
O presente protocolo descreve uma técnica de infusão de microcirurgia de camundongo, que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna.
O objetivo geral desta técnica cirúrgica é entregar substâncias exógenas no cérebro do camundongo sem penetrar no crânio. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na neurociência sobre a ação de drogas, patógenos e exossomos no cérebro. A principal vantagem dessa técnica é que ela causa trauma mínimo ao animal, preserva a integridade da rede neuronal e atinge altas concentrações da substância no cérebro.
Comece administrando isoflurano misturado com oxigênio para anestesiar o camundongo em uma câmara de indução. Após a indução da anestesia, transfira o animal para a superfície cirúrgica sob um microscópio estéreo e coloque o cone do nariz para manter um plano cirúrgico de anestesia. Certifique-se de que a frequência respiratória esteja em torno de uma a duas respirações por segundo sem ofegar.
Além disso, certifique-se de que o animal não reaja à estimulação do bigode ou a uma pitada no dedo do pé. Use um cotonete estéril para aplicar uma gota de lubrificante oftálmico em cada olho para evitar o ressecamento. Depois de raspar o local da cirurgia com uma navalha, prepare a área com etanol 70% e clorexidina.
Enquanto olha pelo microscópio estéreo, use tesouras cirúrgicas e fórceps para criar uma incisão na linha média no pescoço, acima do esterno até abaixo da mandíbula. Use uma pinça para separar cuidadosamente o tecido adiposo e conjuntivo para expor a traqueia. Em seguida, coloque um objeto macio e redondo de cerca de zero vírgula cinco centímetros de diâmetro sob a parte de trás do pescoço para estender o pescoço e expor ainda mais a área.
Em seguida, separe o tecido ao redor da traqueia usando ganchos ou um afastador de tecido. No lado esquerdo da traqueia, separe cuidadosamente o tecido conjuntivo para expor a artéria carótida comum esquerda, ou CCA. Usando uma pinça, remova cuidadosamente todo o tecido conjuntivo para expor a bifurcação da CCA no início das artérias carótidas externa e interna.
Uma vez que a ECA e a ACI estejam expostas, use uma pinça para colocar um segmento de sutura de náilon de um centímetro sob a artéria carótida externa. Em seguida, coloque um segundo segmento de um centímetro. Em seguida, dê um nó permanente no ponto mais alto possível do ECA.
No ponto mais baixo possível do ECA, imediatamente acima da bifurcação do CCA, dê um nó removível mais solto. Em seguida, use clipes de vaso para fechar o CCA no ponto mais baixo possível e para fechar o ICA. Fechar adequadamente a artéria carótida interna antes de fazer um pequeno corte na artéria carótida externa evitará o sangramento.
Agora, usando uma tesoura de mola de microdissecação, faça um corte de dois milímetros no ECA entre os dois nós. É importante manter os cortes pequenos, pois um corte grande causará vazamento da substância a ser infundida. Monte o sistema de infusão conectando seis polegadas de tubo capilar a uma seringa de tuberculina contendo 250 microlitros da substância a ser infundida.
Em seguida, insira suavemente a ponta do tubo capilar na incisão no ECA. Continue avançando a ponta até atingir a metade do caminho entre a bifurcação e o clipe no CCA. Amarre o nó ECA inferior.
Verifique se o nó está solto o suficiente para permitir a fluidez capilar e apertado o suficiente para evitar vazamentos. Em seguida, remova o clipe do ICA. Aplique pressão suavemente no pistão da seringa, permitindo a infusão da substância a aproximadamente 10 microlitros por segundo.
Após a perfusão da substância de ensaio, voltar a colocar o clipe no ICA. Remova cuidadosamente o tubo capilar. Em seguida, amarre completamente o nó ECA inferior.
Remova o clipe do ICA e do CCA. Em seguida, remova o retrator ou os ganchos de tecido e o travesseiro. Limpe a área a ser suturada com solução salina estéril e, em seguida, feche a incisão com suturas de náilon.
Depois de administrar um agente anti-inflamatório e analgésico aprovado para aliviar o desconforto pós-operatório, coloque o animal em uma gaiola sobre uma almofada de aquecimento por pelo menos uma hora e monitore a recuperação. Este histograma demonstra a detecção do HIV por PCR em tempo real sete dias após a infusão viral pela artéria carótida interna esquerda. Como esperado, os níveis do vírus são mais altos no hemisfério esquerdo.
Esta imagem de imunofluorescência mostra uma seção do cérebro de camundongo representando a tag GFP CD63, um marcador de exossomo, após a infusão de vesículas extracelulares através da artéria carótida interna. As vesículas extracelulares que expressam CD63, mostradas em verde, estão associadas ao microvaso cerebral do camundongo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 20 minutos se for executada corretamente.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de doenças neurodegenerativas explorarem interações medicamentosas, patógenos e exossomos em camundongos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve uma técnica de infusão por microcirurgia em camundongo que administra substâncias diretamente no cérebro por meio da artéria carótida interna. Minimiza o trauma e preserva a integridade neuronal, ao mesmo tempo em que atinge altas concentrações da substância no cérebro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microcirurgia
- Entrega de substâncias
Contexto
- Compreender as ações de fármacos no cérebro.
- Investigar os efeitos de patógenos e exossomos.
- Minimizar o trauma animal durante experimentos.
- Manter a integridade da rede neuronal.
Objetivo do Estudo
- Para administrar substâncias exógenas sem penetração no crânio.
- Para facilitar a pesquisa em neurociência.
- Para atingir altas concentrações de substâncias no cérebro.
Métodos Utilizados
- Administração de isoflurano misturado com oxigênio para anestesia.
- Transferência do camundongo para uma superfície cirúrgica sob um microscópio estereoscópico.
- Colocação de um cone nasal para manter a anestesia.
- Monitoramento da frequência respiratória durante o procedimento.
Resultados Principais
- Entrega bem-sucedida de substâncias no cérebro de camundongos.
- Trauma mínimo ao animal.
- Preservação da integridade da rede neuronal.
- Altas concentrações de substâncias alcançadas no cérebro.
Conclusões
- Esta técnica é eficaz para o estudo das funções cerebrais.
- Oferece uma alternativa menos invasiva aos métodos tradicionais.
- Aplicações futuras podem incluir testes de fármacos e modelagem de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A entrega direcionada ao SNC continua sendo um desafio crítico na descoberta de neuroterapêuticos devido à barreira hematoencefálica e à exposição sistêmica fora do alvo. Esta técnica de infusão microcirúrgica permite a administração precisa e de alta concentração de agentes experimentais diretamente no cérebro de camundongos, apoiando a validação mecanicista com redução de riscos e a fidelidade do modelo translacional. Sua mínima invasividade e a preservação da integridade neuronal tornam-na altamente relevante para a validação precoce de alvos e pesquisas préeclínicas no SNC.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta de alvos no SNC ao contornar barreiras sistêmicas.
- Apóia estudos mecanicistas da ação de fármacos, patógenos ou exossomos no tecido cerebral.
- Facilita a validação funcional de alvos com trauma confundente mínimo.
- Aprimora a confiança preditiva para portfólios direcionados ao SNC.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara modelos validados do SNC in vivo para ensaios farmacodinâmicos ou de biomarcadores posteriores.
- Garante entrega reprodutível e localizada para medição quantitativa de resultados.
- Reduz a variabilidade em comparação com vias de administração sistêmica.
- Permite avaliação confiável da penetração e do efeito do composto no cérebro.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos do SNC relevantes para doenças, para estudos translacionais de biomarcadores.
- Mantém a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, preservando redes neuronais.
- Apoia o avanço de candidatos direcionados ao SNC com base no ajuste de risco.
- Oferece uma plataforma para o estudo dos mecanismos de doenças neurodegenerativas e infecciosas do SNC.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa técnica de infusão se insere na interface entre a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica do SNC, permitindo a administração direta de substâncias para estudos mecanicistas e validação de alvos antes da otimização do composto líder.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a ação de fármacos no sistema nervoso central (SNC) e o envolvimento de vias metabólicas.
- Triagem: Oferece exposição quantitativa e reprodutível ao SNC para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Permite a medição da distribuição específica no cérebro e dos efeitos moleculares.
- Pesquisa Translacional: Facilita a integração com modelos e biomarcadores do SNC relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Fornece uma plataforma padronizada e de baixo trauma para administração no SNC, aplicável a diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos do SNC.
- Valor Operacional: Padroniza a administração no SNC com alta reprodutibilidade e trauma mínimo aos animais.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de ativos direcionados ao SNC e reduz riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas para o SNC com base em dados robustos in vivo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência e treinamento em microcirurgia para execução consistente.
- Requer acesso à estereomicroscopia e instrumentação de infusão precisa.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para reprodutibilidade.
- Pode exigir adaptação para diferentes modelos animais ou regiões do SNC.
- As limitações potenciais incluem curva técnica de aprendizado e duração do procedimento.
