Indução de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico e isquemia-reperfusão em ratos usando a técnica de oclusão da artéria Oriente e Visualização de infarto Área
2 de fevereiro de 2017
Descrevemos um modelo de camundongo de AVC induzido pela oclusão da artéria cerebral média usando uma sutura revestida de silicone. O protocolo pode ser aplicado para induzir oclusão permanente ou isquemia temporária, seguida de reperfusão.
O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é induzir oficialmente e de forma confiável o AVC isquêmico, deixando a artéria cerebral externa intacta. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa do AVC, como o impacto do tratamento na gravidade do AVC. A principal vantagem dessa técnica é que, após a indução do AVC, a artéria cerebral externa permanece disponível para infundir o tratamento diretamente no hemisfério afetado.
Coloque um camundongo anestesiado com isoflurano na superfície de cirurgia preparada e coloque um cone nasal para administrar isoflurano misturado com oxigênio. Certifique-se de que a frequência respiratória esteja em torno de uma a duas respirações por segundo sem ofegar. Além disso, certifique-se de que o animal não apresente uma reação à estimulação do bigode ou ao reflexo do pedal.
Coloque uma gota de lubrificante oftálmico em cada olho, usando um cotonete estéril para evitar que sequem durante o procedimento. Depois de raspar a área da incisão, desinfete completamente a área da cirurgia usando etanol a 70% e uma solução à base de clorexidina. Mantenha o animal em uma superfície cirúrgica quente sob um microscópio estéreo.
Em seguida, usando tesouras cirúrgicas e fórceps, faça uma incisão superficial na linha média no pescoço, acima do osso do peito até abaixo da mandíbula. Usando uma pinça, separe cuidadosamente os tecidos adiposo e conjuntivo para expor a traqueia. Os tecidos devem se separar fácil e naturalmente para ambos os lados.
Em seguida, coloque um travesseiro ou outro objeto redondo de cerca de 0,5 centímetros de diâmetro sob a parte de trás do pescoço para estender o pescoço e expor ainda mais a área para a cirurgia. Abra a incisão usando um afastador de tecido ou ganchos. Em seguida, no lado esquerdo da traqueia, separe cuidadosamente o tecido conjuntivo para expor a artéria carótida comum esquerda sem danificar os nervos próximos e as veias principais.
Em seguida, insira a pinça curva sob o CCA para perfurar o tecido conjuntivo e, em seguida, deixe-a abrir lentamente para liberar o CCA. Separe o CCA do tecido subjacente e exponha a ramificação superior da artéria cerebral interna e da artéria cerebral externa. Uma vez que o CCA é exposto, insira três segmentos de sutura de náilon sob o CCA.
Certifique-se de que o CCA não esteja torcido, pois isso complicaria drasticamente a inserção da sutura. Em seguida, no ponto mais baixo possível, feche a sutura inferior usando um nó permanente. Amarre a sutura superior logo abaixo da ramificação da ACI e ECA usando um nó corrediço removível.
Em seguida, amarre a sutura do meio usando um nó corrediço removível, mas mantenha-a bem aberta. Em seguida, usando uma tesoura de mola de microdissecação, crie um 0,2 milímetro no CCA entre as suturas inferior e intermediária mais próximas da sutura inferior. Usando uma pinça, insira a sutura MCAO na incisão da CCA, guiando-a em direção à sutura superior.
Em seguida, aperte suavemente o nó corrediço da sutura do meio no CCA para que ele restrinja o fluxo sanguíneo ao redor da sutura MCAO, mas fique solto o suficiente para permitir que a sutura MCAO se mova livremente. Agora desaperte cuidadosamente a sutura superior, certificando-se de que a sutura MCAO não escorregue. Insira a sutura MCAO alguns milímetros na ACI e, em seguida, feche novamente a sutura superior com um nó corrediço como antes.
Em seguida, guie a sutura MCAO para a área de oclusão, primeiro encaminhando-a para a ACI passando pela ECA, depois garantindo que a sutura permaneça na ACI, contornando a artéria pterigopalatina. A inserção é bem-sucedida se houver pouco refluxo sanguíneo da incisão da ACC e se a marca prateada de nove milímetros estiver situada entre a incisão da ACC e a bifurcação da ACI e da ECA. Após a oclusão bem-sucedida, amarre bem a sutura do meio e da parte superior e, em seguida, dobre as suturas na área da incisão.
Depois de remover o afastador ou os ganchos de tecido e o travesseiro, limpe a área de sutura usando solução salina estéril em um cotonete. Em seguida, feche a pele com sutura de náilon. Coloque o mouse em uma gaiola limpa situada em uma almofada aquecida para evitar hipotermia e permitir o acesso ad libitum à água e alimentos amolecidos.
Monitore o animal em busca de sinais de derrame por pelo menos cinco a 10 minutos. Dependendo do protocolo de isquemia e reperfusão, deixe a sutura MCAO no local de 30 minutos a 120 minutos ou mais. Após anestesiar o animal como antes e remover as suturas de fechamento da ferida, use fórceps e separadores de tecido para reabrir a incisão e expor o CCA.
Em seguida, remova cuidadosamente a sutura superior e puxe suavemente a sutura MCAO até que a parte revestida de silicone esteja situada no nó do meio. Refaça a sutura do nó superior para evitar que o sangue flua pela sutura MCAO. Em seguida, desfaça cuidadosamente o nó do meio e puxe a sutura MCAO além do nó superior, mantendo-o dentro do CCA.
Feche bem o nó superior para bloquear o fluxo sanguíneo da artéria. Em seguida, puxe completamente a sutura MCAO e feche bem o nó do meio. Feche a ferida e administre os cuidados pós-operatórios como antes.
Este esquema mostra a área de oclusão que resulta do procedimento demonstrado neste vídeo em azul. A área de cirurgia está localizada na parte inferior da figura, indicada pelo formato oval, e a colocação da sutura é indicada por linhas pretas. As imagens a seguir mostram a posição do TTC das seções cerebrais.
Esta imagem representa a coloração típica após a inserção simulada. A imagem é representativa do dano tecidual causado por um MCAO de 60 minutos, seguido de 90 minutos de reperfusão. Maior dano tecidual é observado após 24 horas de reperfusão, após um MCAO de 60 minutos.
A coloração imunofluorescente para o marcador neuronal MAP2 permite que a perda neuronal a partir de 60 minutos de oclusão, seguida de 23 horas de reperfusão, seja claramente visualizada na imagem à direita. A astrogliose é visível após a coloração imunofluorescente com GFAP. Na imagem à direita, a astroglia está concentrada na área adjacente ao dano tecidual no cérebro de isquemia e reperfusão, enquanto um padrão difuso de coloração é visto no controle operado por vergonha.
Ao tentar este procedimento, é importante monitorar o bem-estar do animal e o tempo de oclusão. Após este procedimento, outras técnicas, como análise de comportamento ímpar e imunofluorescência, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais sobre lesão tecidual e recuperação.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento cirúrgico para induzir acidente vascular cerebral isquêmico em um modelo murino por meio da oclusão da artéria cerebral média. O método permite que a artéria cerebral externa permaneça intacta, facilitando a infusão direta de tratamentos no hemisfério afetado.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre AVC
- Modelos Animais
Antecedentes
- O acidente vascular cerebral isquêmico é uma área crítica de estudo na neurociência.
- Compreender os impactos do tratamento na gravidade do acidente vascular cerebral é essencial.
- Manter a artéria cerebral externa durante a oclusão é vantajoso.
- Este modelo pode ser utilizado tanto para oclusão permanente quanto para isquemia temporária.
Objetivo do Estudo
- Induzir de forma confiável acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos.
- Explorar os efeitos de diversos tratamentos sobre os desfechos do acidente vascular cerebral.
- Fornecer um modelo para o estudo dos mecanismos e terapias do acidente vascular cerebral.
Métodos Utilizados
- Anestesia de camundongo com isoflurano e oxigênio.
- Colocação de sutura revestida com silicone para oclusão arterial.
- Monitoramento da frequência respiratória e reflexos durante a cirurgia.
- Infusão de tratamento pós-acidente vascular cerebral através da artéria cerebral externa.
Resultados Principais
- O procedimento induziu com sucesso um acidente vascular cerebral isquêmico.
- A artéria cerebral externa permaneceu intacta para a infusão do tratamento.
- Potencial para pesquisas adicionais sobre terapias para acidente vascular cerebral.
- O método demonstrou confiabilidade e reprodutibilidade.
Conclusões
- Este modelo é uma ferramenta valiosa para a pesquisa de acidente vascular cerebral.
- Permite a aplicação direta de tratamentos após a oclusão.
- Estudos futuros podem se basear nesta técnica fundamental.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em camundongos fornece um sistema confiável e reprodutível para induzir acidente vascular cerebral isquêmico focal, permitindo a avaliação pré-clínica de terapias neuroprotetoras e trombolíticas. Ao preservar a artéria cerebral externa, esta técnica possibilita a administração localizada de tratamentos, aprimorando a compreensão dos mecanismos subjacentes à patologia do acidente vascular cerebral e às vias de recuperação. A compatibilidade do modelo com variantes genéticas e ensaios comportamentais padronizados reforça sua utilidade nos esforços de validação de alvos e identificação de compostos promissores nas etapas de descoberta de fármacos em neurociência.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em uma lesão isquêmica definida, apoiando a clarificação de vias e a desmistificação biológica de alvos para acidente vascular cerebral.
- Valor Operacional: Facilita a indução consistente de infarto entre estudos, melhorando a reprodutibilidade em ensaios de engajamento de alvo e validação funcional.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera métricas quantificáveis de lesão tecidual por meio da coloração com TTC e imunofluorescência, permitindo análise dose-resposta de compostos candidatos.
- Valor Operacional: Permite o controle padronizado do tempo de reperfusão e oclusão baseada em sutura, possibilitando triagem escalonável de terapêuticas para acidente vascular cerebral em condições cirúrgicas controladas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a lesão por isquemia-reperfusão com controle temporal, permitindo a avaliação de efeitos terapêuticos tardios e o alinhamento de biomarcadores (por exemplo, MAP2, GFAP) com relevância translacional.
- Valor Operacional: Permite a infusão de tratamento pós-oclusão por meio da artéria cerebral externa intacta, simulando vias de administração clínicas e apoiando a continuidade pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo de OACM se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e a avaliação pré-clínica de eficácia, especialmente ao avaliar agentes neuroprotetores ou terapias de reperfusão.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos isquêmicos e modulação de vias em um modelo de lesão focal com topologia de lesão reprodutível.
- Triagem: Permite a avaliação quantitativa dos efeitos de compostos sobre o tamanho do infarto e déficit neurológico quando combinada com leituras comportamentais e histológicas.
- Análises: Fornece resultados mensuráveis, incluindo área do infarto (TTC), perda neuronal (MAP2) e astrogliose (GFAP), para análise comparativa entre grupos de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Modela sequências clinicamente relevantes de isquemia e reperfusão, permitindo a avaliação de janelas terapêuticas e abordagens de estratificação de pacientes baseadas em biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma cirúrgica padronizada aplicável a múltiplas modalidades terapêuticas e classes de alvos no desenvolvimento de fármacos para doenças cerebrovasculares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao modelar isquemia focal com acesso arterial preservado para a administração de tratamentos, reduzindo a ambiguidade mecanicista na fisiopatologia do acidente vascular cerebral.
- Valor Operacional: Oferece padronização do procedimento por meio do controle do tempo de oclusão e reperfusão baseado em sutura, melhorando a comparabilidade entre estudos.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de continuidade ou interrupção ao permitir a avaliação precoce do impacto do tratamento na gravidade do acidente vascular cerebral e nas trajetórias de recuperação.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos em neurociência por meio de modelagem confiável da lesão isquêmica e da resposta terapêutica.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas microcirúrgicas, incluindo isolamento de vasos e manipulação de suturas sob microscopia estereoscópica.
- Depende de instrumentação especializada, como tesouras de mola para microdissecação, pinças e materiais de sutura para posicionamento preciso da sutura na oclusão da artéria cerebral média (MCAO).
- Necessita de protocolos padronizados de anestesia e monitoramento fisiológico (por exemplo, frequência respiratória, ausência de reflexos) para garantir resultados cirúrgicos consistentes.
- Envolve considerações de adaptação entre diferentes linhagens de camundongos e modelos genéticos para manter a fidelidade da oclusão e a reprodutibilidade do infarto.
- Inclui limitações práticas, como o risco de deslizamento da sutura e variabilidade na eficácia da reperfusão, que devem ser gerenciadas por meio de treinamento e validação do procedimento.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Dissection of the Common Carotid Artery and Internal/External Branching
2:53
Preparation of the CCA for the MCAO Suture Insertion
3:51
Middle Cerebral Artery Occlusion
5:59
Reperfusion
7:07
Results: Characteristics of Brain Tissue Following Ischemia-Reperfusion
8:38
Conclusion
