Name: A remoção do biofilme uso de aerossóis de dióxido de carbono sem a purga de azoto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprenda a remover biofilmes usando aerossóis de dióxido de carbono sem purga de azoto. Este método rápido utiliza transferência de momentum e ação de surfactantes para limpar superfícies contaminadas por Pseudomonas putida de forma eficiente.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciências Básicas por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiada pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro (# 2015R1A2A2A01006446).

1. Preparação de Superfície para formação de biofilme <ol><li> Corte 1 mm de espessura 304 chapas de aço inoxidável em chips (10 × 10 mm 2) com um cortador mecânico. </li><li> Executar a limpeza ultra-sónica das fichas em acetona, metanol, e água desionizada (DI) sequencialmente água durante 10 min cada. Usar um recipiente resistente a solventes, feita de substâncias tais como vidro, para remover a contaminação orgânica. </li><li> Lave as batatas fritas com água de fluxo DI para 3-5 seg. </li><li> Secam-se as batatas fritas usando o fluxo de gás N2 durante 3-5 seg. </li></ol> 2. Preparação de uma cultura bacteriana <ol><li> Tome um P. putida KT2440 (gentilmente cedido pelo Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Coreia do Sul) Stock armazenado em um -80 ° C congelador. </li><li> Descongelar à temperatura ambiente após 1 min, e a camada de topo da solução estoque congelada transforma a lama. Imergir uma malha na camada derretida da solução estoque. </li><li> Utilize este loop para raia as bactérias em um Luriaplaca -Bertani (LB) contendo 1,5% de agar. </li><li> Incubar a placa durante a noite a 30 ° C para crescer as colónias bacterianas. </li><li> Escolher uma única colónia da placa utilizando um loop fresco. </li><li> Inocular 10 ml de caldo de LB num tubo cónico de 50 ml, com o loop contendo a colónia bacteriana único. </li><li> Incubar o caldo num incubador com agitação durante 16 horas a 30 ° C e 160 rpm. </li></ol> 3. formação de biofilme na superfície <ol><li> Pegue cada uma das fichas preparadas com uma pinça e mergulhá-los em 70% de etanol 5 vezes por 1-2 segundos cada, para esterilizar a superfície de cada chip. Certifique-se de que os chips são realizadas com uma pinça durante o mergulho. </li><li> Mergulhe cada chip em água DI autoclavado e em caldo LB sequencialmente, 5 vezes para 1-2 segundos cada, para remover o etanol remanescente. </li><li> Coloque esses chips em placas de cultura de 6 poços com 2 chips e 5 ml de caldo LB por poço. </li><li> Dilui-se a cultura bacteriana até que a concentração no caldo LB atinge8 x 10 8 culas / mL (densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda: ~ 0,8). </li><li> Inocular cada poço com 50 uL da cultura bacteriana diluída. </li><li> Incubar as placas a 30 ° C sem agitação durante 24 horas, para a formação de biofilmes. </li></ol> Lavagem 4. CO 2 Aerosol <ol><li> Mergulhe as batatas fritas em forma de biofilme em tampão de acetato de amónio 10 mM (voláteis) 5 vezes para remover frouxamente ligado e bactérias planctônicas. </li><li> Secar esses chips em uma cabine de segurança biológica, onde o ar flui suavemente. </li><li> Imediatamente após secagem, colocar um chip no local de carregamento, que é de 20 mm a partir do bico de CO 2 ao longo do eixo do jacto. Inclinação do eixo do jacto para um ângulo de 40 °. </li><li> Defina as pressões de estagnação de CO 2 e N 2 de gás para 5,3 MPa e 0,7 MPa, respectivamente, utilizando os reguladores de pressão de gás. </li><li> Aplicar o jacto de aerossol sobre a parte central do chip. Aerossóis brancas, incluindo o CO2 sólido deveser visível. &quot;Ligar&quot; a válvula solenóide de CO 2 durante 5 segundos e, em seguida, transformá-lo &quot;off&quot; por 3 segundos (ciclo: 8 seg) periodicamente, utilizando um interruptor controlado manualmente. Se uma purga de azoto necessita de ser usado, ligar a válvula de solenóide para um fornecimento contínuo de N 2. </li><li> Trate os chips com CO 2 aerossóis para 16, 40 e 88 segundos, com e sem purgas de azoto. Reter fichas sem tratamento como controlos negativos. </li></ol> 5. Análise para Eficiência de Remoção <ol><li> Prepare 1 mM ácido mancha de fluorescência nucleico verde (comprimento de onda de excitação / emissão: 480/500 nm) em água DI para corar células bacterianas no controle e batatas fritas tratados com aerossol. </li><li> Coloque as fichas na solução de coloração. </li><li> Incubar as batatas fritas em uma incubadora, sem luz, a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Após a incubação, lave as batatas fritas com água de fluxo DI para remover corante fluorescente excessiva. </li><li> Seque o wi fichasth fluxo de gás de N2. </li><li> Tome fluorescência imagens microscópicas de 5 campos aleatórios de vista (321 × 240 mm 2) para cada chip usando um microscópio de epifluorescência, uma lente objetiva de 40X, e uma câmera CCD. </li><li> Obter a intensidade de fluorescência para cada imagem usando um software de processamento de imagem, tais como ImageJ. No ImageJ, use a função &quot;Background Subtrair&quot; no menu &quot;Processos&quot;, e selecione &quot;densidade integrada&quot; na janela &quot;Definir Medidas&quot; no menu &quot;Analisar&quot;. Faça o &quot;Medição&quot; no menu &quot;Analisar&quot; para obter a intensidade de fluorescência. </li><li> Calcula-se a eficiência de remoção de biofilme de acordo com a seguinte fórmula:% 100 x (I de chips de controle - I de chips tratados) / (I de chips de controle), onde I é a intensidade de fluorescência calculado. </li><li> Obter a média de eficiência na remoção e desvios-padrão. use pelopelo menos 4 chips para cada caso. </li></ol>

<ol><li>Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+-+A+microbial+life+perspective%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Ther.+Drug%22%5BJournal%5D)">Biofilms - A microbial life perspective: A critical review.</a> Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).</li>
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<li>Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+different-age+biofilms+using+carbon+dioxide+aerosols%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioprocess+Eng%22%5BJournal%5D)">Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols.</a> Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Anteriormente, realizamos estudos de otimização na pressão do gás CO2 , ângulo do jato e distância da superfície sólida na limpeza com aerossol de CO2 7. Diferentemente de nossos estudos anteriores, no presente estudo, uma purga de nitrogênio não foi incluída no aerossol (Figura 1). Além disso, o aço inoxidável 304 foi utilizado neste protocolo, por ser um dos aços inoxidáveis mais comuns e amplamente utilizado na indústria alimentícia. A superfície polida é benéfica para...

Os biofilmes são estruturas complexas da comunidade bacteriana nas quais as células bacterianas são incorporadas em matrizes autoproduzidas de substâncias poliméricas extracelulares, mantidas juntas e protegidas do ambiente externo. Os biofilmes podem representar um risco à saúde pública e causar perdas econômicas porque podem se formar em várias superfícies, incluindo materiais e dispositivos de implantes médicos, equipamentos de processamento de alimentos e trocadores de calor. De fato, descobriu-se que os biofilmes estão associados a 65% de todas as doenças infecciosas bacterianas em humanos, de acordo com os Centros de Controle e Prevenção de Doenças.
Autoclaves e desinfetantes como o cloro têm sido geralmente usados para a inativação de biofilmes. No entanto, o uso de uma autoclave é limitado para superfícies que não suportam vapor de alta temperatura nem podem ser colocadas na autoclave. Os desinfetantes não são adequados para superfícies sensíveis ao tratamento químico ou propensas a coletar produtos tóxicos de oxidação2. Além disso, o biofilme não deve apenas ser inativado, mas também removido para evitar a fixação de novas células na superfície, formando assim um novo biofilme3. No entanto, é difícil remover biofilmes usando métodos baseados em cisalhamento de fluido viscoso porque a velocidade do fluxo perto da superfície é quase zero e a força de cisalhamento geralmente não pode superar as forças adesivas de substâncias de tamanho mícron e submícron. Além disso, a matriz do biofilme é conhecida por atuar como uma barreira física e química1.
Muitas técnicas físicas e mecânicas foram desenvolvidas para remover biofilmes de superfícies, incluindo vibração ultrassônica1, correntes elétricas4, irradiação a laser5 e sprays de água de alta pressão6. Cada técnica tem seus próprios prós e contras. A vibração ultrassônica e a corrente elétrica podem ser usadas para controlar a formação de biofilme; no entanto, eles requerem uma configuração particular e superfícies condutoras, respectivamente, exigindo tensão de cisalhamento adicional1, 4. A irradiação a laser pode ser aplicada a uma área limitada e a superfícies duras; no entanto, algumas células vivas e mortas permanecem na superfície5. Sprays de água de alta pressão removem efetivamente os biofilmes; no entanto, seu alto impulso pode causar danos aos substratos moles6.
A remoção de biofilme usando aerossóis de CO2 foi proposta anteriormente. Tem mostrado resultados promissores, com altas eficiências de remoção em um curto espaçode tempo 7-11. Os aerossóis de CO2 são gerados pela expansão adiabática de um gás CO2 de alta pressão através de um bico e são aplicados nas superfícies contaminadas com um biofilme. Esta técnica de limpeza utiliza a transferência de momento de partículas sólidas de CO2 e a ação solvente dos líquidos de CO2 derretidos, seguida pela força de cisalhamento aerodinâmica do gás CO2 12. Em comparação com jatos de gás N2 de alta pressão, os jatos de aerossol de CO2 na mesma pressão de estagnação são muito mais eficazes na remoção de biofilmes de E. coli 7. Além disso, embora o momento do CO2 sólido que é entregue às bactérias seja consideravelmente alto, o momento do jato de aerossol total aplicado à superfície sólida é substancialmente menor do que o dos jatos de água. Portanto, a limpeza sem danos é possível usando esta técnica de aerossol de CO2.
Neste protocolo, jatos periódicos de aerossóis de CO2 sem purgas de nitrogênio foram usados para remover biofilmes de Pseudomonas putida de uma superfície de aço inoxidável polido. De fato, as purgas de nitrogênio têm sido usadas em muitos estudos de aerossóis de CO2 para aumentar a eficiência de remoção, reduzindo a condensação de umidade gerada durante a limpeza, embora o aquecimento com placa quente ou lâmpadas infravermelhas e o emprego de caixas secas também tenham sido adotados12. A formação do biofilme superficial e os procedimentos de limpeza otimizados são descritos abaixo. A eficiência de remoção foi avaliada medindo-se a intensidade de fluorescência do biofilme na superfície.

<table><tbody><tr><td>Aço inoxidável 304</td><td>Steelni (Coreia do Sul)</td><td></td><td>Polidos e cortados em cubos</td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico</td><td>Branson (EUA)</td><td>5510E-DTH</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>Becton, Dickinson and Company (EUA)</td><td>244620</td><td>500 g</td></tr><tr><td></td><td>Agar Becton, Dickinson and Company (EUA)</td><td>214010</td><td>500 g</td></tr><tr><td>6 poços placa de cultura</td><td>SPL Life Sciences (Coreia do Sul)</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de acetato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich (EUA)</td><td>667404</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Unidade de gás dupla</td><td>Applied Surface Technologies (EUA)</td><td>K6-10DG</td><td>Um bico para CO2 gás e 8 bicos para gás N2</td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Thermo Fissher Scientific (EUA)</td><td>Excitação Invitrogen</td><td>: 480 nm Emissão: 500 nm</td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência&nbsp;</td><td>Nikon (Japão)</td><td>Lente objetiva Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>40X</td><td>Nikon (Japão)</td>Câmera CCD <td>Plan Fluor</td><td>NA: 0.75</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fotometria (EUA)</td><td>Cool SNAP HQ2</td><td>Monocromático</td></tr></tbody></table>

a remoção do biofilme uso de aerossóis de dióxido de carbono sem a purga de azoto

Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge

Os biofilmes podem causar sérias preocupações em muitas aplicações. Eles não apenas podem causar perdas econômicas, mas também podem representar um risco à saúde pública. Portanto, é altamente desejável remover biofilmes das superfícies. Muitos estudos sobre a limpeza de aerossóis de CO2 empregaram purgas de nitrogênio para aumentar a eficiência da remoção de biofilme, reduzindo a condensação de umidade gerada durante a limpeza. No entanto, neste estudo, jatos periódicos de aerossóis de CO2 sem purgas de nitrogênio foram usados para remover biofilmes de Pseudomonas putida de superfícies de aço inoxidável polido. Os aerossóis de CO2 são misturas de CO2 sólido e gasoso e são gerados quando o gás CO2 de alta pressão é expandido adiabaticamente através de um bico. Esses aerossóis de alta velocidade foram aplicados a um biofilme que havia sido cultivado por 24 horas. A eficiência de remoção variou de 90,36% a 98,29% e foi avaliada medindo-se a intensidade de fluorescência do biofilme, pois o tempo de tratamento variou de 16 segundos a 88 segundos. Também realizamos experimentos para comparar as eficiências de remoção com e sem purgas de nitrogênio; As eficiências de remoção de biofilme medidas não foram significativamente diferentes entre si (teste T, p > 0,55). Portanto, esta técnica pode ser usada para limpar várias superfícies biocontaminadas em um minuto.

CO 2 aerossóis foram usadas para remover o P. putida biofilmes de superfícies SUS304 (Figura 1). A maior parte das superfícies foram cobertas com o biofilme, após 24 h de crescimento. A maior parte do biofilme foi removido utilizando o CO 2 aerossóis (Figura 2). Como esperado, a Figura 3 mostra um aumento na eficiência de remoção do biofilme como o CO 2 tempo de tratamento de aerossol aumentou. Para o tempo de tratamento de 88 s...

Os biofilmes em superfícies podem ser removidos de forma eficaz e rápida usando um jato periódico de aerossóis de dióxido de carbono sem purga de nitrogênio.

A remoção do biofilme uso de aerossóis de dióxido de carbono sem a purga de azoto

Biofilms can cause serious concerns in many applications. Not only can they cause economic losses, but they can also present a public health hazard. ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar a eficácia da remoção de biofilmes utilizando aerossóis de dióxido de carbono sem uma purga de nitrogênio. Os aerossóis de dióxido de carbono podem ser usados para remover biofilmes por meio da transferência de momento e ação de surfactantes presentes nos aerossóis. Este é um método eficaz e confiável para remover biofilmes em um curto espaço de tempo, sendo também uma técnica de limpeza de biofilmes em fase gasosa.Para iniciar o experimento, utilize pastilhas de aço inoxidável 304 cortadas mecanicamente com espessura de 1 milímetro e dimensões internas de 10 x 10 milímetros quadrados. Em seguida, limpe as pastilhas ultrassonicamente em acetona, metanol e água desionizada ou DI, sequencialmente. Enxágue as pastilhas com água DI em fluxo contínuo por quatro segundos e, depois, seque-as usando fluxo de gás nitrogênio por quatro segundos.Retire um estoque de Pseudomonas putida KT2440 armazenado a 80 graus Celsius. Deixe o cultivo descongelar à temperatura ambiente por um minuto, quando a camada superior da solução congelada se transformar em uma pasta. Mergulhe um alça na camada derretida da solução estoque e estrie as bactérias em uma placa de Caldo Luria, ou placa LB, contendo 1,5% de ágar.Incube a placa durante a noite a 30 graus Celsius. No dia seguinte, adicione 10 mililitros de LB em um tubo cônico de 50 mL. Use um alça nova para selecionar uma única colônia da placa e inocular o meio LB. Incube o caldo em um incubador com agitação.Utilize pin&ccedil;as para pegar cada um dos chips preparados e mergulhe-os em etanol 70% cinco vezes, por 1-2 segundos cada vez, para esterilizar a superf&iacute;cie de cada chip. Em seguida, enxague cada chip em &aacute;gua desionizada ou DI autoclavada. Depois, em LB sequencialmente, para remover o etanol remanescente.Coloque os chips em placas de cultura de seis poços, com dois chips em cinco mililitros de caldo LB por poço. Em seguida, dilua a cultura bacteriana até que a concentração no caldo LB atinja 8 x 10⁸ células por mililitro. Inocule cada poço com 50 microlitros da cultura bacteriana diluída.Em seguida, incubar as placas. Mergulhar as lâminas com biofilme na solução tampão de acetato de amônio 10 milimolar cinco vezes para remover bactérias fracamente aderidas e bactérias planctônicas. Depois, secar as lâminas em uma cabine de segurança biológica com fluxo suave de ar.Imediatamente após a secagem, coloque um fragmento no local de carregamento, a 20 mililitros do bico de dióxido de carbono ao longo do eixo do jato. Incline o eixo do jato para um ângulo de 40 graus. Em seguida, ajuste as pressões de estagnação do gás dióxido de carbono e do gás nitrogênio utilizando reguladores de pressão de gás.Aplicar o jato de aerossol na parte central do chip. Ligar a válvula solenoide para dióxido de carbono por cinco segundos e, em seguida, desligá-la por três segundos periodicamente usando um interruptor controlado manualmente. Se for necessário usar uma purga com nitrogênio, ligar a válvula solenoide para um fornecimento contínuo de nitrogênio.Após a conclusão da configuração, trate as lâminas com aerossóis de dióxido de carbono com e sem purgações de nitrogênio e compare lâminas com diferentes tempos de tratamento com aerossol. Mantenha as lâminas sem tratamento como controles negativos. Prepare uma solução de um micromolar do corante verde fluorescente para ácidos nucleicos em água desionizada para coloração de células bacterianas nas lâminas tratadas com aerossol e nas de controle.Coloque a solução de coloração nas placas com os chips e incube-os. Após a incubação, lave suavemente os chips com água desionizada em fluxo para remover o corante fluorescente em excesso. Em seguida, seque os chips com fluxo de gás nitrogênio.Adquira imagens microscópicas de fluorescência de cinco campos aleatórios para cada chip utilizando um microscópio de epifluorescência. Por fim, prossiga para os cálculos. Imagens microscópicas de fluorescência de biofilmes de Pseudomonas putida cultivados por 24 horas foram tratadas com aerossóis de dióxido de carbono por zero, 16, 40 e 88 segundos, sem purga com nitrogênio.As eficiências de remoção calculadas com base nas intensidades de fluorescência dos biofilmes sem purga de nitrogênio foram maiores do que as eficiências de remoção com purga de nitrogênio. Como você viu neste vídeo, a técnica de limpeza tri-fásica remove efetivamente o biofilme em um curto período de tempo. Pode ser aplicada a uma ampla variedade de superfícies biocontaminadas.

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