Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi
25 de agosto de 2017
Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.
O objetivo geral deste procedimento é preparar simulações pareadas por idade e passagem em células endoteliais infectadas por KSHV para permitir o estudo de alterações associadas ao KSHV na expressão gênica da célula hospedeira, incluindo alterações que conduzem à transformação maligna no contexto de controles apropriados. Este método pode ajudar a definir as principais mudanças fisiopatológicas na biologia da célula hospedeira que levam a cânceres associados ao KSHV, identificando assim novos alvos terapêuticos para prevenção ou tratamento de doenças. A principal vantagem deste sistema é que a transformação maligna das células endoteliais após a infecção por KSHV ocorre de forma rápida e reprodutível, permitindo o estudo de eventos precoces no processo oncogênico com células de controle pareadas por idade e passagem.
Embora esse modelo de oncogênese viral possa fornecer informações sobre o desenvolvimento do sarcoma de Kaposi, ele também pode ser aplicado a outros tipos de câncer. Como o Sarcoma de Kaposi é um tumor vascular, as implicações desse modelo de cultura de células se estendem à compreensão de outros processos patológicos impulsionados pela angiogênese patológica. Para começar, prepare e filtre o tampão TNE esterilizado conforme descrito no protocolo de texto.
Em seguida, armazene a solução a quatro graus Celsius. Cultive a linha celular de linfoma de efusão primária BCBL-1 positiva para EBV positivo para KSHV em um frasco T150 cheio de 60 mililitros de meio RPMI. Mantenha as células a 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono para obter uma suspensão de aproximadamente 1 a 1,2 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro.
Uma vez atingida a densidade adequada, divida as células de um a dois com meio fresco e adicione PMA a uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro para induzir a produção de KSHV. Em seguida, incube as culturas por cinco dias. Após cinco dias de incubação, colha as partículas virais girando as suspensões celulares a 300 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, transfira os sobrenadantes para um novo tubo. Centrifugue os sobrenadantes mais uma vez a 2.500 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos para remover os detritos celulares. Agora que está esclarecido, cubra cinco mililitros de solução de sacarose a 25% em TNE com aproximadamente 30 mililitros do sobrenadante em seis tubos de ultracentrífuga.
Centrifugue os tubos balanceados a 75.000 vezes g por duas horas a quatro graus Celsius sob vácuo. Uma vez concluída a centrifugação, decantar o sobrenadante e secar a borda de cada tubo para remover o máximo possível do líquido. Em seguida, ressuspenda o vírus peletizado em 150 microlitros de tampão TNE e agrupe todas as amostras.
Misture bem a suspensão agrupada e divida-a em alíquotas de 25 microlitros. Armazene o vírus de estoque a menos 80 graus Celsius. Cultura de células endoteliais dérmicas ou linfáticas humanas primárias em meio EGM em frasco T75.
Mantenha a cultura de células a 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono até que aproximadamente 50% de confluência seja alcançada. Antes da transdução das células endoteliais, cultive as células PA317 LXSN 16E6E7 em um frasco de cultura de células T150 preenchido com 20 mililitros de DMEM a 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono. Uma vez que aproximadamente 90% de confluência seja alcançada, substitua o meio da cultura de células PA317 por 16 mililitros de meio fresco e incube as células durante a noite.
Após uma incubação durante a noite, recolher o meio da cultura de células PA317 e clareá-lo por centrifugação a 300 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Substitua o meio EGM de cultura de células endoteliais 50% confluentes por 12 mililitros do meio PA317 clarificado. Incube as células por quatro horas.
Em seguida, substitua seis mililitros do meio PA317 por seis mililitros de meio EGM fresco e incube as células durante a noite. Em seguida, remova o meio da cultura de células endoteliais e alimente as células com 12 mililitros de EGM fresco. Continue a incubar as células por mais 48 horas.
Para subcultivar células endoteliais, remova o meio e lave as células com 12 mililitros de PBS livre de cátions. Em seguida, adicione três mililitros de uma solução de dissociação enzimática comercial e incube as células a 37 graus Celsius por três minutos. Transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar as células a 300 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Uma vez peletizada, ressuspender as células em meio EGM fresco e dividir a suspensão uniformemente em três balões T75. Ajustar o volume das culturas a 12 mililitros de EGM por balão. Em seguida, adicione 200 microgramas por mililitro de G418 para selecionar as células endoteliais transduzidas.
Colha as células endoteliais transduzidas por digestão enzimática, conforme mostrado anteriormente. Ressuspenda o pellet de células endoteliais em um mililitro de meio EGM. Em seguida, misture cinco microlitros da suspensão celular com 45 microlitros de solução de azul de tripano e conte as células viáveis usando um hemocitômetro.
Semeie 2,5 vezes 10 para as quintas células viáveis em dois mililitros de meio EGM por poço de uma placa de seis poços. No dia seguinte, remova o meio EGM e lave as células em cada poço com três mililitros de PBS com cálcio e magnésio. Em seguida, adicione dois mililitros de meio EBM a cada poço.
Para infectar células com KSHV, adicione de cinco a 20 microlitros do estoque de vírus a cada poço e gire a placa para misturar as suspensões. Adicione um volume igual de tampão TNE a cada poço contendo células infectadas simuladas. Depois de centrifugar a placa a 400 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente, incube-a a 37 graus Celsius por 90 minutos.
Em seguida, adicione dois mililitros de meio EGM a cada poço e incube as culturas durante a noite. Após a incubação, remova o meio EGM de cada poço e substitua-o por dois mililitros de EGM novo. Quando as células atingirem uma confluência de aproximadamente 90%, colha-as por digestão enzimática, conforme mostrado anteriormente.
Agrupe as células de três poços em um frasco T75 marcado com o número total de passagens na passagem pós-infecção. Antes de testar ou congelar, expanda as culturas de células endoteliais simuladas e infectadas com KSHV, dividindo-as de um a três por pelo menos duas passagens adicionais. Apresentamos aqui uma imagem microscópica de células endoteliais infectadas por simulações confluentes, revelando a aparência clássica de paralelepípedos.
A divisão celular nessas células é inibida ao entrar em contato quando a cultura atinge a confluência. As células endoteliais infectadas com KSHV desenvolvem morfologia fusiforme alongada que lembra as células fusiformes do sarcoma de Kaposi. Ao contrário das células infectadas por simulação, as células endoteliais infectadas por KSHV continuam a proliferar mesmo quando atingem a confluência, levando ao desenvolvimento de focos de células multicamadas.
Ao perder o contato com o substrato, as células endoteliais infectadas por simulados sofrem uma morte celular apoptótica, anoikis, além de não formarem colônias em ágar mole. Pelo contrário, as células infectadas por KSHV são resistentes a anoikis e colônias em crescimento quando cultivadas em ágar mole. O desenvolvimento da morfologia fusiforme em células endoteliais infectadas por KSHV é acompanhado pela expressão da proteína de latência viral ORF73 e, em menor grau, um fator de processividade viral ORF59.
Quando infectadas com KSHV BAC16 marcado com uma proteína fluorescente verde, as células endoteliais desenvolveram morfologia fusiforme e demonstraram expressão de GFP, confirmando a relação casual entre a infecção por KSHV no fenótipo observado. Após seu desenvolvimento, esse modelo de cultura de células abriu caminho para os pesquisadores avaliarem as alterações do mRNA da célula hospedeira e da expressão de proteínas induzidas pela infecção por KSHV. Consequentemente, foram identificados os principais mecanismos patogênicos subjacentes à oncogênese mediada por KSHV que representam alvos terapêuticos promissores.
Não se esqueça, o KSHV é um agente BSL-2 e deve ser tratado com procedimentos e práticas de contenção de biossegurança apropriados.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um modelo para o estudo dos mecanismos do sarcoma de Kaposi (KS) induzido pela infecção pelo KSHV. O sistema de cultivo de células endoteliais permite a análise de alterações na expressão gênica da célula hospedeira associadas à transformação maligna.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Infecções virais oncogênicas
- Biologia de células endoteliais
- Pesquisa sobre sarcoma de Kaposi
Antecedentes
- O sarcoma de Kaposi está associado à infecção pelo VHSK.
- O estudo concentra-se na transformação de células hospedeiras pelo VHSK.
- Compreender esses mecanismos pode levar à identificação de novos alvos terapêuticos.
- O modelo também pode ser aplicado a outros tipos de câncer impulsionados pela angiogênese.
Objetivo do Estudo
- Preparar células endoteliais não infectadas e infectadas com KSHV para comparação.
- Estudar alterações na expressão gênica relacionadas à transformação maligna.
- Identificar alterações fisiopatológicas-chave na biologia da célula hospedeira.
Métodos Utilizados
- Preparação de células endoteliais pareadas por idade e passagem.
- Infecção das células com KSHV.
- Análise das alterações na expressão gênica.
- Uso de controles apropriados para comparação.
Resultados Principais
- Transformação maligna rápida e reprodutível de células endoteliais.
- Identificação de eventos oncogênicos iniciais em células infectadas pelo KSHV.
- Compreensão dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento do sarcoma de Kaposi.
- Implicações potenciais para o entendimento de outras doenças impulsionadas pela angiogênese.
Conclusões
- O modelo de cultura de células endoteliais é eficaz para estudar a oncogênese do KSHV.
- As descobertas podem levar a novas estratégias terapêuticas para o SS e cânceres relacionados.
- Este modelo pode aprimorar a compreensão da angiogênese patológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo permite o estudo reproduzível da transformação de células endoteliais induzida pelo VSHK, fornecendo um sistema controlado para identificar eventos oncogênicos iniciais e alterações nas células hospedeiras associadas à transformação maligna. Ao permitir comparações emparelhadas por idade e número de passagens, reduz a variabilidade biológica e aumenta a confiabilidade na validação de alvos na pesquisa de câncer impulsionada por angiogênese. A aplicabilidade do sistema a outros modelos de tumores vasculares amplia seu valor para a redução de riscos mecanicistas em pipelines oncológicos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os mecanismos de oncogênese viral em células endoteliais com controles genéticos definidos.
- Valor Operacional: Apoia fenótipos de transformação rápidos e reprodutíveis para triagem consistente de alvos.
- Valor Preditivo: Facilita a identificação de vias hospedeiras induzidas pelo VSHK com potencial terapêutico.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Fornece uma plataforma padronizada para avaliar os efeitos de compostos sobre marcadores de transformação induzida pelo KSHV.
- Valor Operacional: Permite a quantificação da morfologia em fuso, resistência à anoique e formação de colônias em ágar mole como leituras fenotípicas.
- Escalabilidade: Permite a expansão e o armazenamento de linhagens celulares infectadas e controle pareadas para estudos longitudinais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona proteínas virais de latência (ORF73, ORF59) à transformação fenotípica para alinhamento de biomarcadores.
- Valor Operacional: Mantém culturas infectadas e controle em passagens equivalentes para garantir que as alterações observadas sejam específicas da infecção.
- Continuidade Tradutiva: Modela a angiogênese patológica relevante para o SS e outras malignidades impulsionadas pela angiogênese.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a testagem de hipóteses sobre oncogenes virais e modulação de vias do hospedeiro antes dos esforços de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao isolar efeitos específicos do VSHK na transformação endotelial utilizando controles isogênicos.
- Triagem: Gera saídas quantitativas baseadas em morfologia, passíveis de automação e análise de alto conteúdo.
- Análises: Produz pontos finais mensuráveis, incluindo expressão de proteínas virais, proliferação sob inibição por contato e crescimento independente de aderência.
- Pesquisa Translacional: Conecta a transformação in vitro a fenótipos angiogênicos observados em lesões de SS.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de células endoteliais para o estudo de outros processos angiogênicos ou oncogênicos virais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na oncogênese viral por meio de modelos de infecção controlados e reprodutíveis.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação celular, infecção e avaliação de transformação entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança na seleção de alvos ao associar alterações moleculares a fenótipos funcionais de transformação.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização precoce de vias que impulsionam a tumorigênese dependente de angiogênese.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em transdução viral, cultivo de células endoteliais e contenção BSL-2 para manipulação do KSHV.
- Depende do acesso a células produtoras PA317 LXSN 16E6E7 e à preparação de estoque de KSHV por ultracentrifugação.
- Necessita reagentes padronizados, incluindo EGM, EBM, tampão TNE, G418 e PMA, para resultados consistentes.
- Requer adaptação ao ser estendido a fontes de células endoteliais linfáticas ou outras microvasculares.
- Limitado pela necessidade de cultivo prolongado para observar fenótipos completos de transformação, incluindo morfologia em fuso e crescimento em ágar mole.
