Expansão Nanopatterned Substratos usar a técnica do ponto de Nanotopographical modulação do comportamento celular

O objetivo geral deste procedimento é produzir uma grande área de substrato nanopadronizado a partir de pequenos moldes nanopadronizados usando uma técnica de ponto simples e acessível, mas versátil. Este método pode ajudar a estudar a modulação nanotopográfica do substrato do fenótipo celular e da função nos níveis celular e molecular, como a expressão de proteínas de adesão focal. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples e econômica.

Para começar, prepare o molde de silício silanizado no pré-polímero PDMS, conforme descrito no protocolo de texto. Coloque o molde de silicone silanizado em uma placa de Petri de 60 milímetros. Despeje o pré-polímero PDMS no molde de silicone na placa de Petri.

Coloque a placa de Petri em um dessecador de plástico e desgaseifique por cerca de 10 minutos, até que todas as bolhas desapareçam. Transfira a placa de Petri para uma placa quente e cure o pré-polímero PDMS a 70 graus Celsius por quatro horas. Retire cuidadosamente o molde PDMS do molde de silicone usando uma pinça.

Determine a orientação dos nanopadrões PDMS anisotrópicos, como nanogrades, sob um microscópio óptico e marque-o na parte de trás dos moldes PDMS com uma caneta marcadora. Limpar o substrato de silício com etanol numa hotte e depois secá-lo com ar comprimido. Apare as áreas não padronizadas de cada molde PDMS com uma lâmina.

Os moldes PDMS devem ser alinhados o mais próximo possível, mas sem tocar no molde circundante, para minimizar a área sem padrão e evitar tocar na deformação do nanopadrão quando a força do compressor é aplicada. Coloque o molde PDMS aparado com o nanopadrão voltado para baixo no lado do espelho do substrato de silício e, em seguida, alinhe outros moldes próximos, mas sem tocar nos moldes circundantes. É fundamental tentar curar o PDMS na camada basal porque o PDMS não curado pode fluir através da lacuna entre os vários moldes e danificar os nanopadrões.

No entanto, o PDMS completamente curado não pode unir os vários moldes. Para preparar uma camada adesiva PDMS, funda um grama de pré-polímero PDMS desgaseificado em uma lâmina de vidro limpa para formar uma camada de 0,5 milímetro de espessura. Asse a camada PDMS a 100 graus Celsius em uma chapa quente por três a cinco minutos.

Use uma agulha para tocar a camada e certifique-se de que a camada esteja parcialmente, mas não completamente curada. Coloque a camada PDMS na parte traseira dos moldes PDMS alinhados, inverta rapidamente este conjunto e transfira-o para a placa quente. Aplique uma força de compressão usando um bloco de metal na parte superior do conjunto para garantir um bom contato entre a camada adesiva PDMS e a parte traseira dos moldes PDMS.

Catalise a camada adesiva PDMS a 100 graus Celsius por uma hora. Desligue a placa quente, remova o bloco de metal e retire o molde PDMS de costura única do substrato de silicone. Para nanoimprimir o molde PDMS costurado na placa PS, coloque a placa PS em um espaçador de alumínio colocado em um wafer de silício de três polegadas.

Aqueça a placa PS em uma placa quente a 250 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, coloque o molde PDMS costurado, com nanopadrões voltados para baixo, na placa PS fundida. Em seguida, coloque uma placa de alumínio na lâmina de vidro do molde PDMS costurado.

Aplique uma pressão de compressão usando blocos de metal na placa de alumínio e aguarde três minutos. Levante e substitua o bloco de metal da placa de alumínio e aumente a pressão de compressão para 25 quilopascais. Em seguida, repita esta etapa com a pressão aumentada para 50 quilopascais.

Manter a temperatura da placa de aquecimento entre 240 e 250 graus Celsius sob pressão constante de 50 quilopascais durante 15 minutos. Desligue a placa quente e resfrie toda a configuração. Remova os blocos de metal depois que a temperatura estiver abaixo de 50 graus Celsius e retire cuidadosamente o molde PDMS costurado da placa PS.

Para nanoimprimir o molde PDMS em um filme fino PS, coloque o molde PDMS costurado com nanotopografia voltada para baixo no filme fino PS, que é colocado em uma placa quente. Aplique pressão compressiva de 12 quilopascais no molde PDMS usando blocos de metal na corrediça de vidro do molde PDMS. Aumente a temperatura da placa de aquecimento para 180 graus Celsius e mantenha-a por 15 minutos.

Desligue a placa quente e resfrie toda a configuração. Remova os blocos de metal depois que a temperatura cair abaixo de 50 graus Celsius e retire cuidadosamente o molde PDMS costurado do filme PS. Usando um punção de arco de aço oco, corte os substratos PDMS nanopadronizados em discos para se ajustar à configuração de uma placa específica de vários poços.

Em seguida, use uma pinça para colocar os discos PDMS nos poços da placa de vários poços. Esterilize os substratos PDMS usando etanol 70% por 30 minutos. Em seguida, aspirar o etanol e, em seguida, expor-se aos raios UV durante 30 minutos.

Lave os substratos PDMS com solução salina tamponada com fosfato estéril 1X três vezes. Em seguida, cubra os substratos PDMS com proteína da matriz extracelular por 30 minutos à temperatura ambiente. Enxágue os substratos PDMS três vezes com PBS estéril, cada uma por cinco minutos.

Suspenda as células humanas de câncer de pulmão A549 no Modified Eagle Medium da Dulbecco com 10% de soro bovino fetal e conte as células usando um hemocitômetro. Plaquear as células com uma densidade de semeadura de 2.000 células por centímetro quadrado nos substratos PDMS. Cultive as células a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de carbono por um dia e observe-as depois.

O nanopadrão gerado na placa PS e o filme fino são mostrados aqui. As setas indicam o aumento do polímero nos interstícios dos moldes PDMS costurados. Essas imagens SEM demonstram que os substratos de trabalho PDMS são fielmente transferidos do nanopadrão escrito por litografia de feixe de elétrons aplicando a técnica de ponto.

Imagens representativas de SEM de células A549 cultivadas em nanogrades e nanopilares são mostradas aqui. As células mostram morfologia celular alinhada nas nanogrades, enquanto as células se espalham aleatoriamente nos nanopilares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar uma grande área de substrato nanopadronizado costurando vários moldes nanopadronizados pequenos e definidos.

Não se esqueça de que trabalhar com tolueno e paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e sempre use equipamentos de proteção individual adequados durante a execução dos procedimentos.