Expansão Nanopatterned Substratos usar a técnica do ponto de Nanotopographical modulação do comportamento celular

O objetivo geral deste procedimento é produzir uma área ampla de substrato com nanoestruturas a partir de moldes pequenos com nanoestruturas, utilizando uma técnica de costura simples, acessível e ao mesmo tempo versátil. Este método pode auxiliar no estudo da modulação da fenotipagem e função celulares pela nanotopografia do substrato em níveis celulares e moleculares, como a expressão de proteínas de adesão focal. A principal vantagem desta técnica é sua simplicidade e baixo custo.

Para começar, prepare o molde de silício silanizado no pré-polímero de PDMS, conforme descrito no protocolo textual. Coloque o molde de silício silanizado em uma placa de Petri de 60 milímetros. Despeje o pré-polímero de PDMS sobre o molde de silício na placa de Petri.

Coloque a placa de Petri em um dessecador plástico e desgaseifique por cerca de 10 minutos, até que todas as bolhas desapareçam. Transfira a placa de Petri para uma placa aquecedora e cure o pré-polímero de PDMS a 70 graus Celsius por quatro horas. Remova cuidadosamente o molde de PDMS do molde de silício usando pinças.

Determine a orientação de padrões anisotrópicos de PDMS, como grades nanométricas, utilizando um microscópio óptico e marque-a no lado oposto dos moldes de PDMS com uma caneta marcadora. Limpe o substrato de silício com etanol em uma cabine de exaustão e, em seguida, seque-o com ar comprimido. Remova as áreas não padronizadas de cada molde de PDMS com uma lâmina.

As moldes de PDMS devem ser alinhadas o mais próximo possível, mas sem tocar a moldagem circundante, para minimizar a área não padronizada e evitar o contato que possa deformar o nanopadrão quando a força compressora for aplicada. Posicione a moldagem de PDMS recortada com a face do nanopadrão voltada para baixo sobre o lado espelhado do substrato de silício e, em seguida, alinhe as outras moldes próximas, mas sem tocar as moldes circundantes. É fundamental tentar curar o PDMS na camada basal, pois o PDMS não curado pode fluir através do espaço entre as múltiplas moldes e danificar os nanopadrões.

No entanto, o PDMS completamente curado não pode unir os moldes múltiplos. Para preparar uma camada adesiva de PDMS, despeje um grama do prepoliímero de PDMS dessurgasado sobre uma lâmina de vidro limpa para formar uma camada com espessura de 0,5 milímetro. Incube a camada de PDMS a 100 graus Celsius em uma placa aquecedora por três a cinco minutos.

Use uma agulha para tocar a camada e certifique-se de que a camada está parcialmente, mas não completamente, curada. Coloque a camada de PDMS no lado posterior dos moldes de PDMS alinhados, inverta rapidamente esta montagem e transfira-a para a placa aquecedora. Aplique uma força compressiva usando um bloco de metal na parte superior da montagem para garantir um bom contato entre a camada adesiva de PDMS e o lado posterior dos moldes de PDMS.

Cure a camada adesiva de PDMS a 100 graus Celsius por uma hora. Desligue a placa aquecedora, remova o bloco de metal e retire cuidadosamente o molde de PDMS com costura única do substrato de silício. Para nanoimprimir o molde de PDMS com costura na placa de PS, coloque a placa de PS em um espaçador de alumínio posicionado sobre uma pastilha de silício de três polegadas.

Aqueça a placa de PS em uma placa aquecedora a 250 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, coloque o molde de PDMS costurado, com os nanopadrões voltados para baixo, sobre a placa de PS fundida. A seguir, coloque uma placa de alumínio sobre a lâmina de vidro do molde de PDMS costurado.

Aplicar uma pressão compressiva utilizando blocos de metal sobre a placa de alumínio e aguardar três minutos. Levantar e substituir o bloco de metal da placa de alumínio e aumentar a pressão compressiva para 25 quilopascais. Em seguida, repetir este passo com a pressão aumentada para 50 quilopascais.

Mantenha a temperatura da placa aquecida entre 240 e 250 graus Celsius sob pressão constante de 50 quilopascals por 15 minutos. Desligue a placa aquecida e resfrie todo o conjunto. Remova os blocos de metal após a temperatura cair abaixo de 50 graus Celsius e retire cuidadosamente o molde de PDMS costurado da placa de PS.

Para nanoimprimir o molde de PDMS em uma película fina de PS, coloque o molde de PDMS com a nano-topografia voltada para baixo sobre a película fina de PS, posicionada em uma placa aquecedora. Aplique uma pressão compressiva de 12 kilopascals sobre o molde de PDMS utilizando blocos metálicos no lâmina de vidro do molde de PDMS. Aumente a temperatura da placa aquecedora até 180 graus Celsius e mantenha por 15 minutos.

Desligue a placa aquecedora e resfrie todo o conjunto. Remova os blocos de metal após a temperatura cair abaixo de 50 graus Celsius e retire cuidadosamente o molde de PDMS costurado do filme de PS. Usando um furador cilíndrico de aço, corte os substratos de PDMS com nanopadrões em discos para ajustá-los à configuração de uma placa de múltiplos poços específica.

Em seguida, use pinças para colocar os discos de PDMS nos poços da placa de múltiplos poços. Esterilize os substratos de PDMS utilizando etanol 70% por 30 minutos. Posteriormente, aspire o etanol e exponha à luz UV por 30 minutos.

Lave os substratos de PDMS com solução salina tamponada com fosfato estéril 1X três vezes. Em seguida, recubra os substratos de PDMS com proteína da matriz extracelular por 30 minutos à temperatura ambiente. Enxágue os substratos de PDMS três vezes com PBS estéril, cada vez por cinco minutos.

Suspenda as células humanas de câncer de pulmão A549 em meio de Eagle modificado por Dulbecco com 10% de soro bovino fetal e conte as células utilizando um hemocitômetro. Plaque as células com uma densidade de semeadura de 2.000 células por centímetro quadrado sobre os substratos de PDMS. Incube as células a 37 graus Celsius em atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de carbono por um dia e observe-as posteriormente.

O nanopadrão gerado na placa de PS e na película fina é mostrado aqui. As setas indicam o aumento do polímero nas interstícios dos moldes de PDMS costurados. Essas imagens de ME demonstram que os substratos de trabalho de PDMS são transferidos fielmente a partir do nanopadrão escrito por litografia com feixe de elétrons mediante a aplicação da técnica de costura.

Imagens representativas de MEV de células A549 cultivadas em nanorelheamentos e nanopilares são mostradas aqui. As células exibem morfologia alinhada nos nanorelheamentos, enquanto se espalham aleatoriamente nos nanopilares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar uma área ampla de substrato com nanopadrões por meio da união de vários moldes pequenos e definidos com nanopadrões.

Não se esqueça de que trabalhar com tolueno e paraformaldeído pode ser extremamente perigoso, e use sempre equipamento de proteção individual apropriado ao realizar os procedimentos.