3D quantitativa In Silico Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer

O objetivo geral desta modelagem quantitativa 3-D in silico, ou técnica q3DISM, é quantificar a captação de beta-amilóide por fagócitos mononucleares no cérebro de modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método atende a uma necessidade premente no campo da pesquisa de Alzheimer para quantificar a depuração da beta-amilóide que é depositada no cérebro de pacientes com Alzheimer formando placas senis. Pela primeira vez, esta técnica permite a verdadeira reconstrução 3-D e quantificação de beta-amilóide por macrófagos in vivo Começamos a usar o 3-Dism para estudar a deposição de beta-amilóide porque precisávamos de uma ferramenta robusta para visualizar e quantificar a fagocitose de micrófagos in vivo.

Essa técnica pode ser útil no teste de terapias experimentais para a doença de Alzheimer para avaliar quais drogas estimulam os macrófagos para a depuração eficiente da beta-amilóide. Quando as amostras de tecido estiverem prontas para imunocoloração, preencha a região de tecido circundada por caneta de barreira hidrofóbica com tampão de bloqueio para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente em uma câmara umidificada. No final da incubação, substitua o tampão de bloqueio pelo primeiro anticorpo primário de interesse durante a noite a 4 graus Celsius na câmara umidificada.

Na manhã seguinte, lave as amostras em três banhos PBS de cinco minutos em temperatura ambiente com leve agitação. Após a terceira lavagem, incubar as lâminas com o anticorpo secundário fluorescente adequado à temperatura ambiente e protegido da luz. Após uma hora, lave as seções mais três vezes em PBS protegido da luz.

Em seguida, rotule as células com os outros anticorpos primários e secundários apropriados ao tecido de interesse nos próximos dois a quatro dias, conforme demonstrado. Para corar eficientemente os compartimentos celulares e supercelulares e os depósitos de beta-amilóide, é crucial marcar com apenas um anticorpo primário de cada vez, seguido pelo anticorpo secundário correspondente. Um processo demorado, mas otimizador de resultados.

Após a última lavagem da coloração secundária de anticorpos, deixe as seções secarem completamente durante a noite em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, cubra os espécimes secos com uma lamínula selada por meio de montagem fluorescente contendo DAPI. Para obter imagens das amostras por microscopia confocal, selecione a objetiva de microscópio 60x e adicione óleo de imersão à lente.

Coloque a amostra no suporte da lâmina da platina do microscópio e levante a objetiva até que o óleo entre em contato com a lâmina. Usando iluminação epifluorescente, ajuste o plano focal para localizar as placas amilóides no hipocampo ou córtex cerebral. Em seguida, adquira imagens confocais dos fagócitos mononucleares ativados ao redor dos depósitos amilóides no hipocampo ou no córtex.

Para modelagem qualitativa 3-D in silico, primeiro analise os conjuntos de dados confocais com processamento de imagem 3-D científica em um módulo de colocalização de software de análise para proximidade espacial da coloração do marcador de macrófago ativado em todos os planos Z simultaneamente. Crie canais de colocalização que correspondam à coloração do fagolisossomo dentro dos fagócitos mononucleares ativados. Selecione TRITC para o Canal A e FITC para o Canal B.In janela Verificação de modo, selecione Limiar.

Para as intensidades de colocalização, selecione Canais de origem. Clique em Editar para selecionar a cor de colocalização. Em seguida, ajuste os limites de cada canal independentemente para incluir a coloração específica e excluir os sinais de fundo e não específicos.

Os voxels colocalizados aparecerão na cor de colocalização selecionada em todas as pilhas z simultaneamente. Em seguida, clique em Criar canal de colocalização. O canal de colocalização criado aparecerá na janela Ajuste de exibição.

Clique no canal de colocalização para abrir as estatísticas do canal. A porcentagem de material de volume A acima do limite colocalizado representa o volume de monócitos ocupado pelos fagolisossomos. Usando o Módulo de Colocalização, analise o canal de colocalização para proximidade espacial com os sinais beta-amilóide para quantificar o beta-amilóide encapsulado nos fagolisossomos.

Selecione o conjunto de dados de colocalização do Canal A e o Cy5 para o Canal B e crie um canal de colocalização como acabamos de demonstrar. Clique no canal de colocalização para abrir as estatísticas do canal novamente. A porcentagem de material de volume A acima do limite colocalizado representa o volume fagolisossomal ocupado pelo beta-amilóide.

Usando o Módulo Surpass, reconstrua as pilhas de imagens confocais e gere modelos 3D da beta-amilóide encapsulada dentro dos fagolisossomos de monócitos. Na janela Ajuste de exibição, selecione TRITC para mostrar apenas a coloração de macrófagos e clique em adicionar nova superfície" nas propriedades do volume. Em Definições, no primeiro dos cinco passos, algoritmo, selecione Superfície.

Em cor, selecione o tipo de cor de interesse e ajuste a transparência conforme apropriado. Em seguida, marque a caixa selecionar região de interesse e clique em Avançar. Na etapa dois de cinco, região de interesse, ajuste as coordenadas X, Y e Z para desenhar uma janela ao redor da célula de interesse e clique em Avançar.

Na etapa três de cinco, canal de origem, selecione o canal de origem TRITC e marque a caixa Suavizar. Defina o nível de detalhe da área de superfície para 0,4 mícrons e clique em Avançar. Na etapa quatro de cinco, limite, ajuste o limite para que o volume criado se sobreponha perfeitamente ao sinal do canal TRITC e clique em avançar.

Finalmente, na etapa cinco de cinco, classifique as superfícies, na seção Tipos de filtro, selecione os objetos dependendo de seu tamanho a serem incluídos ou excluídos dos volumes a serem criados. Repita as mesmas etapas para criar superfícies 3D para fagolisossomos com o canal FITC e beta-amilóide com o canal Cy5. Após a modelagem qualitativa 3-D in silico, como acabamos de demonstrar, a absorção de beta-amilóide nos fagolisossomos de monócitos nos cérebros de camundongos e ratos transgênicos pode ser analisada.

Curiosamente, o volume ocupado por fagolisossomos CD68 positivos é significativamente aumentado em fagócitos mononucleares positivos para Iba1, associados com, em comparação com distantes de placas, em camundongos e ratos, demonstrando que os fagócitos mononucleares próximos às placas estão prontos para fagocitose, em comparação com as células localizadas longe das placas. Também é digno de nota que os fagócitos mononucleares associados à placa exibem um aumento da captação de beta-amilóide em camundongos transgênicos em comparação com células distantes das placas, enquanto em ratos transgênicos é observada uma captação muito modesta de fibrilas beta-amilóide em geral, sem alteração aparente na fagocitose da fibrila beta-amilóide em função da distância das placas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade das imagens confocais é crucial e que limites semelhantes devem ser aplicados para todos os canais durante a análise de colocalização.

Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neuroinflamação explorarem eventos fagocíticos no cérebro de modelos de roedores da doença de Alzheimer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular seções cerebrais de roedores para fagócitos mononucleares, fagolisossomo e beta-amilóide. Quantificar a fagocitose da beta-amilóide cerebral em 3-D in vivo.