Name: 3D quantitativa In Silico Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda a técnica q3DISM para modelagem 3D quantitativa in silico da fagocitose de beta-amilóide por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método permite quantificar eventos fagocíticos in vivo.

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M-V. G-S. é apoiado por um Prêmio de Bolsa de Pesquisa da Doença de Alzheimer da Fundação BrightFocus (A2015309F) e um Prêmio Jovem Investigador da Associação de Alzheimer, Capítulo Southland da Califórnia. T.M.W. é apoiado por uma Fundação ARCS e John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (1R01NS076794-01, para T.T.), um Prêmio Zenith Fellows da Associação de Alzheimer (ZEN-10-174633, para T.T.) e um Prêmio Julie Martin Mid-Career da Federação Americana de Pesquisa do Envelhecimento / Fundação Médica Ellison (M11472, para T.T.). Somos gratos pelos fundos iniciais do Zilkha Neurogenetic Institute, que ajudaram a tornar este trabalho possível.

Declaração de ética em pesquisa: Todos os experimentos envolvendo animais detalhados aqui foram aprovados pela University of Southern California Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e realizado em estrita conformidade com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e recomendações da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório animal Care International. 1. Rodent isolamento Cérebro e Preparação para imunocoloração DIA 1: <ol><li> Coloque ratos TgF344-AD com idade (14 meses de idade) ou APP ratos / PS1 (12 meses de idade), sob anestesia isoflurano profunda contínua (4%). Avaliar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé e ausência de reflexo de retirada. </li><li> Cortar ambos os lados da caixa torácica e levante para expor o coração. Inserir uma agulha G 23 para o ventrículo esquerdo do coração e fazer uma pequena incisão no átrio direito. Continuar a exsanguinação por perfusão transcardial com soro fisiológico tamponado com fosfato arrefecido com gelo(PBS) utilizando uma bomba peristáltica (30 mL para ratos; 150-200 mL para ratos). </li><li> Fazer uma incisão na linha média na pele caudal e mover a pele e músculo de lado. Cortar através da parte superior do crânio, ao longo da linha média e entre os olhos. Retirar as placas ósseas e isolar todo o cérebro do crânio. </li><li> Coloque o cérebro em uma matriz de roedores cérebro coronal e cortá-lo em quartos. Incubar quartos posteriores S / N (16 h) no fixador de paraformaldeído (PFA a 4% em PBS) a 4 ° C. Lavar 3x em PBS, e depois transferir para 70% de etanol. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser tratado sob um capuz químico com equipamento de protecção individual adequado. </li></ol> DIA 2: <ol start="5"><li> Coloque trimestres cerebrais em cassetes de embebimento e progressivamente desidratar o tecido em banhos de etanol 1 h sucessivamente mais concentrada (70%, 80%, 95%, e 100% x3). </li><li> Limpar o etanol a partir do tecido com três banhos sucessivos de xileno a 100% (1 h cada). Atenção: O xileno é tóxico e should ser tratadas sob um capuz químico com equipamento de protecção individual adequado. </li><li> Incorporar tecidos em blocos de parafina depois de dois banhos de fundição de cera de parafina (56-58 ° C, 90 min cada). </li></ol> DIA 3: <ol start="8"><li> Cortar 10 seções mm de espessura de cérebros embebidos em parafina usando um micrótomo. secções mergulhar em um banho de água (50 ° C durante 1 min) e aplicam-se a lâminas de microscópio. Deixar as lâminas secar S / N, garantindo adesão do tecido à lâmina. </li></ol> 2. A imunocoloração Nota: Diferentes combinações de anticorpos pode ser utilizada para o procedimento de coloração descrito a seguir. Misturas de anticorpos compatíveis com tecido cerebral de ratos e murganhos são listados na Tabela 1. DIA 4: <ol><li> Desparafinar secções cerebrais usando 2x 100% banhos de xileno (12 min cada). </li><li> Rehidratar secções do cérebro em banhos sucessivos de etanol - 100% durante 10 min, 95% durante 5 min, 80% durante 10 min, e, finalmente, 70% durante 15 min - followed por lavagens PBS 3x [5 min à temperatura ambiente, com agitação luz]. Enquanto isso, o calor solução de recuperação de antígenos a 95-97 ° C em uma placa quente com agitação barra magnética. </li><li> Incubar secções do cérebro em solução de recuperação de antigénio a 95-97 ° C durante 30 min. Em seguida, lavar 3x em PBS (5 min à temperatura ambiente, com agitação leve). </li><li> Rapidamente lâminas secas usando limpadores tarefa delicada para evitar a secagem do tecido, e desenhar uma barreira hidrofóbica ao redor da área do tecido com uma caneta barreira hidrofóbica. Encher o tecido região cercada com tampão de bloqueio [PBS contendo 0,3% de Triton X-100 e 10% de soro normal burro (NDS)], e incubar à temperatura ambiente durante 1 h numa câmara humidificada. </li><li> Substituir tampão com anticorpo primário Iba1 (diluído em tampão de bloqueio) a rotular fagócitos mononucleares, e incubar O / N a 4 ° C numa câmara humidif içada de bloqueio. Para hosts de anticorpos e diluições de trabalho, consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais. </li></ol> DIA 5: <ol start="6"><li> Rinseanticorpo primário com banhos 3x PBS (5 min à temperatura ambiente com agitação leve). Incubar com anticorpo fluorescente secundário (conjugado com um fluoróforo de emissão 594 nm) durante 1 h (em tampão à TA no escuro bloqueio) seguido de banhos 3x com PBS (5 min à temperatura ambiente com agitação luz). Neste momento, manter secções no escuro para evitar branqueamento sinal fluorescente. </li></ol> Dia 6 - 7: <ol start="7"><li> Repita os passos 2.5 e 2.6 com CD68 (cérebros de ratos) ou anticorpos LAMP1 (tecido mouse) e anticorpos secundários apropriados (juntamente com um fluoróforo emissão de 488 nm) para rotular phagolysosomes. </li></ol> DIA 7-8: <ol start="8"><li> Repita os passos 2.5 e 2.6 com OC (tecido de rato) ou anticorpos 4G8 (cérebro do rato) e anticorpos secundários apropriados (acoplado a um fluoróforo 647 nm) para rotular depósitos de Ap. NOTA: Como alternativa, o anticorpo 6E10 pode ser utilizado com sucesso tanto em tecidos do rato e rato. Para combinações de anticorpos adequado, consulte a Tabela de Materiais </strong&gt;. </li><li> Permitir seções completamente O seco / N à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, cobrir amostras com uma lamela selada por meios de montagem de fluorescência contendo DAPI. </li></ol> 3. Aquisição de grande Z-stack confocal conjuntos de dados Nota: Este protocolo requer um rastreio por laser microscópio confocal totalmente automatizado equipado com uma objectiva 60X e 405 nm, 488 nm, 594 nm e 647 nm lasers. Todo o equipamento é controlado por computador pelo software de imagem e controle laser. Antes de iniciar o protocolo de imagem, ligue o computador, lâmpada de epifluorescência, microscópio, lasers e câmera. DIA 9: <ol><li> Escolha a objetiva do microscópio 60X. Adicione o óleo de imersão para a lente, e colocar a amostra no suporte de microscópio estágio slide. Elevar o objetivo até que o óleo faz contato com o slide. Ajuste o plano focal para localizar placas amilóides no hipocampo ou córtex cerebral usando iluminação de epifluorescência através das oculares. </li><li> Adquirir im confocalidades de fagócitos mononucleares ativadas circundantes depósitos de amilóide no hipocampo ou córtex de roedores por microscopia confocal (60X ampliação, passos z-stack: 0,25 mm &lt;z &lt;0,40 mm, número de etapas de 25 &lt;n &lt;35). </li></ol> 4. q3DISM Nota: A fim de produzir resultados significativos, sugerimos analisar um mínimo de 3 imagens por animal / região de interesse. Para cada imagem, a abundância de células a analisar pode variar dependendo de paradigmas experimentais. Nos resultados representativos apresentados neste relatório, foram analisadas 3 células / condição (por exemplo, fagócitos mononucleares distantes ou associados com placas; ver Figuras 1C - D e 2C - D). DIA 10: <ol><li> Analisar conjuntos de dados confocal com co-localização de processamento de imagem 3D científico e análise de software (Coloc) módulo de proximidade espacial de Iba1 / CD68 (tecido de rato) ou Iba1 / LAMP1 (tecido mouse) coloração em todos os z-aviões simultaneamente.Criar Iba + / CD68 + ou canais Iba + / LAMP1 + co-localização que correspondem a phagolysosomes dentro de fagócitos mononucleares ativadas. <ol><li> Escolha TRITC para o canal A (correspondente a coloração Iba1 acoplada com 594 nm fluoróforo) e FITC para o canal B (que corresponde a CD68 ou coloração LAMP1 acoplada com 488 nm fluoróforo). No lado direito da janela do software para &#39;verificação modo,&#39; selecionar &#39;limite&#39; e por &#39;intensidades COLOC,&#39; selecionar &#39;canais de origem&#39;. </li><li> Clique em &quot;Editar&quot; para selecionar &quot;cor Coloc &#39;no lado direito da janela do software. </li><li> Para cada canal de forma independente, ajustar os limites para incluir coloração específica e não incluem sinais de fundo / não-específicos. Uma vez ajustado, não altere os limites entre as imagens para garantir uma análise imparcial. Os voxels colocalized (pixels de todos os z-stacks) será exibido na cor selecionada na etapa 4.1.2 em todas as z-stacks SIMultaneously. </li><li> Clique em &#39;construir canal Coloc&#39;. O canal de co-localização criado aparecerá na janela de ajuste de display. </li><li> Clique no canal Coloc para abrir estatísticas de canal. A &quot;% de volume de material / A acima limiar colocalized &#39;% representa o sinal de Iba1 (voxels correspondentes ao fluoróforo 594 nm) co-localizada com LAMP1 ou sinal de CD68 (voxels correspondentes ao fluoróforo 488 nm). Mais simplesmente, este é o volume ocupado pelos monócitos fagolisossomas (ver Figuras 1C e 2C). NOTA: &#39;% do volume de material / B acima do limiar colocalized&#39; corresponde a% de sinal LAMP1 ou CD68 colocalized com Iba1. Isto deve ser próximo de 100%, como fagolisossomas são estruturas intracelulares. Os valores são baseados na proporção de sinal de todos os z-stacks acima do limiar colocalized. </li></ol></li><li> Usando o módulo Coloc, analisar o canal Coloc criado na etapa 4.1 para proximidade espacial com OC (ti ratossue) ou 4G8 (tecido mouse) sinais de Ap. Isto permite a quantificação de Ap encapsulado dentro de fagolisossomas. <ol><li> Seleccionar o canal Um conjunto de dados Coloc (correspondente ao Iba1 / CD68 ou Iba1 / LAMP1 Coloc canal criado no passo 4.1) e Cy5 para o canal B (que corresponde a coloração ou OC 4G8 acoplada com 647 nm fluoróforo). </li><li> Construir um canal Coloc como descrito nos passos 4.1.2 a 4.1.5. </li><li> Clique no canal Coloc para abrir estatísticas de canal. A &quot;% de volume de material / A acima limiar colocalized &#39;representa a% de Iba1 / ou LAMP1 Iba1 / CD68 (voxels correspondente ao canal Coloc construído no passo 4.1.5.) Co-localizada com CO ou sinal 4G8 (voxels correspondente ao 647 fluoróforo nm). Este é o volume ocupado por fagolisossï¿½ico Ap (ver Figuras 1D e 2D). NOTA: &#39;% do volume de material / B acima do limiar colocalized&#39; corresponde a% de sinal de Ap total de colocalized com phagolysosomes.Isto pode ser usado para avaliar a fracção do total dos depósitos de Ap encapsulados dentro de fagolisossomas (não mostrado nos presentes resultados representativos). </li></ol></li><li> Use o módulo superar para reconstruir as pilhas de imagens confocal e gerar modelos 3D de Ap encapsulados dentro phagolysosomes monócitos. <ol><li> Na janela &quot;ajuste display &#39;, selecione TRITC (para mostrar coloração única Iba1). Na janela &quot;Propriedades de volume&quot;, clique em &quot;adicionar nova superfície&quot;. </li><li> No passo &#39;1/5 algoritmo&#39;, em &#39;Configurações&#39;, selecione &#39;superfície&#39;. Além disso, em &#39;cor&#39;, selecione o tipo de cor na paleta ou RGB e ajustar a transparência (vermelho é de transparência de 60% nas Figuras 1B e 2B). a caixa de seleção &quot;selecionar a região de interesse&quot;. Clique ao lado. </li><li> No Passo &#39;2/5 região de interesse, &quot;desenhar uma janela em torno da célula de interesse, ajustando X, Y e Z coordenadas (ver caixas brancas nas Figuras 1A </strong&gt; e 2A). Clique ao lado. </li><li> No Passo &#39;3/5 canal de origem &quot;, selecione o canal de origem TRITC. Marque a caixa &quot;suave&quot;, e definir o nível de detalhe área de superfície a 0,4 mm. Para &quot;limiar&quot;, selecione intensidade absoluta. Clique ao lado. </li><li> Na Etapa &#39;4/5 limiar,&#39; ajustar o limiar de forma que o volume criado sobrepõe-se perfeitamente com o sinal de canal TRITC. Clique ao lado. </li><li> No Passo &#39;5/5 classificar superfícies &quot;, na seção&quot; tipo de filtro &quot;, selecionar objetos dependendo do seu tamanho para ser incluído ou excluído dos volumes a serem criados. Clique em Concluir, executar todas as etapas de criação, e sair do assistente. </li><li> Repita os passos 4.3.1 a 4.3.6 para criar uma superfície 3D para o canal FITC (LAMP1 + ou CD68 + fagolisossomas). </li><li> Repita os passos 4.3.1 a 4.3.6 para criar uma superfície 3D para o canal Cy5 (depósitos 4G8 + Ap OC + ou). </li></ol></li></ol>

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<li>Leinenga, G., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+ultrasound+removes+amyloid-%CE%B2+and+restores+memory+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Sci Transl Med. 7 (278), 33(2015).</li>
<li>Liarski, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+distance+mapping+identifies+functional+T+follicular+helper+cells+in+inflamed+human+renal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue.</a> Sci Transl Med. 6 (230), 46(2014).</li>
<li>Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+in+vivo+quantitation+of+beta-amyloid%3A+an+exemplary+biomarker+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease.</a> Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).</li>
<li>Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+amyloid+plaques+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).</li>
<li>Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-Microglia+Cross+Talk+through+Complement+Activation+Modulates+Amyloid+Pathology+in+Mouse+Models+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease.</a> J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).</li>
<li>Novotny, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Synthetic+A%CE%B2+to+In+Vivo+Active+Seeds+and+Amyloid+Plaque+Formation+in+a+Hippocampal+Slice+Culture+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model.</a> J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).</li>
<li>Tartaro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fluorescence-based+in+vivo+phagocytosis+assay+to+measure+mononuclear+phagocyte+system+function+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunotoxicol%22%5BJournal%5D)">Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat.</a> J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O protocolo que descrevemos neste relatório para a verdadeira quantificação 3D de Ap fagocitose in vivo pelos fagócitos mononucleares depende de rotulagem específica dos compartimentos celulares e subcelulares, bem como depósitos de Ap. Especificamente, usamos Iba1 (ionizada-se ligar à molécula de cálcio Adaptador 1), uma proteína que está envolvida em membrana ruffling e fagocitose por activação de célula 18, 19, para corar os fagócitos mononucleares cerebrais. Enquanto as célu...

Doença de Alzheimer (AD), a demência relacionada com a idade mais comum 1, caracteriza-se pela acumulação de amilóide cerebral-β (Ap) como placas &quot;senis&quot; beta-amilóide, neuroinflamaï¿½o baixo nível crónica, taupatia, perda neuronal, e perturbação cognitiva dois . No AD cérebros de pacientes, neuroinflamação é destinada pelos astrócitos e fagócitos mononucleares reativa (referido como microglia, embora as suas centrais vs. origem periférica permanece obscuro) em torno depósitos Ap 3. Como as sentinelas imunes inatas do SNC, microglia são posicionados centralmente para limpar Ap cérebro. No entanto, o recrutamento da microglia para placas de Ap é acompanhada por muito pouco, se algum, fagocitose Ap 4,5. Uma hipótese é que microglia são inicialmente neuroprotetor por phagocytozing pequenas montagens de Ap. No entanto, eventualmente estas células se tornam neurotóxico como carga Ap esmagadora e / ou d funcional relacionada com a idadeecline, provoca microglia em um fenótipo pró-inflamatório disfuncional, contribuindo para a neurotoxicidade e declínio cognitivo 6. Estudo de associação genômica ampla Recentes (GWAS) identificaram um conjunto de alelos de risco AD pertencentes ao núcleo vias imunitárias inatas 7 que modulam a fagocitose 8-11. Consequentemente, a resposta imune a deposição de amilóide cerebral tornou-se uma grande área de interesse, tanto em termos de compreender a etiologia AD e para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas 12-14. No entanto, existe uma necessidade vital para a metodologia para avaliar a fagocitose Ap in vivo. Para atender a essa necessidade não satisfeita, temos desenvolvido 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) para permitir uma verdadeira quantificação 3D da cerebral fagocitose Ap por fagócitos mononucleares em modelos de roedores de doença de Alzheimer-like. Limitado apenas pelo grau em que a doença recapitular, os modelos animais têmcomprovada de valor inestimável para a compreensão AD pathoetiology e para avaliar terapêutica experimental. Devido ao facto de que as mutações nos genes presenilina (PS) e da Proteína Precursora Amilóide (APP) independentemente causar AD autossómica dominante, estes transgenes mutantes têm sido extensivamente usados ​​para gerar modelos de roedores transgénicos. Camundongos transgênicos APP / PS1 coexpressï¿½ simultaneamente &quot;sueco&quot; mutante APP humana (swe APP) e Δ exon 9 mutante presenilina 1 humano (PS1ΔE9) presente com amiloidose cerebral acelerada e neuroinflamação 15,16. Além disso, geramos ratos bi-transgénicos co-injectado com APP swe e construções PS1ΔE9 (linha TgF344-AD, em um fundo Fischer 344). Ao contrário de modelos de ratos transgênicos de amiloidose cerebral, ratos TgF344-AD desenvolver amilóide cerebral que antecede tauopathy, perda apoptótica de neurônios, e comprometimento comportamental 17. Neste relatório, nós descrevemos um protocolo para immunostaining microglia, phagolysosomes e depósitos de Ap em seções do cérebro de ratinhos APP / PS1 e ratos TgF344-AD, e aquisição de imagens confocal grandes z-dimensional. Nós detalhe na geração e análise dos verdadeiros reconstruções 3D a partir de conjuntos de dados confocal permitindo a quantificação da captação de Ap em phagolysosomes microgliais silico. Mais amplamente, a metodologia que nós detalhes aqui pode ser usado para quantificar virtualmente qualquer forma de fagocitose in vivo.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbott</td><td>NDC 0044-5260-05</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação Ponta romba</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td>VWR</td><td>94024-408</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 23 G</td><td>VWR</td><td>BD305145</td><td></td></tr><tr><td>bomba peristáltica FH10</td><td>Thermo Scientific</td><td>72-310-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bioland Scientific</td><td>PBS01-02</td><td>Solução salina tamponada com fosfato; Concentração de trabalho 1x</td></tr><tr><td>Matriz de Cérebro de Rato Adulto, Fatias Coronais, Aço Inoxidável 1 mm&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Cérebro de Rato Adulto, Fatias Coronais, Aço Inoxidável 1 mm&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-305C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solução aquosa de paraformaldeído a 32% (PFA)</td><td>EMS</td><td>15714-S</td><td>Cuidado: Tóxico. Concentração de trabalho: 4% em PBS</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-188</td><td>Várias concentrações, veja o protocolo</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura</td><td>VWR</td><td>25608-774</td><td></td></tr><tr><td>Embedding and Infiltration Paraffin</td><td>VWR</td><td>15147-839</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo Leica RM2125</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Micrótomo Descartáveis&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria Leica HI 1210</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro slide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4X4L</td><td>Cuidado: Tóxico&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de Recuperação de Alvo 10x</td><td>DAKO</td><td>S1699</td><td>Concentração de trabalho 1x</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Caneta PAP hidrofóbica</td><td>VWR</td><td>95025-252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal (NDS)</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Prolongue o reagente antidesvanecimento Gold com DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Rack de Vidro Deslizante</td><td>VWR</td><td>100492-942</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Iba1 (policlonal, coelho)</td><td>Wako</td><td>019-19741&nbsp;</td><td>Concentração de trabalho 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo Iba1 (policlonal, caprino)</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B2645</td><td>Concentração de trabalho 1:200</td></tr><tr><td>anticorpo CD68 [KP1] de rato (monoclonal, camundongo)</td><td>Abcam</td><td>ab955</td><td>Concentração de trabalho 1:200</td></tr><tr><td>anticorpo CD68 [FA-11] de camundongo (monoclonal, rato)</td><td>Abcam</td><td>ab53444</td><td>Concentração de trabalho 1:200</td></tr><tr><td>camundongo CD107a (LAMP1) anticorpo (monoclonal, rato)</td><td>Affymetrix</td><td>14-1071</td><td>Concentração de trabalho 1:100</td></tr><tr><td>Beta-Amilóide, 17 - 24 (4G8) anticorpo (monoclonal, camundongo)</td><td>Covance</td><td>SIG-39220</td><td>Concentração de trabalho 1:200</td></tr><tr><td>Beta-Amilóide, 1 - 16 (6E10) anticorpo (monoclonal, camundongo)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Concentração de trabalho 1:200</td></tr><tr><td>OC anticorpo (policlonal, coelho)</td><td>Dotado por D. H. Cribbs e C. G. Glabe (UC Irvine)</td><td>Concentração de trabalho 1:200</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário de camundongo Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Concentração de trabalho 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário de rato Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11006</td><td>Concentração de trabalho 1:1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorpo secundário de coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>Concentração de trabalho 1:1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorpo secundário de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A-11080</td><td>Concentração de trabalho 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticorpo secundário de camundongo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>Concentração de trabalho 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticorpo secundário de coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td>Concentração de trabalho 1:1,000</td></tr><tr><td>Óleo de imersão</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal A1</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de pesquisa avançada NIS Elements</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris:Software Bitplane versão 7.6</td> São utilizados os módulos <td>Bitplane</td><td></td><td>"coloc" e "supass". Como alternativa, o freeware de código aberto&nbsp; O ImageJ pode ser usado para colocalização&nbsp; Análise de conjuntos de dados confocais Z-stacks.</td></tr></tbody></table>

3d quantitativa in silico modelagem (q3dism) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de alzheimer

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Neuroinflamação é agora reconhecido como um importante fator etiológico em doenças neurodegenerativas. fagócitos mononucleares são células imunitárias inatas responsáveis ​​pela fagocitose e remoção de escombros e detritos. Estas células incluem macrófagos residentes do SNC conhecidos como microglia e fagócitos mononucleares infiltrantes a partir da periferia. A microscopia de luz tem sido geralmente usado para visualizar a fagocitose em roedores ou espécimes do cérebro humano. No entanto, os métodos qualitativos não forneceram provas definitivas da fagocitose in vivo. Aqui, nós descrevemos 3D quantitativa na modelagem de silício (q3DISM), um método robusto para a verdadeira permitindo a quantificação de 3D-amilóide β (Ap) a fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD). O método envolve a fluorescência visualizando Ap encapsulado dentro phagolysosomes em seções roedor cerebrais. Grandes conjuntos de dados confocal z-dimensional são então reconstrução 3D para quantificação de A &amp;# 946; colocalized espacialmente no interior do fagolisossoma. Nós de demonstrar a aplicação bem sucedida de q3DISM de ratinho e de rato cérebros, mas esta metodologia pode ser estendida para virtualmente qualquer modo fagocitária em qualquer tecido.

Utilizando a metodologia multi-fase para q3DISM detalhado acima, que são capazes de quantificar a absorção de Ap em fagolisossomas monócitos nos cérebros de murganhos APP / PS1 (Figura 1) e ratos TgF344-AD (Figura 2). Portanto, a metodologia q3DISM permitiu a análise de fagócitos mononucleares em ratinhos e ratos modelos da doença de Alzheimer. Curiosamente, o volume ocupado pelo CD68 + fagolisossomas é aumentado significativamente em fagócito...

Desenvolvemos uma metodologia para 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) de amilóide cerebral-β (Aâ) fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método pode ser generalizado para a quantificação de praticamente qualquer evento fagocítica in vivo.

3D quantitativa In Silico Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

O objetivo geral desta modelagem quantitativa 3-D in silico, ou técnica q3DISM, é quantificar a captação de beta-amilóide por fagócitos mononucleares no cérebro de modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método atende a uma necessidade premente no campo da pesquisa de Alzheimer para quantificar a depuração da beta-amilóide que é depositada no cérebro de pacientes com Alzheimer formando placas senis. Pela primeira vez, esta técnica permite a verdadeira reconstrução 3-D e quantificação de beta-amilóide por macrófagos in vivo Começamos a usar o 3-Dism para estudar a deposição de beta-amilóide porque precisávamos de uma ferramenta robusta para visualizar e quantificar a fagocitose de micrófagos in vivo.Essa técnica pode ser útil no teste de terapias experimentais para a doença de Alzheimer para avaliar quais drogas estimulam os macrófagos para a depuração eficiente da beta-amilóide. Quando as amostras de tecido estiverem prontas para imunocoloração, preencha a região de tecido circundada por caneta de barreira hidrofóbica com tampão de bloqueio para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente em uma câmara umidificada. No final da incubação, substitua o tampão de bloqueio

quantitative-3d-silico-modeling-q3dism-cerebral-amyloid-beta

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Uma das características patológicas da doença de Alzheimer é a formação de amilóide β proteína placas neuríticas positivo. Neste protocolo, descrevemos dois métodos para detectar placas neuríticas em camundongos transgênicos modelo AD: detecção imunohistoquímica utilizando o método ABC e DAB e detecção fluorescente usando o método thioflavin S coloração.

Detecção de placas neuríticas no rato da doença de Alzheimer Modelo

Este vídeo demonstra a infusão estereotáxica precisa de beta amilóide no giro dentado para estabelecer um modelo de camundongo da doença de Alzheimer. A determinação precisa de coordenadas e a entrega controlada de proteínas beta amilóides resultam em degradação neuronal, interrompendo o processamento da memória e contribuindo para o desenvolvimento da doença de Alzheimer.

Infusão cerebral estereotáxica direta de proteínas beta-amilóide para um modelo de doença de Alzheimer

Fonte: Arango-Lievano, M. et. al., Imagem longitudinal in vivo da cerebrovasculatura: relevância para doenças do SNC. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens in vivo de dois fótons para visualizar placas amilóides marcadas com fluorescência e vasculatura cerebral. A fluorescência azul marca as placas, enquanto a fluorescência verde destaca os vasos sanguíneos cerebrais. Um mapa 3D da região de interesse e imagens em mosaico de alta resolução revelam interações detalhadas de placas...

Imagens in vivo de vasos cerebrais e placas amilóides em um modelo de camundongo com doença de Alzheimer

Aqui, apresentamos um protocolo para infusão cerebral estereotáxica direta de beta-amilóide. Esta metodologia fornece um modelo alternativo de camundongo in vivo para abordar os efeitos de curto prazo da beta-amilóide nos neurônios cerebrais.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Este artigo descreve um protocolo para a visualização de placas amilóides de Ap em modelos de rato da doença de Alzheimer utilizando metoxi-X04, que atravessa a barreira sangue-cérebro e selectivamente se liga a p-pregueadas folhas encontradas no núcleo denso placas de Ap. Ele permite pré-triagem de secções de tecido contendo placas antes de imunocoloração e processamento para microscopia eletrônica.

Correlativa Luz e Microscopia Eletrônica para estudar interações Microglial com placas de beta-amilóide

Imagem molecular com laser assistida por matriz baseada em ionização/dessorção de imagem espectrometria de massa (MALDI-IMS) permite o mapeamento simultâneo de vários analitos em amostras biológicas. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e visualização da proteína β amiloide nos tecidos do cérebro de doença de Alzheimer e amostras de Angiopatia amiloide cerebral usando MALDI-IMS.

Visualização dos depósitos β amiloide no cérebro humano com Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de imagem espectrometria de massa

Este protocolo ilustra um método de encapsulamento da pilha pela gelação física rápida do alginato para imobilizar pilhas. Os microgrânulos obtidos permitem a secreção controlada e sustentada de amiloide-β ao longo do tempo e podem ser usados para estudar os efeitos do amilóide-β secretado em modelos in vitro e in vivo.

Fabricação de microgrânulos de alginato de secreção de amiloide-β para uso na modelagem da doença de Alzheimer

O presente protocolo descreve e compara o procedimento para realizar uma análise de interesse de região completa ou sub-região de seções cerebrais de camundongos sagitos para quantificar a carga amilóide-beta no modelo de camundongo transgênico APP/PS1 da doença de Alzheimer.

Quantificação total versus sub-regional da carga amilóide-beta nas seções cerebrais do rato

Aqui, descrevemos a medição da taxa de transporte axonal de estabilizadores constitutivos de membranas do retículo endoplasmático (ER) associadas às mitocôndrias (MAMs), aumentando ou mantendo a geração de β-amilóide (Aβ) neurotóxico a partir de neurônios da doença de Alzheimer (DA) em tempo real para servir como uma métrica direta e quantitativa para medir a estabilização do MAM e auxiliar no desenvolvimento da terapêutica da DA.

Análise quantitativa da estabilização da membrana do retículo endoplasmático (MAM) associada às mitocôndrias em um modelo neural da doença de Alzheimer (DA) 

A metodologia para a coleta de alta densidade de eventos relacionados com o potencial de dados, enquanto os pacientes com doença de Alzheimer executar uma tarefa de memória de reconhecimento é revisado. Este protocolo incluirá preparação assunto, garantia de qualidade, aquisição de dados e análise de dados.

Examinando as características de memória episódica com potenciais relacionados a eventos em Pacientes com Doença de Alzheimer

Aprenda a técnica q3DISM para modelagem 3D quantitativa in silico da fagocitose de beta-amilóide por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método permite quantificar eventos fagocíticos in vivo.

3D quantitativa In Silico Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer

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