Induzíveis linhas celulares estáveis ​​marcado-LAP para investigar a função da proteína, Spatiotemporal Localização e redes de interação de proteínas

O objetivo geral deste procedimento é gerar localização induzível e purificação de afinidade, ou linhagens celulares estáveis marcadas com LAP, para investigar a função proteica, localização espaço-temporal e redes de interação proteica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia molecular e celular relacionadas à função da proteína, localização subzero do ciclo celular da proteína e interações proteicas. A principal vantagem deste método é que ele é passível de análise de alto rendimento de grupos de proteínas e pode ser usado para dissecar os componentes proteicos de vias biológicas.

Para iniciar este procedimento, clone o quadro de leitura aberto do gene de interesse no vetor marcado com LAP e transfecte-o em células HEK293 conforme descrito no protocolo de texto. Um dia após a transfecção, substitua o meio menos Tet DMEM/F12 por meio novo. Dois dias após a transfecção, dividir as células em 25% de confluência.

Deixe as células se ligarem por aproximadamente cinco horas. Em seguida, adicione meios contendo higromicina menos Tet DMEM / F12 na concentração predeterminada. Para células HEK293, use 100 microgramas por mililitro de higromicina.

Substitua o meio conforme necessário até que apareçam focos celulares distintos que se assemelhem a manchas opacas contra a placa transparente. Adicione 20 microlitros de tripsina em cima de cada foco de célula e canalize-o para cima e para baixo duas vezes com uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Transfira as células em uma placa de 24 poços e expanda as células por crescimento contínuo em meios contendo higromicina menos Tet DMEM / F12.

Expanda a linha celular validada marcada com LAP para purificação de afinidade em tandem, ou TAP, isolamento de complexos de proteínas. Para fazer isso, passe continuamente todas as células HEK293 em placas maiores e/ou garrafas de rolo, e menos o meio Tet DMEM/F12 a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Para linhagens celulares induzíveis por Tet/Dox, induza as células por 10 a 15 horas adicionando uma concentração de 0,2 microgramas por mililitro de Tet/Dox quando as células atingirem aproximadamente 70% de confluência.

Colha as células por agitação ou tripsinização. Em seguida, pegue-os a 875 vezes g por cinco a 10 minutos. Para acoplar o anticorpo anti-GFP às esferas de proteína A, equilibre 160 microlitros de esferas de proteína A de volume concentrado com PBST em um tubo de 1,5 mililitro.

Lave as contas três vezes com 1 mililitro de PBST. Após cada etapa de lavagem ao longo deste procedimento, os grânulos são centrifugados a 5000 vezes g por 10 segundos e o sobrenadante é removido. Depois de ressuspender os grânulos em 500 microlitros de PBST, adicione 80 microgramas de anticorpo anti-GFP rápido purificado por afinidade a cada tubo, contendo 160 microlitros de grânulos.

Misture por uma hora em temperatura ambiente. Lave as contas duas vezes com um mililitro de PBST, depois lave as contas duas vezes com um mililitro de borato de sódio 0,2 molar, pH Após a lavagem final, adicione 900 microlitros do tampão de borato de sódio, para trazer o volume final para um mililitro. Em seguida, adicione 100 microlitros de DMP de 220 molares à suspensão do grânulo, para uma concentração final de 20 milimolares.

Gire os tubos suavemente em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação com DMP, lave as esferas uma vez com um mililitro de etanolamina 0,2 molar, cloreto de sódio 0,2 molar pH 8,5, para inativar o reticulador residual. Em seguida, ressuspenda as contas em um mililitro do mesmo tampão e gire por uma hora em temperatura ambiente.

Depois de peletizar as contas, suspenda-as novamente em mais 500 microlitros do tampão. As contas preparadas são estáveis por vários meses a quatro graus Celsius. Para preparar os lisados celulares, ressuspenda 500 microlitros de volume globular em 2,5 mililitros de LAP 300, com DTT 0,5 milimolar e inibidores de protease.

Adicione 90 microlitros de 10% de nonil fenoxipolietoxiletanol e misture por inversão. Coloque a mistura no gelo por 10 minutos. Centrifugar a 21 000 vezes g durante 10 minutos.

Após centrifugação, recolher este sobrenadante de baixa velocidade e retirar uma amostra de 10 microlitros para análise do gel. Depois de transferir o sobrenadante de baixa velocidade para um tubo TLA 100.3, gire a 100.000 vezes g por uma hora a quatro graus Celsius. Recolher este sobrenadante de alta velocidade num tubo e colocá-lo no gelo, reservando uma amostra de 10 microlitros para análise do gel.

Para a primeira captura de afinidade por meio da ligação a grânulos anti-GFP, pré-eluída os grânulos acoplados a anticorpos lavando-os três vezes com um mililitro de tampão de eluição para remover os anticorpos desacoplados e reduzir o fundo. Faça isso rapidamente. Não deixe as contas com alto teor de sal por muito tempo.

Em seguida, lave as esferas três vezes com um mililitro de LAP 200 N. Em seguida, misture o extrato sobrenadante de alta velocidade com esferas de anticorpos por uma hora a quatro graus Celsius. Depois de centrifugar o extracto a 21 000 vezes g durante 10 minutos, reservar uma amostra de 10 microlitros do sobrenadante para a análise do gel. Realize três lavagens rápidas dos grânulos com um mililitro de LAP 200 N, contendo 0,5 milimolar DTT e inibidores de protease.

Use o mesmo tampão para lavar as contas mais duas vezes com um tempo de incubação de cinco minutos para cada lavagem. Em seguida, lave as esferas rapidamente mais duas vezes com 1 mililitro de LAP 200 N contendo 0,5 milimolar de DTT e sem inibidores de protease, antes de adicionar a protease do Tobacco Etch Virus, ou TEV. Adicione 10 microgramas da protease TEV em um mililitro de LAP 200 N aos grânulos e gire os tubos a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, pelete as contas e transfira o sobrenadante para um tubo novo. Enxágue as esferas duas vezes com 160 microlitros de LAP 200 N, contendo 0,5 milimolar DTT e inibidores de protease para remover qualquer proteína residual. Para a segunda captura de afinidade através da ligação à proteína S agarose, lave um tubo de 80 microlitros de pasta de agarose S-proteína três vezes com um mililitro de LAP 200 N. Adicione o sobrenadante eluído TEV às esferas de proteína S e balance-as por três horas a quatro graus Celsius.

Depois de peletizar as contas, lave-as três vezes com um mililitro de LAP 200 N contendo 0,5 milimolar de DTT e inibidores de protease. Em seguida, lave as contas duas vezes com um mililitro de LAP 100. Eluir as proteínas da agarose da proteína S adicionando 50 microlitros de tampão de amostra 4x Laemmli e aquecendo a 97 graus Celsius por 10 minutos.

Para identificar proteínas interagentes por análise de espectrometria de massas, testar a qualidade da purificação analisando as amostras coletadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio. A prata mancha o gel resultante. Além disso, imunoblot os eluatos e a sonda com anticorpos anti-GFP para garantir que a purificação marcada com LAP funcionou.

Para identificar espécies co-purificadoras estequiométricas e subestequiométricas, pegar a amostra final de eluição e separá-la por SDS-PAGE. Manchar o gel com uma coloração de proteína compatível com espectrometria de massa. Extirpar as bandas mais proeminentes do gel e o espaço entre elas para processar as bandas separadamente para análise por espectrometria de massa.

Aqui é mostrada uma análise representativa de western blot das amostras de proteínas de células LAP-Tau HEK293 não induzidas e induzidas por Dox. As células são sondadas com anticorpos anti-Tubulina para detectar o controle de carga de Tubulina e sondadas com anti-GFP para detectar a proteína Tau marcada com LAP. Observe que o LAP-Tau só é expresso quando as células são induzidas com Dox.

As células mitóticas que expressam LAP-Tau foram fixadas e co-coradas para DNA e tubulina com anticorpos anti-tubulina, e a localização subcelular de LAP-Tau foi analisada por microscopia de fluorescência. Observe que o LAP-Tau se localiza no fuso mitótico e nos pólos do fuso durante a mitose. Aqui é mostrado um gel corado de prata representativo da purificação LAP-Tau.

As pistas representam o peso molecular, os lisados limpos e os eluatos finais. As amostras foram executadas em um gel 4-20% SDS-PAGE e o gel foi corado com prata para visualizar as proteínas purificadas. Observe que uma banda correspondente a LAP-Tau é marcada com um asterisco, e várias outras bandas correspondentes a proteínas co-purificadoras podem ser vistas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar linhagens celulares estáveis induzíveis marcadas com LAP e como realizar purificações bioquímicas de proteínas marcadas com LAP para análise proteômica e identificação de redes de interação de proteínas.