Name: Induzíveis linhas celulares estáveis marcado-LAP para investigar a função da proteína, Spatiotemporal Localização e redes de interação de proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Aprenda a gerar linhas celulares estáveis induzíveis com marcação LAP para investigar função proteica, localização e redes de interação. Este método permite análise de alta vazão em células HEK293.

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Este trabalho foi apoiado por uma National Science Foundation Grant NSF-MCB1243645 (JZT), quaisquer opiniões, descobertas e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

NOTA: Uma visão geral da criação de linhas celulares estáveis marcado com LAP indutíveis para qualquer proteína de interesse é ilustrada na Figura 1 e a descrição da expressão da proteína LAP-tag, purificação e preparação para proteómica análises de massa está ilustrado na Figura 3. 1. Clonagem do quadro de leitura aberta (ORF) do gene de interesse para a Vector LAP-tag <ol><li> A clonagem do ORF do gene de interesse no vector vaivém. <ol><li> Use reacção em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar o ORF de interesse com os sítios attB1 e attB2 adequado dentro dos iniciadores para qualquer fusão do terminal N ou do terminal C de fusão. Ver tabela 1 para sequências de iniciador e Tabela 2 para as condições de PCR. </li><li> Gel de purificar os produtos de PCR por resolvê-los sobre um gel de agarose a 1%. Extirpar a banda amplificada que é o tamanho correto do gel e extraí-lo a partir da fatia de gel utilizando um DNA gKit de extração el conforme as instruções do fabricante. </li><li> Incubar a attB purificada contendo produtos de PCR com um vector de transporte contendo attP e da recombinase que permite que os produtos de PCR para recombinar no vector de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela MATERIAIS). NOTA: vectores de transporte vazios e LAP-tagging vectores contêm o gene CCD B e têm de ser propagado em células bacterianas resistentes CCD B (ver Materiais Tabela). No entanto, o gene ccdB é recombinado para fora, quando uma ORF é inserido nestes vectores, por conseguinte, utilizar células de E. coli DH5a de E. padrão quando propagação vectores com ORFs clonados. </li><li> Transformar células DH5a de E. coli com 1 uL do produto da reacção e a placa das células transformadas para um caldo de Luria (LB) com placa de agar de 50 mg / ml de canamicina 13. </li><li> Selecione as colónias resistentes canamicina. </li><li> Deixar crescer as colónias seleccionadas em LB mimdiâmetro com 50 mg / ml de canamicina, fazer um ADN de mini-prep e confirmar a integração do gene por sequenciação de ADN utilizando os iniciadores de sequenciação listados na Tabela 3. </li></ol></li><li> Transferir o gene de interesse a partir do vector de transporte para o Vector LAP-tag. <ol><li> Incubar o vector de transporte que contém o gene da sequência verificada de interesse ORF com o vector de LAP-tag (pGLAP1 para a fusão do terminal N) e a recombinase que medeia a transferência do gene de interesse a partir do vector vai-vem no vector LAP-tag conforme instruções do fabricante (ver Materiais). NOTA: Uma série de vectores de LAP / TAP que podem ser utilizados com base no promotor desejado, epitopo-marcador, e N ou C-terminal de marcação podem ser encontrados na Tabela 4. </li><li> Transformar células DH5a de E. coli com 1 uL do produto da reacção e a placa de células transformadas para uma placa de agar LB com 100 mg / ml de ampicilina 13. </li><li> Selecione o colo resistentes a ampicilinasas. </li><li> Crescer as colónias seleccionadas em meio LB com 100 mg / ml de ampicilina, fazer um ADN de mini-preparação, e confirmar a integração do gene por sequenciação de ADN utilizando os iniciadores de sequenciação listados na Tabela 5. </li></ol></li></ol> 2. Geração de uma linha celular estável Induzível que expressa o gene marcado-LAP de Interesse <ol><li> Selecione a linha celular mais adequado para o projecto de interesse. Alternativamente, criar uma linha de célula hospedeira a partir de qualquer linha celular que expresse constitutivamente existente a TetR e contém um local DRF que permite que o gene marcado com LAP de interesse a ser estavelmente integrado no genoma (ver Materiais). NOTA: Este protocolo utiliza uma linha celular HEK293 que contém o TetR e um local DRF, que é crescido em -Tet meio DMEM / F12 [feitas com soro de bovino fetal a 10% (FBS) que é desprovido de tetraciclina (-Tet)] 4 . </li><li> Determinar a concentração mínima de higromicina necessária para matar a linha celular hospedeira dentro de 1 a 2 altasks após a adição de drogas. A concentração pode variar entre linhas de células hospedeiras, com mais que varia entre 100 ug / ml e 800 ug / ml. NOTA: as células HEK293 cultivadas em meio DMEM -Tet / F12 com 100 ug / ml de higromicina a 37 ° C e 5% de CO 2 morrem dentro de 1-2 semanas. </li><li> Co-transfectar o vector que expressa a recombinase flipase (medeia a integração do gene LAP-marcadas de interesse no local DRF no genoma da célula) com o vector marcada com LAP em células HEK293 usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante . Use uma proporção de 4: 1 de vector recombinase para vector LAP 14. NOTA: A proporção óptima depende da linha celular hospedeira e método de transfecção, e pode necessitar de uma titulação. Uma proporção de 4: 1 funciona bem para a maioria das linhas celulares. Incluir uma placa falsamente transfectadas como controlo negativo. </li><li> Um dia após a transfecção, substituir o media / F12 -Tet DMEM com meios frescos. </li><li> Dois dias pós-transfection, dividir células a 25% de confluência. Permitir que as células ~ 5 horas para anexar, em seguida, adicione higromicina contendo -Tet DMEM media / F12 na concentração pré-determinada no passo 2.2. Para utilizar células HEK293 100 ug / ml de higromicina. NOTA: O FRT contendo linha celular HEK293 que também contém a TetR que está associada com a resistência à blasticidina, portanto, 5 ug / ml de Blasticidina é utilizado durante o processo de selecção de linhas de células estáveis ​​para seleccionar para a TetR e para minimizar a expressão gotejante. </li><li> Substitua higromicina contendo -Tet DMEM media / F12 conforme necessário até que focos de células distintas aparecem que se assemelham pontos opacos contra a placa transparente. </li><li> Adicionar 20 ul de tripsina em cima uns dos focos das células e pipetar para cima e para baixo 2 vezes com uma ponta de pipeta de 200 uL. Células lugar em uma placa de 24 poços e expandir as células por crescimento contínuo em higromicina contendo -Tet DMEM media / F12. </li><li> células de tela para a expressão da proteína etiquetada-LAP inducible por microscopia de fluorescência de células fixas ou em células vivas, e / ouWestern blot para a tag GFP dentro do LAP-tag 15. </li></ol> 3. Purificação de complexos de proteínas marcadas com LAP Nota: Os seguintes purificação de proteínas detalhes do protocolo recomendações lap-marcados sobre as condições e os volumes utilizados para a purificação de proteínas LAP-tag típica com base na experiência anterior. No entanto, devem ser tomadas precauções para assegurar que a optimização empírica é levada a cabo por qualquer complexo de proteína e proteína nível de expressão de interesse para proporcionar os melhores resultados. <ol><li> Crescimento celular e de colheita de células. <ol><li> Expandir a linha de células marcadas com LAP validado para o isolamento de complexos de proteínas TAP, por passaging continuamente todas as células HEK293 em placas maiores e / ou frascos rotativos em meio DMEM -Tet / F12 a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Para as linhas celulares indutíveis Tet / Dox, induzir durante 10-15 horas a uma concentração de 0,2 ug / ml de Tet / Dox quando as células atingem ~ 70% de confluência, antes de Harvestcélulas de g. NOTA: O tempo de concentração e de indução deve ser determinado para cada proteína, uma titulação de 0,1-1 ug / ml Tet / Dox durante 10-15 horas é recomendado. </li><li> Células colheita por agitação ou células tripsinização e pelotas em 875 g durante 5-10 min. </li></ol></li><li> Acoplamento de anti-GFP de anticorpos para uma proteína de grânulos <ol><li> Usar 40 jig de anticorpo para a imunoprecipitação de um ligado preparado a partir de um sedimento de células de 0,5 ml, o volume de células compactadas (PCV). NOTA: A quantidade de anticorpo necessária dependerá da abundância da proteína marcada com LAP, entre outros factores, e vai requerer optimização. Uma titulação de 10-40 ug é recomendado. </li><li> Equilibrar 160 ul volume empacotado (PV) esferas de Proteína A em PBST (PBS + 0,1% de Tween-20) em um tubo de 1,5 ml. Lavar 3 vezes com 1 ml de PBST. Nota: Todas as lavagens aqui descritos são realizados por centrifugação das esferas a 5000 xg durante 10 seg. </li><li> grânulos Ressuspender em 500 ul PBST e adicionar 80 mg de afinidadeanticorpo anti-GFP coelho -purified a cada tubo de 160 contas de ul. Mistura-se durante 1 hora à temperatura ambiente (TA). </li><li> Lavar as esferas 2 vezes com 1 ml de PBST. Em seguida, os grânulos lavar 2 vezes com 1 ml de borato de sódio 0,2 M, pH 9 (20 ml 0,2 M de borato de sódio de ácido bórico + 15 ml de 0,2 M). Após a lavagem final, adicionar 900 ul do borato de sódio 0,2 M, pH 9 para levar o volume final de 1 ml. </li><li> Adicionar 100 ul de 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) a uma concentração final de 20 mM. Rodar os tubos suavemente à temperatura ambiente durante 30 min. Para DMP 220 mM, ressuspender conteúdo de um frasco de 50 mg em 877 ul de borato de sódio 0,2 M, pH 9 e adicione imediatamente a suspensão de pérolas. </li><li> Após incubação com DMP, grânulos lavar uma vez com 1 ml de etanolamina a 0,2 M, NaCl 0,2 M pH 8,5, para inactivar o agente de reticulação residual. Ressuspender as pérolas em 1 ml do mesmo tampão e girar durante 1 h à TA. grânulos de pellets e contas ressuspender em 500 mL de 0,2 M de etanolamina, 0,2 M NaCl pH 8.5. Grânulos são estáveis ​​por several meses a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparação de tampões para Lise Celular e Purificação Complex <ol><li> Prepare buffers LAPX (onde X é a concentração de sal desejado [KCl] do tampão LAP; 300 mm para a lise celular, de 200 mm para a maioria das lavagens de contas, e 100 mm para esferas de lavagem antes de eluição proteínas), fazendo uma solução pH 7.4 contendo mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazina 50 (HEPES), KCl X mM, 1 mM de ácido etileno-glicol-tetraacético (EGTA), 1 mM de MgCl2, e 10% de glicerol. NOTA: Os componentes deste tampão é utilizada para aproximar o ambiente em células vivas. HEPES é usado como um tampão na raiva de 7,2-8,2 pH. KCl é um sal utilizado para manter a força iónica do tampão. EGTA é um agente quelante que se liga a iões de cálcio para reduzir os níveis de cálcio em relação ao magnésio. Glicerol e MgCl 2 são utilizados para melhorar a estabilidade das proteínas. </li><li> Preparar tampão LAPX N através da adição de 0,05% de nonil phenoxypolyethoxylethanol para o buffer LAPX. NOTA: nonilo phenoxypolyethoxylethanol é um detergente suave que solubiliza as proteínas, mas preserva as interacções proteína-proteína, assim, uma concentração mais elevada é usada durante o processo de extracção e, em seguida, é reduzido durante os passos de ligação e de lavagem. </li></ol></li><li> Preparação de Lisados ​​celulares <ol><li> Ressuspender 500 ul de PCV em 2,5 ml de LAP300 com ditiotreitol 0,5 mM (DTT) e inibidores da protease. Adicionar 90 mL de 10% phenoxypolyethoxylethanol nonil (0,3% final) e misturar por inversão. </li><li> Colocar em gelo durante 10 min. Centrifugar a 21000 xg durante 10 min. Recolha este sobrenadante baixa velocidade (LSS). Tomar 10 ul do LSS para análise em gel. </li><li> Transferir para um tubo de LSS TLA100.3 e centrifugação a 100.000 xg durante 1 h a 4 ° C. Recolha este sobrenadante de alta velocidade (HSS), num tubo e colocar em gelo. Tomar 10 ul do HSS para análise em gel. NOTA: Evite tomar o topo de uma camada mais lipídicad a camada mais inferior restos celulares. A camada de lípido deve ser removido por aspiração a vácuo antes da recolha do HSS. </li></ol></li><li> Primeiro de captura por afinidade: ligação a esferas anti-GFP <ol><li> -Eluir Pré anticorpo acoplado grânulos (use 160 ul de contas por 0,5 mL de sedimento de células (PCV)), lavando-se 3 vezes com 1 ml de tampão de eluição [3,5 M de MgCl2 com Tris 20 mM, pH 7,4] para se livrar de desacoplado anticorpos e reduzir o fundo. Faze-o depressa. Não deixe grânulos em alta sal por um longo tempo. </li><li> Lavar as esferas 3 vezes com 1 ml de N LAP200. Misture HSS extrai-se com esferas de anticorpo durante 1 hora a 4 ° C. Centrifugar a 21000 xg durante 10 min. Retirar uma amostra de 10 ul do sobrenadante (isto é, o fluxo de passagem (FT)) para análise em gel. </li><li> Lavar as esferas 3 vezes com 1 ml de N LAP200 com inibidores 0,5 mM de DTT e inibidores da protease. Lavar as esferas 2 vezes (5 min cada) com 1 ml de N LAP200 com inibidores 0,5 mM de DTT e inibidores da protease. Lave rapidamente 2 tIMEs com 1 ml de N LAP200 com DTT 0,5 mM e não há inibidores de protease antes de adicionar a protease do virus da gravura do tabaco (TEV). </li></ol></li><li> TEV clivagem <ol><li> Dilui-se 10 ug protease TEV em 1 ml de N LAP200 e rodar os tubos a 4 ° C durante a noite. NOTA: Este passo pode ser optimizado para qualquer proteína marcada com LAP para ser completada em poucas horas, ajustando a concentração de protease de TEV, que pode auxiliar a preservação de complexos de proteínas marcadas com LAP. </li><li> grânulos de pellets e transferência de sobrenadante para um novo tubo. Lavar duas vezes com esferas de 160 ul LAP200 N com DTT 0,5 mM e inibidores de protease (concentração tripla) para remover qualquer proteína residual. Retirar uma amostra de 10 ul do sobrenadante para análise em gel. </li></ol></li><li> Em segundo lugar captura por afinidade: A ligação a Proteína S agarose <ol><li> Lavar um tubo de 80 ul de suspensão de agarose a proteína S (40 ul embalado resina) 3 vezes com 1 ml de N LAP200. NOTA: prot Sein ligação ao S-tag vai reconstituir uma RNase activa e uma segunda marca alternativa epitopo devem ser considerados para complexos de proteína RNA contendo. </li><li> Adicionar TEV eluída sobrenadante para S contas de agarose de proteína e rock durante 3 horas a 4 ° C. Grânulos de pellets e lavar 3 vezes com 1 ml de N LAP200 com inibidores 0,5 mM de DTT e inibidores da protease. Lavar as esferas 2 vezes com 1 ml de LAP100. </li></ol></li><li> a eluição da proteína <ol><li> Eluir proteínas fora proteína S de agarose através da adição de 50 ul de tampão de amostra de Laemmli 4x e aquece-se a 97 ° C durante 10 min. NOTA: As proteínas também podem ser eluídos a partir das pérolas com tampão de eluição (3,5 M com MgCl2 20 mM Tris, pH 7,4). </li></ol></li></ol> 4. identificar proteínas que interagem por Espectrometria de Massa de Análise <ol><li> Testar a qualidade da purificação por meio da análise das amostras colhidas por electroforese em dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), coloração com prata do gel (ver <strong&gt; Materiais Tabela) e por imunotransferência dos eluatos e sondagem com anticorpos anti-GFP para assegurar que a purificação marcado com LAP trabalhou 16, ver Figura 4. </li><li> Para identificar as espécies co-purificação estequiométrico e subestequiométricas, pegue a amostra final de eluição e separá-lo por SDS-PAGE. Manchar o gel com uma mancha de proteína compatível espectrometria de massa. Extirpar as bandas mais proeminentes e o espaço entre eles a partir do gel e processá-los para análise por espectrometria de massa separadamente 16. NOTA: Existem várias abordagens para separar os eluatos finais de purificação e preparando-os para a espectrometria de massa 5. Por exemplo, complexos purificados-LAP pode ser eluída a partir de pérolas de proteína S através da utilização de sal elevado (3,5 M MgCl 2) e toda a população de proteínas em massa pode ser analisado por espectrometria de massa 17. Em alternativa, os eluatos finais pode ser separada por um milímetro por SDS-PAGE e uma única banda de 1 milímetro e pode serxcised e analisados. Isto elimina a mistura complexa de quaisquer grânulos ou partículas em suspensão que possam interferir com a análise. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo delineado descreve a clonagem de genes de interesse no vector de codificação de LAP, a geração de linhas celulares estáveis ​​marcado com LAP indutíveis, e a purificação de complexos de proteínas marcadas com LAP para análises proteomic. Com relação a outras abordagens LAP / TAP-tagging, este protocolo foi simplificada para ser compatível com as abordagens de alto rendimento para mapear localização de proteínas e proteína-proteína interações dentro de qualquer via celular. Esta abordagem tem sido amplamente aplicada para a caracterização funcional de proteínas críticas para a progressão do ciclo celular, a formação do fuso mitótico, homeostase polares de fusos, e ciliogênese para citar alguns e tem ajudado a compreensão de como a desregulação destas proteínas pode levar a doenças humanas 15, 16,19,20. Por exemplo, o nosso grupo recentemente utilizado este sistema para definir a função e regulação da cinesina STARD9 mitótico (um alvo câncer candidato) na montagem do fuso 15,21, para definir umnova ligação molecular entre a cadeia Tctex1d2 dineína luz e síndromes costela polydactyly curtas (SRP) 19, e definir uma nova ligação molecular para entender como mutação da ubiquitina ligase Mid2 pode levar a deficiências intelectuais ligadas ao X 16. Outros laboratórios também aplicado com sucesso este método, incluindo um que determinou que Tctn1, um regulador de rato de sinalização Hedgehog, foi uma parte de um complexo de proteína associada a membrana que a composição ciliopathy ciliar regulamentado e ciliogênese de uma maneira dependente do tecido 22,23. Portanto, este protocolo pode ser amplamente aplicada à dissecção de qualquer via celular. Um passo crítico neste protocolo é a seleção de linhagens de células estáveis ​​marcado-LAP que são resistentes a higromicina. Deve ser tomado cuidado especial para assegurar que todas as células na placa de controlo são mortos antes de seleccionar focos na placa experimental para amplificação. Higromicina também pode ser added durante a cultura de células de rotina de linhas celulares estáveis ​​marcado-LAP, garantir que todas as células manter o gene marcado-LAP de interesse no local FRT. Que advertem que nem todas as proteínas marcadas no LAP irá ser funcional e que é importante a ter lugar em ensaios que podem ser utilizados para testar a função da proteína. Exemplos de ensaios utilizados para testar a função de proteínas incluem o resgate de fenótipos induzida pelo siRNA e em ensaios de actividade in vitro. Para resolver quaisquer problemas potenciais com a adição de um grande LAP-tag, geramos anteriormente vetores TAP-tag compatíveis com este sistema, que contêm marcas menores, como FLAG, que são menos propensos a inibir a função e localização da proteína de interesse 4. Além disso, não existem vectores de codificação de LAP para gerar proteínas marcadas no LAP C-terminal ou proteínas marcadas com TAP C-terminais que são compatíveis com este sistema, que pode ser usado nos casos em que um LAP / etiqueta TAP não é tolerado no N -terminus de uma proteína. Além disso, The concentrações de sal e de detergente dos buffers de purificação (LAPX N) pode ser modificado para aumentar ou diminuir a severidade de purificação se não se observar nenhuma ou muito muitos interacções. Da mesma forma, o processo de purificação de afinidade em tandem é mais rigoroso do que os processos de purificação e interactianos fracos única pode ser perdido, assim, um único esquema de purificação pode ser usado quando poucos ou nenhum interagentes são identificados. É importante notar que existem outras abordagens GFP epitopo de marcação que permitem que a proteína GFP grande escala marcação para localização de proteínas e de purificação estudos 24,25. Estes incluem a abordagem BAC TransgenOmics que utiliza cromossomos artificiais bacterianos para expressar genes GFP de interesse de seu ambiente nativo que contém todos os elementos de regulação, que imita expressão do gene endógeno 24. Mais recentemente, CAS9 / RNA-guiado (sgRNA) complexos de ribonucleoproteína (RNPs) têm sido utilizados para acabarogenously marcar os genes de interesse com um sistema split-GFP que permite a expressão de genes de GFP a partir de loci genómica endógena 25. Embora ambas as abordagens permitem a expressão de proteínas marcadas, sob condições endógenas, em comparação com o protocolo de LAP a etiquetagem aqui descrito, que não permitem expressão indutível e sintonizável dos genes marcadas de interesse. Além disso, eles têm ainda de ser aplicadas ao epitopo em tandem marcação para TAP. É também importante notar que outros sistemas de marcação também pode ser modificada para se tornar compatível com o sistema aqui descrito para gerar linhas celulares estáveis ​​marcadas no epitopo indutíveis. Por exemplo, a identificação biotina dependente de proximidade (BioID) tem atraído atenção considerável devido à sua capacidade para definir relações espaciais e temporais entre as proteínas que interagem 26. Esta técnica explora fusões de proteínas a uma estirpe promíscuo da Escherichia coli biotina ligase BirA, que biotinilaré qualquer proteína a cerca de 10 nm de raio da enzima ~. As proteínas biotiniladas são, em seguida, purificado por afinidade utilizando a captura de biotina-afinidade e analisadas quanto à composição por espectrometria de massa. BirA vai biotinilar qualquer proteína em estreita proximidade, mesmo transitoriamente, o que o torna especialmente adequado para a detecção de parceiros que interagem mais fracas dentro de um complexo 27. Além disso, o esquema de purificação não necessita que as interacções proteína-proteína endógenos permanecer intacto e pode ser levada a cabo sob condições de desnaturação, reduzindo assim a taxa de falsos positivos. Dentro do nosso protocolo de corrente, a substituição do vector pGLAP1 por um vector BirA etiquetagem pode transformar este sistema de identificação de interacções proteína-proteína com base na afinidade para os detectar com base na proximidade. Tal sistema seria altamente vantajosa para a detecção de interacções proteína transiente como é o caso, entre muitas interacções enzima-substrato e para mapear o inte proteína-proteína espaço-temporalractions dentro de estruturas definidas como tem sido realizadas para o centrossoma e cílios 26,28.

Para investigar a função celular de uma proteína não caracterizada, é importante determinar sua localização subcelular espaço-temporal in vivo e seus parceiros proteicos que interagem. Tradicionalmente, tags de epítopos simples e em tandem fundidas ao terminal N ou C de uma proteína de interesse têm sido usadas para facilitar a localização de proteínas e estudos de interação de proteínas. Por exemplo, a tecnologia de purificação por afinidade em tandem (TAP) permitiu o isolamento de complexos proteicos nativos, mesmo aqueles que estão em baixa abundância, em linhagens celulares de leveduras e mamíferos1,2. A tecnologia de localização e purificação por afinidade (LAP) é um desenvolvimento mais recente que modifica o procedimento TAP para incluir um componente de localização através da introdução da proteína fluorescente verde (GFP) como uma das tags de epítopos3. Essa abordagem deu aos pesquisadores uma compreensão mais profunda da localização subcelular de uma proteína em células vivas, ao mesmo tempo em que mantém a capacidade de realizar purificações do complexo TAP para mapear redes de interação proteína-proteína. 
No entanto, existem muitos problemas associados ao uso de tecnologias TAP/LAP que dificultaram seu uso generalizado em células de mamíferos. Por exemplo, o período de tempo necessário para gerar uma linha celular estável expressando uma proteína de interesse marcada com TAP/LAP; que normalmente depende da clonagem do gene de interesse em um vetor viral e da seleção de integrantes estáveis de célula única com o nível de expressão desejado. Além disso, muitas vias celulares são sensíveis à superexpressão constitutiva de proteínas (mesmo em níveis baixos) e podem prender células ou desencadear a morte celular ao longo do tempo, impossibilitando a geração de uma linhagem celular estável TAP/LAP. Essas e outras restrições impediram que as metodologias LAP / TAP se tornassem sistemas de alto rendimento para localização de proteínas e elucidação de complexos proteicos. Portanto, tem havido um interesse considerável no desenvolvimento de um sistema de marcação LAP induzível de alto rendimento para células de mamíferos que aproveite as inovações atuais em tecnologias de clonagem e linha celular. 
Aqui apresentamos um protocolo para gerar linhagens celulares estáveis com proteínas marcadas com LAP induzíveis por doxiciclina/tetraciclina (Dox/Tet) de interesse que aplica avanços nas tecnologias de clonagem e linhagem celular de mamíferos. Essa abordagem agiliza a aquisição de dados com relação à localização subcelular de proteínas marcadas com LAP, purificação de complexos proteicos e identificação de proteínas que interagem4. Embora a proteômica de afinidade utilize uma ampla gama de técnicas para elucidação de complexos proteicos5, nossa abordagem é benéfica para agilizar a identificação desses complexos e suas redes de interação nativas e é passível de marcação de proteínas de alto rendimento que é necessária para investigar vias biológicas complexas que contêm uma infinidade de constituintes proteicos. A chave para essa abordagem são os avanços nas estratégias de clonagem que permitem a clonagem acelerada e de alta fidelidade de genes-alvo em uma variedade de vetores para expressão gênica in vitro, em vários organismos, como bactérias e baculovírus, e em células de mamíferos6,7. Além disso, a colaboração ORFeome clonou milhares de quadros de leitura abertos validados por sequência em vetores que incorporam esses avanços na clonagem, que estão disponíveis para a comunidade científica8-11. Em nosso sistema, o vetor de marcação LAP pGLAP1 permite a clonagem simultânea de um grande número de clones, o que facilita a marcação LAP de alto rendimento. Este procedimento de clonagem acelerada é acoplado a uma abordagem simplificada para gerar linhagens celulares com genes de interesse marcados com LAP inseridos em um único locus genômico pré-determinado. Isso faz uso de linhagens celulares que contêm um único local de alvo de reconhecimento de flippase (FRT) em seu genoma, que é o local de integração para genes marcados com LAP. Essas linhagens celulares também expressam o repressor de tetraciclina (TetR) que se liga aos operadores Tet (TetO2) a montante dos genes marcados com LAP e silencia sua expressão na ausência de Dox / Tet. Isso permite a expressão induzível por Dox/Tet da proteína marcada com LAP a qualquer momento. Ter a capacidade de expressão de proteínas marcadas com LAP induzíveis é crítico, uma vez que muitas vias celulares são sensíveis aos níveis de proteínas críticas que governam a via e podem interromper o crescimento celular ou desencadear a morte celular quando essas proteínas são constitutivamente superexpressas, mesmo em níveis baixos, tornando impossível a geração de linhagens celulares estáveis marcadas com LAP não induzíveis12.

<table><tbody><tr><td>Kit de núcleo Flp-In T-REx</td><td>Invitrogen</td><td>K6500-01</td><td>Kit para geração de linhagens celulares que contêm um sítio FRT e expressão de TrtR</td></tr><tr><td>PETG, 5x</td><td>Nunc, Inc.&nbsp;</td><td>73520-734</td><td>Garrafa de rolo para células de crescimento</td></tr><tr><td>PETG, 2.5x</td><td>Nunc, Inc.&nbsp;</td><td>73520-420</td><td>Garrafa de rolo para células em crescimento</td></tr><tr><td>Empilhadores de células</td><td>Corning CellSTACK</td><td>3271</td><td>Empilhador de células para células em crescimento</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de 500 ml</td><td>Corning&nbsp;</td><td>431123</td><td>Tubos para a colheita de células</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Anticorpo anti-GFP de coelho</td></tr><tr><td>Grânulos de proteína A Affiprep</td><td>Biorad</td><td>156-0006</td><td>Usado como matriz para conjugação de anticorpos anti-GFP</td></tr><tr><td>Dimetilpimelimidato (DMP)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21667</td><td>Usado para conjugar anticorpos anti-GFP para grânulos de proteína</td></tr><tr><td>A TLA100.3 tubos</td><td>Beckman</td><td>349622</td><td>Tubos para centrifugação de lisados de proteínas durante a etapa de limpeza</td></tr><tr><td>TEV protease</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td>Usado para clivar a etiqueta GFP de proteínas marcadas com LAP N-terminal</td></tr><tr><td>Protease de precessão</td><td>GE Healthcare</td><td>27-0843-01</td><td>Usado para clivar a etiqueta GFP de proteínas marcadas com LAP C-terminal</td></tr><tr><td>Proteína S agarose</td><td>Novagen</td><td>69704</td><td>Usado como uma segunda matriz de afinidade durante a purificação de complexos de proteínas marcados com LAP</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel de DNA QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704/28706</td><td>Para uso na purificação de produtos de PCR de um gel de agarose</td></tr><tr><td>BP clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td>Usado para clonagem de produtos de PCR ORF no vetor de transporte pDONR221</td></tr><tr><td>LR clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>Usado para clonar a ORF do gene de interesse no vetor de marcação de LAP pGLAP1</td></tr><tr><td>ccdB Sobrevivência 2 T1R E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>A10460</td><td>Usado para propgating vetores de transporte e vetores vazios pGLAP</td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td>Reagente de transfecção para transfectar vetores em células humanas</td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Invitrogen</td><td>Q100-19</td><td>Medicamento para induzir a expressão de proteínas induzíveis por Dox/Tet&nbsp;</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Clontech</td><td>631311</td><td>Medicamento para induzir a expressão de proteínas induzíveis por Dox/Tet&nbsp;</td></tr><tr><td>Higromicina B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td>Medicamento para selecionar integrantes estáveis marcados com LAP</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Corning</td><td>61-176-RG</td><td>Medicamento para selecionar colônias bacterianas resistentes à canamicina</td></tr><tr><td>Ampicilina Fisher</td><td></td><td>BP1760-5</td><td>Medicamento para selecionar colônias bacterianas resistentes à ampicilina</td></tr><tr><td>4-20% Tris Glicina SDS-PAGE géis</td><td>Biorad</td><td>4561094</td><td>Usado para separar amostras de proteínas e eluatos finais de purificação com etiqueta LAP</td></tr><tr><td>Kit de Mancha de Prata Biorad 1610449</td><td></td><td></td><td>Usado para coloração de prata dos eluatos de purificação marcadas com LAP e amostras coletadas durante o processo de purificação&nbsp;</td></tr><tr><td>Coomassie Blue stain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>Usado para corar géis SDS-PAGE para visulizar purificações marcadas com LAP e cortar bandas de proteínas, compatível com espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Vetor de transporte pDONR221</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td>Vetor de transporte para clonagem de ORFs de genes de interesse</td></tr><tr><td>Vetor de expressão Flippase pOG44</td><td>Invitrogen</td><td>V600520</td><td>Vetor que expressa a Flippase recombinase para integrar genes marcados com LAP no genoma do local FRT contendo linhas celulares</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polimerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td>Usado para amplificação por PCR das ORFs de genes de interesse</td></tr><tr><td>4x tampão de amostra Laemmli</td><td>Biorad</td><td>1610747</td><td>Tampão de amostra para eluição de complexos de proteínas purificados marcados com LAP da matriz de esferas</td></tr><tr><td>Luria meio de caldo (LB)</td><td>Fisher</td><td>BP9723-2</td><td>Usado para o crescimento de bactérias DH5&alpha;</td></tr><tr><td>Kit de minipreparação de DNA</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td>Usado para fazer minipreparações de plasmídeo de DNA</td></tr><tr><td>Mídia DMEM/F12</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td>Para o crescimento de células humanas Hek293</td></tr><tr><td>FBS sem Tet</td><td>Altanta Biologicals</td><td>S10350</td><td>Usado para fazer -Tet DMEM/F12 mídia para gerar e cultivar linhas celulares estáveis marcadas com LAP induzíveis</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Para levantar focos de células Hek293 de placas</td></tr><tr><td>Comprimidos inibidores de protease</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Usado para fazer tampões de protocolo,</td></tr><tr><td>10% nonil fenoxipolietoxiletanol sem EDTA&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>Usado para fazer tampões de protocolo</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Usado para fazer tampões</td></tr><tr><td>de protocolo Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td>Usado para fazer tampões de protocolo</td></tr><tr><td>Borato de sódio</td><td>Fisher</td><td>S249-500</td><td>Usado para fazer tampões de protocolo</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fisher</td><td>A78-500</td><td>Usado para fazer tampões de protocolo</td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>Usado para fazer tampões de protocolo</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td>Usado para fazer tampões de protocolo</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>Usado para fazer tampões de protocolo</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>Usado para fazer tampões de protocolo</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>Usado para fazer buffers de protocolo</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Usado para fazer buffers de protocolo</td></tr></tbody></table>

induzíveis linhas celulares estáveis ​​marcado-lap para investigar a função da proteína, spatiotemporal localização e redes de interação de proteínas

Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks

Complexos multiproteicos, em vez de proteínas isoladas agindo isoladamente, geralmente governam as vias moleculares que regulam a homeostase celular. Com base nesse princípio, a purificação de proteínas críticas necessárias para o funcionamento dessas vias junto com seus parceiros nativos de interação não apenas permitiu o mapeamento dos constituintes proteicos dessas vias, mas também forneceu uma compreensão mais profunda de como essas proteínas se coordenam para regular essas vias. Nesse contexto, entender a localização espaço-temporal de uma proteína e sua rede de interação proteína-proteína pode ajudar a definir seu papel dentro de uma via, bem como como sua desregulação pode levar à patogênese da doença. Para atender a essa necessidade, várias abordagens para purificação de proteínas, como purificação por afinidade em tandem (TAP) e purificação por localização e afinidade (LAP), foram projetadas e usadas com sucesso. No entanto, para aplicar essas abordagens a análises proteômicas em escala de via, essas estratégias devem ser complementadas com desenvolvimentos tecnológicos modernos em clonagem e geração de linhagens celulares estáveis em mamíferos. Aqui, descrevemos um método para gerar linhagens celulares estáveis induzíveis humanas marcadas com LAP para investigar a localização subcelular de proteínas e redes de interação proteína-proteína. Essa abordagem foi aplicada com sucesso à dissecção de várias vias celulares, incluindo a divisão celular, e é compatível com análises proteômicas de alto rendimento.

Para realçar a utilidade deste sistema, o quadro de leitura aberta (ORF) da proteína de ligação de tau dos microtúbulos foi clonado no vector vai-vem através da amplificação do Tau ORF com iniciadores contendo locais de attB1 e attB2 (Tabela 1) e incubando os produtos de PCR com o vector de transporte e uma recombinase que medeia a inserção de produtos de PCR no vector de transporte. Os produtos de reacção foram usados para transformar DH5a bactérias 13 e o ADN plasmídico a partir de colónias resistentes à canamicina foi sequenciado para assegurar a inserção da tau. Uma sequência validado shuttle-Tau vector foi depois utilizado para transferir o Tau ORF no vector pGLAP1, que fundia Tau em enquadramento com a etiqueta de LAP (EGFP-TEV-proteína-S), por incubação do vector vaivém-tau com o vector pGLAP1 e a recombinase que medeia a transferência do ORF a partir do vector vai-vem para pGLAP1. Os produtos de reacção foram utilizados para transformar as bactérias DH5aADN 13 e do plasmídeo a partir de colónias resistentes à ampicilina foi sequenciado para assegurar que a fusão LAP-tau estava na moldura. Sequência validado pGLAP1-LAP-tau foi, em seguida, co-transfectado com um vector que expressa a enzima flipase recombinação em células HEK293 que continha um único alvo reconhecimento flipase local (FRT) no seu genoma, que é o local de integração de genes com marcação de LAP 14. Esta linha celular expressa também o TetR que se liga aos operadores Tet a montante dos genes marcadas com LAP e silencia a sua expressão na ausência de Tet / Dox. integrantes estáveis ​​foram seleccionados com -Tet meio DMEM / F12 com 100 ug / ml de higromicina durante 5 dias. Higromicina focos de células resistentes individuais foram colhidas por adição de 20 ul de tripsina na parte superior e pipetando para cima e para baixo 2 vezes. As células foram colocadas numa placa de 24 poços e expandidas por crescimento contínuo em -Tet meio DMEM / F12. Para verificar que a célula resistente à higromicinas foram capazes de expressar LAP-Tau, células HEK293 LAP-tau foram induzidas com 0,1 ug / ml Dox durante 15 hr e extractos proteicos foram preparados a partir de células não induzidas e induzidas por Dox. Estes extractos foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de PVDF, e imunotransferidas para GFP e tubulina como controlo de carga. Como observado na Figura 4A, LAP-tau (visualizado com anticorpos anti-GFP) foi apenas expresso na presença de Dox. Para validar que LAP-tau foi correctamente localizada no fuso de microtúbulos mitótico durante a mitose, como tinha sido anteriormente demonstrado para a tau endógena 18, células HEK293 LAP-tau foram induzidas com 0,1 ug / ml Dox durante 15 horas e as células foram fixadas com 4% paraformaldeído e co-coradas para ADN (Hoechst 33342) e os microtúbulos (anticorpos anti-tubulina). Consistentemente, LAP-tau foi localizada para o fuso mitótico durante a metafase da mitose (Figura 4B). Para verificar que LAP-Tau e suas proteínas que interagem pode ser purificado com este sysTem, células HEK293 LAP-tau foram cultivadas em frascos rolantes para ~ 70% de confluência, induzida com 0,1 jig / ml Dox durante 15 horas, colhidas por agitação, lisadas com tampão de LAP300, e LAP-tau foi purificado utilizando o protocolo anterior. Os eluatos a partir de purificação do LAP-tau foram resolvidas por SDS-PAGE e o gel foi corado com prata. A Figura 4C mostra a purificação LAP-Tau, marcado com um asterisco é LAP-Tau e várias outras bandas de proteínas que interagem indicativo Tau pode ser visto. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig1.jpg"> Figura 1: Visão geral da Geração de induzíveis linhas celulares estáveis marcado-colo por qualquer proteína de interesse. A grelha de leitura aberta (ORF) de genes de interesse são amplificados com os locais attB1 e attB2 flanqueamento 5 'e 3' as sequências finais, respectivamente (as sequências de iniciadores são dadas em A Tabela 1) e clonadas em o vector de transporte. Sequência é verificada vectores de vaivém com o gene de interesse são depois utilizado para transferir o gene de interesse no vector pGLAP1. A sequência verificada pGLAP1 vector com o gene de interesse é, em seguida, co-transfectado com o vector contendo a recombinase flipase para a linha celular desejada que contém um alvo único reconhecimento flipase local (FRT) no seu genoma, que é o sítio de integração do sistema LAP genes tagged. Estas linhas de células expressam também o repressor Tet (TetR) que se liga aos operadores Tet (TetO 2) a montante dos genes marcadas com LAP e silencia a sua expressão na ausência de Tet / Dox. O gene marcado-LAP de interesse é então recombinada no local DRF e integrantes estáveis ​​são seleccionadas com higromicina. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2 "src =" / files / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/&gt; Figura 2: Visão geral dos pedidos de linhas celulares estáveis com etiquetas voltas. As linhas celulares estáveis ​​indutíveis marcaram-PLA são induzidas para expressar a proteína LAP-marcadas de interesse por adição de Dox e podem ser sincronizados em várias fases do ciclo de célula ou pode ser estimulada com produtos químicos ou ligandos para activar qualquer via de sinalização desejado. A localização subcelular da proteína LAP-marcadas de interesse pode ser analisado por células vivas ou células de imagem fixa. proteínas marcadas com LAP também pode ser purificado por afinidade em tandem e suas proteínas que interagem podem ser identificadas por espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC-MS / MS). Finalmente, Cytoscape pode ser usado para gerar uma rede de interacção proteína-proteína a proteína de isco. Dox indica doxiciclina, IP indica immunoprecipitate, EGFP indica reforçada proteína verde fluorescente, Tev indica local de clivagem TEV protease, e S indica S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig3.jpg"> Figura 3: Visão geral do etiquetado-LAP expressão de proteínas, purificação e preparação para Espectrometria de Massa. O protocolo tem 9 passos: 1) crescimento e a indução da expressão da proteína LAP-tag, 2) da colheita das células e lise, 3) A preparação de lisados, 4) a ligação de lisados ​​de grânulos anti-GFP, 5) clivagem de protease de TEV de o GFP-marcador, 6) a ligação de grânulos lisados ​​a proteína-S, 7) a eluição da proteína de isco e proteínas que interagem, e 8-9), a preparação de amostras para análises de proteómica à base de espectrometria de massa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig4.jpg"> Figura 4: Verificação de expressão LAP-Tau. (A) Western Blot (WB) análise de amostras de proteína a partir de células não induzidas e Dox induzida LAP-Tau HEK293 sondados com anti-GFP e os anticorpos anti-tubulina de detectar a proteína tau marcada com LAP e o controlo da Tubulina de carga, respectivamente. Note-se que LAP-tau é expresso apenas quando as células são induzidas com Dox. Células (B) que expressam mitóticos LAP-tau foram fixadas e co-coradas para ADN (Hoechst 33342) e tubulina (cuba) com anticorpos anti-tubulina e a localização subcelular de LAP-tau foi analisada por microscopia de fluorescência. Note-se que LAP-Tau localiza aos pólos do fuso e do fuso mitótico durante a mitose. (C) corado com prata do gel da purificação LAP-tau. MW indica o peso molecular, CL indica lisados ​​límpidos e E indicates eluatos finais. As amostras foram corridas em 4-20% SDS-PAGE e o gel foi corado com prata para visualizar as proteínas purificadas. Note-se que uma banda correspondendo a LAP-Tau está marcado com um asterisco e várias outras bandas correspondentes às proteínas co-purificação pode ser visto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fusão N-terminal </td><td></td></tr><tr><td> para a frente </td><td> 5'-GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr><tr><td> Reverso </td><td> 5'-T GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT TTATCA - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr><tr><td> Fusão C-terminal </td><td></td></tr><tr><td> para a frente </td><td> 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr><tr><td> Reverso </td><td> 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT L - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Avanço e retrocesso Primers para amplificar ORF ou interesse para inserção no vector de transporte. Os locais attB são destacadas em negrito, GSN indica que os nucleótidos específicos mais de 18 genes são adicionados ao iniciador. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Passo </td><td> Temperatura </td><td> Tempo </td></tr><tr><td colspan="2"> A desnaturação inicial </td><td> 94 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td rowspan="3"> Ciclos de PCR de amplificação (35) </td><td> Desnaturar </td><td> 94 ° C </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> recozer </td><td> 55 ° C (dependendo o primer Tm) </td><td> 30 seg </td></tr><tr><td> Ampliar </td><td> 72 ° C </td><td> 1 min / KB </td></tr><tr><td colspan="2"> Aguarde </td><td> 4 ° C </td><td> indefinidamente </td></tr></tbody></table> Tabela 2: As condições de PCR para amplificação das ORFs de interesse. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Vetor </td><td> Adiante Sequencing Primer </td><td> Reverter Sequencing Primer </td></tr><tr><td> Vector shuttle </td><td> 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' </td><td> 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' </td></tr></tbody></table> Tabela 3: frente e reverso Sequencing Primers para o vector de transporte. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> identidade </td><td> Estrutura </td><td> Parental </td><td> Promotor </td><td> Bac Res </td><td> Mam Res </td><td> Tet reg? </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> péptido N-terminal de EGFP-TEV-S </td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td> amp </td><td> Hyg </td><td> sim </td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> peptídeo N prazo Bandeira-TEV-S </td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td> amp </td><td> Hyg </td><td> sim </td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> N-EGFP termo péptido-TEV-S; C prazo V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td> amp </td><td> Hyg </td><td> Não </td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> N prazo peptídeo Bandeira-TEV-S; ; C prazo V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td amp></td><td> Hyg </td><td> Não </td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> S C-termo péptido-PreProt X2-EGFP </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td> amp </td><td> Hyg </td><td> Não </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Lista de vetores LAP / TAP disponíveis com os promotores variáveis, epitopo de marcas e capacidades de expressão Dox induzíveis para N ou Tagging Proteína C-terminal. Os vectores estão comercialmente disponíveis. Bac Res indica marcador de resistência bacteriana, Mam Res indica marcador de resistência de células de mamíferos, Tet reg? indica se a expressão é Tet / Dox regulável. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Vetor </td><td> Adiante Sequencing Primer </td><td> Reverter Sequencing Primer </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' </td><td> 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' </td><td> 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' </td><td> 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' </td><td> 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' </td><td> 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' </td></tr></tbody></table> Tabela 5: Avanço e retrocesso Sequencing Primers para pGLAP vetores.

Descrevemos um método para gerar linhagens celulares estáveis induzíveis marcadas com localização e purificação de afinidade (LAP) para investigar a função proteica, localização subcelular espaço-temporal e redes de interação proteína-proteína.

Induzíveis linhas celulares estáveis ​​marcado-LAP para investigar a função da proteína, Spatiotemporal Localização e redes de interação de proteínas

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar localização induzível e purificação de afinidade, ou linhagens celulares estáveis marcadas com LAP, para investigar a função proteica, localização espaço-temporal e redes de interação proteica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia molecular e celular relacionadas à função da proteína, localização subzero do ciclo celular da proteína e interações proteicas. A principal vantagem deste método é que ele é passível de análise de alto rendimento de grupos de proteínas e pode ser usado para dissecar os componentes proteicos de vias biológicas.Para iniciar este procedimento, clone o quadro de leitura aberto do gene de interesse no vetor marcado com LAP e transfecte-o em células HEK293 conforme descrito no protocolo de texto. Um dia após a transfecção, substitua o meio menos Tet DMEM/F12 por meio novo. Dois dias após a transfecção, dividir as células em 25% de confluência.Deixe as células se ligarem por aproximadamente cinco horas. Em seguida, adicione meios contendo higromicina menos Tet DMEM / F12 na concentração predeterminada. Para células HEK293, use 100 microgramas por mililitro de higromicina.Substitua o meio conforme necessário até que apareçam focos celulares distintos que se assemelhem a manchas opacas contra a placa transparente. Adicione 20 microlitros de tripsina em cima de cada foco de célula e canalize-o para cima e para baixo duas vezes com uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Transfira as células em uma placa de 24 poços e expanda as células por crescimento contínuo em meios contendo higromicina menos Tet DMEM / F12.Expanda a linha celular validada marcada com LAP para purificação de afinidade em tandem, ou TAP, isolamento de complexos de proteínas. Para fazer isso, passe continuamente todas as células HEK293 em placas maiores e/ou garrafas de rolo, e menos o meio Tet DMEM/F12 a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Para linhagens celulares induzíveis por Tet/Dox, induza as células por 10 a 15 horas adicionando uma concentração de 0,2 microgramas por mililitro de Tet/Dox quando as células atingirem aproximadamente 70% de confluência.Colha as células por agitação ou tripsinização. Em seguida, pegue-os a 875 vezes g por cinco a 10 minutos. Para acoplar o anticorpo anti-GFP às esferas de proteína A, equilibre 160 microlitros de esferas de proteína A de volume concentrado com PBST em um tubo de 1,5 mililitro.Lave as contas três vezes com 1 mililitro de PBST. Após cada etapa de lavagem ao longo deste procedimento, os grânulos são centrifugados a 5000 vezes g por 10 segundos e o sobrenadante é removido. Depois de ressuspender os grânulos em 500 microlitros de PBST, adicione 80 microgramas de anticorpo anti-GFP rápido purificado por afinidade a cada tubo, contendo 160 microlitros de grânulos.Misture por uma hora em temperatura ambiente. Lave as contas duas vezes com um mililitro de PBST, depois lave as contas duas vezes com um mililitro de borato de sódio 0,2 molar, pH Após a lavagem final, adicione 900 microlitros do tampão de borato de sódio, para trazer o volume final para um mililitro. Em seguida, adicione 100 microlitros de DMP de 220 molares à suspensão do grânulo, para uma concentração final de 20 milimolares.Gire os tubos suavemente em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação com DMP, lave as esferas uma vez com um mililitro de etanolamina 0,2 molar, cloreto de sódio 0,2 molar pH 8,5, para inativar o reticulador residual. Em seguida, ressuspenda as contas em um mililitro do mesmo tampão e gire por uma hora em temperatura ambiente.Depois de peletizar as contas, suspenda-as novamente em mais 500 microlitros do tampão. As contas preparadas são estáveis por vários meses a quatro graus Celsius. Para preparar os lisados celulares, ressuspenda 500 microlitros de volume globular em 2,5 mililitros de LAP 300, com DTT 0,5 milimolar e inibidores de protease.Adicione 90 microlitros de 10% de nonil fenoxipolietoxiletanol e misture por inversão. Coloque a mistura no gelo por 10 minutos. Centrifugar a 21 000 vezes g durante 10 minutos.Após centrifugação, recolher este sobrenadante de baixa velocidade e retirar uma amostra de 10 microlitros para análise do gel. Depois de transferir o sobrenadante de baixa velocidade para um tubo TLA 100.3, gire a 100.000 vezes g por uma hora a quatro graus Celsius. Recolher este sobrenadante de alta velocidade num tubo e colocá-lo no gelo, reservando uma amostra de 10 microlitros para análise do gel.Para a primeira captura de afinidade por meio da ligação a grânulos anti-GFP, pré-eluída os grânulos acoplados a anticorpos lavando-os três vezes com um mililitro de tampão de eluição para remover os anticorpos desacoplados e reduzir o fundo. Faça isso rapidamente. Não deixe as contas com alto teor de sal por muito tempo.Em seguida, lave as esferas três vezes com um mililitro de LAP 200 N. Em seguida, misture o extrato sobrenadante de alta velocidade com esferas de anticorpos por uma hora a quatro graus Celsius. Depois de centrifugar o extracto a 21 000 vezes g durante 10 minutos, reservar uma amostra de 10 microlitros do sobrenadante para a análise do gel. Realize três lavagens rápidas dos grânulos com um mililitro de LAP 200 N, contendo 0,5 milimolar DTT e inibidores de protease.Use o mesmo tampão para lavar as contas mais duas vezes com um tempo de incubação de cinco minutos para cada lavagem. Em seguida, lave as esferas rapidamente mais duas vezes com 1 mililitro de LAP 200 N contendo 0,5 milimolar de DTT e sem inibidores de protease, antes de adicionar a protease do Tobacco Etch Virus, ou TEV. Adicione 10 microgramas da protease TEV em um mililitro de LAP 200 N aos grânulos e gire os tubos a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, pelete as contas e transfira o sobrenadante para um tubo novo. Enxágue as esferas duas vezes com 160 microlitros de LAP 200 N, contendo 0,5 milimolar DTT e inibidores de protease para remover qualquer proteína residual. Para a segunda captura de afinidade através da ligação à proteína S agarose, lave um tubo de 80 microlitros de pasta de agarose S-proteína três vezes com um mililitro de LAP 200 N. Adicione o sobrenadante eluído TEV às esferas de proteína S e balance-as por três horas a quatro graus Celsius.Depois de peletizar as contas, lave-as três vezes com um mililitro de LAP 200 N contendo 0,5 milimolar de DTT e inibidores de protease. Em seguida, lave as contas duas vezes com um mililitro de LAP 100. Eluir as proteínas da agarose da proteína S adicionando 50 microlitros de tampão de amostra 4x Laemmli e aquecendo a 97 graus Celsius por 10 minutos.Para identificar proteínas interagentes por análise de espectrometria de massas, testar a qualidade da purificação analisando as amostras coletadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio. A prata mancha o gel resultante. Além disso, imunoblot os eluatos e a sonda com anticorpos anti-GFP para garantir que a purificação marcada com LAP funcionou.Para identificar espécies co-purificadoras estequiométricas e subestequiométricas, pegar a amostra final de eluição e separá-la por SDS-PAGE. Manchar o gel com uma coloração de proteína compatível com espectrometria de massa. Extirpar as bandas mais proeminentes do gel e o espaço entre elas para processar as bandas separadamente para análise por espectrometria de massa.Aqui é mostrada uma análise representativa de western blot das amostras de proteínas de células LAP-Tau HEK293 não induzidas e induzidas por Dox. As células são sondadas com anticorpos anti-Tubulina para detectar o controle de carga de Tubulina e sondadas com anti-GFP para detectar a proteína Tau marcada com LAP. Observe que o LAP-Tau só é expresso quando as células são induzidas com Dox.As células mitóticas que expressam LAP-Tau foram fixadas e co-coradas para DNA e tubulina com anticorpos anti-tubulina, e a localização subcelular de LAP-Tau foi analisada por microscopia de fluorescência. Observe que o LAP-Tau se localiza no fuso mitótico e nos pólos do fuso durante a mitose. Aqui é mostrado um gel corado de prata representativo da purificação LAP-Tau.As pistas representam o peso molecular, os lisados limpos e os eluatos finais. As amostras foram executadas em um gel 4-20% SDS-PAGE e o gel foi corado com prata para visualizar as proteínas purificadas. Observe que uma banda correspondente a LAP-Tau é marcada com um asterisco, e várias outras bandas correspondentes a proteínas co-purificadoras podem ser vistas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar linhagens celulares estáveis induzíveis marcadas com LAP e como realizar purificações bioquímicas de proteínas marcadas com LAP para análise proteômica e identificação de redes de interação de proteínas.

inducible-lap-tagged-stable-cell-lines-for-investigating-protein

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Biology

Biologia

Este vídeo descreve o ensaio de ligação de proximidade para estudar as interações proteína-proteína in situ em células de nematóides. A proximidade das proteínas de interesse gera o molde circular de DNA com a ajuda de uma sonda PLA ligada a um anticorpo secundário. A sonda é ainda amplificada usando a solução de amplificação, que produz um DNA longo de fita simples seguido pela hibridização da sonda detectora, permitindo a localização de interações proteína-proteína nas células.

Ensaio de ligação de proximidade para estudar interações proteína-proteína in situ

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

As junções intercelulares são requisitos para funções e desenvolvimento específicos do estágio da glândula mamária. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para o estudo das interações proteína-proteína (IPPs) e co-localização usando glândulas mamárias murinas. Estas técnicas permitem a investigação da dinâmica da associação física entre junções intercelulares em diferentes estádios de desenvolvimento.

Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas

Nós fornecemos um protocolo passo a passo para dividir-BioID, um ensaio de fragmentos-complementação de proteínas com base na técnica de criação de etiquetas de proximidade BioID. Ativado na interação das duas proteínas determinadas, permite a análise proteômica de contexto-dependente da proteína em seu ambiente nativo do celular. O método é simples e econômica e só requer equipamentos de laboratório padrão.

Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

Aqui, nós mostramos como usar uma proximidade da ligadura do ensaio (PLA) para visualizar MST1/MST2 heterodimerization em células fixas com alta sensibilidade.

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Aqui apresentamos um protocolo clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq com purificação de tandem FLAG-biotin para determinar os alvos do RNA de proteínas de ligação de RNA (RBPs) em células de mamíferos.

Transcriome-Wide Perfil de Interações Protein-RNA por Cross-Linking e Imunoprecipitação Mediada pela Flag-Biotin Tandem Purification

Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.

Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase

Aprenda a gerar linhas celulares estáveis induzíveis com marcação LAP para investigar função proteica, localização e redes de interação. Este método permite análise de alta vazão em células HEK293.

Induzíveis linhas celulares estáveis ​​marcado-LAP para investigar a função da proteína, Spatiotemporal Localização e redes de interação de proteínas (Vídeo) | JoVE Journal

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