Name: Um Estudo Comparativo de drogas métodos de entrega direcionados à orelha de rato Inner: Bullostomy Versus Injeção transtimpânica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda duas técnicas microcirúrgicas de entrega de fármacos para o ouvido interno em camundongos: bullostomy e injeção transtimpânica. Este método compara os efeitos na audição e na citoarquitetura coclear.

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Os autores gostariam de agradecer aos Genomics e instalações não-invasiva Neurofuncional de Avaliação (IIBM, CSIC-UAM) por seu apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por subsídios do espanhol &quot;Ministerio de Economia y Competitividad&quot; (FEDER-SAF2014-53979-R) e da União Europeia (FP7-AFHELO e FP7-PEOPLE-TARGEAR) para IVN.

Assegurar que os procedimentos de manuseio de animais estão em conformidade com os regulamentos nacionais e internacionais. O protocolo segue a RD Comunidade Europeia 2010/63 / UE e espanhol 53/2013 diretrizes, respectivamente. Manuseamento 1. animal Geral <ol><li> Ratos de alimentação ad libitum com uma dieta padrão e água potável. controlo sanitário eo bem-estar seguindo Federação das Associações de animais de laboratório Ciência (FELASA) recomendações. </li></ol> Avaliação 2. Audição NOTA: Pista impacto funcional de procedimentos microcirúrgicos por testes de audição antes e muitas vezes após a cirurgia (neste trabalho 2, 7, 14 e 28 d postmicrosurgery) com os procedimentos não-invasivos, como a ABR 9. <ol><li> Para os testes de ABR, anestesiar ratos com protocolos de efeito de curta duração, ou seja, injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg de peso corporal (PC) e xilazina (10mg / kg, BW). Alternativamente, realizar testes de audição sob anestesia inalatória. Observação: Uma vez que os parâmetros ABR podem ser influenciados pelo protocolo de anestésico 28, utilizar o mesmo durante todo o experimento. </li><li> Verifique a profundidade da anestesia, testando o reflexo toe-pitada. NOTA: Quando o reflexo de retirada desaparece, o animal atingiu uma profundidade adequada da anestesia para realizar testes auditivos. </li><li> Proteger os olhos de dessecação e ceratoconjuntivite seca secundária por administração tópica de suplementos lacrimais, tais como géis à base de hidroxipropilmetilcelulose. </li><li> Manter o rato à temperatura fisiológica (37,5-38 ° C) durante todo o procedimento. Para evitar interferência elétrica, use um quente almofadas de bomba de água e aquecimento. Monitorar a temperatura do corpo com sondas retais. Sempre tome cuidado para não superaquecer o animal. NOTA: Recomendamos a limpeza da almofada de aquecimento com um desinfectante de superfície entre camundongos.0; Para a indução anestésica e recuperação, almofadas de aquecimento eléctricos, lâmpadas incandescentes ou luzes infravermelhas podem ser usados. </li><li> procedimento ABR NOTA: Para a inscrição ABR, use uma estação de trabalho computador com uma placa de som interior para criar formas de onda (digital para analógico, saída de DA, a conversão) e para digitalizar as formas de onda de resposta elétricos (analógico para entrada digital, AD), um atenuador, um osciloscópio e um amplificador de baixa impedância. Estações de trabalho auditivas modernos (ou seja, Tucker Davis Techonologies) incluem todos os componentes em um único sistema compacto. <ol><li> Coloque o rato anestesiado em decúbito ventral sobre as almofadas de aquecimento dentro de uma câmara de atenuação do som para evitar interferência de ruído ambiente e reverberação (Figura 1). </li><li> Entregar estímulos acústicos para dentro do canal auditivo externo. Use estímulos predefinidos ou novos sinais projetados com o software apropriado. Ligue a saída da estação de trabalho DA para o alto-falante selecionado. NOTA: Frealto-falantes e em campo ou em campo fechado inseridos no canal auditivo externo poderia ser usado. O primeiro são os preferidos quando se trabalha com os ratos por causa da dificuldade na inserção da sonda e calibração de som em sistemas fechados. alto-falantes de campo livre estimular ambas as orelhas e provocar uma resposta binaural. Para obter respostas predominantemente mono com alto-falantes em campo livre, atividade contralateral tem de ser eliminado pela oclusão (ou seja, com tampões de ouvido) ou por mascarar o ruído. <ol><li> Coloque altifalante em campo livre a uma distância fixa (geralmente de 5-20 cm) de frente para a cabeça ou orelha seleccionado com o centro do altifalante alinhado com o canal auditivo externo. Certifique-se que não há obstáculos são entre o alto-falante e o ouvido e que o pavilhão auricular está completamente aberta. </li></ol></li><li> Coloque aço inoxidável eléctrodos de agulhas subdérmicos como se segue: i) a substância activa) eléctrodo (positivo no couro cabeludo entre as orelhas (sobre o vértice do crânio), ii) o eléctrodo de referência (negativo), na parótidaregião abaixo do pavilhão auricular, e iii) o eléctrodo de terra na região do membro traseiro, cauda ou posterior (Figura 1). <ol><li> Verifique a impedância elétrica nos eletrodos positivos e negativos. Assegure-se que a impedância for inferior a 3 kOhm (idealmente 1 kOhm). Se for maior, reposicionar, limpo com álcool ou substituir os eletrodos. </li></ol></li><li> Para a gravação ABR, gerar cliques de banda larga e frequências tonais e presente em intensidade decrescente 90-10 dB em relação ao nível de pressão sonora (SPL) em 5-10 dB SPL as etapas 27, 29, 30. <ol><li> Presente breve clique ou tone burst estímulos (1-5 ms) começam com o nível elevado (ou seja, 80 ou 90 dB SPL) e reduzindo a intensidade em 5-10 passos SPL dB. Registre a resposta elétrica nos primeiros 10 ms após a estimulação (respostas evocadas ABR aparecer em 6-8 ms). Nota: Para esta razão, as taxas de estimulaçãonão deve ser superior a 50 / s (estímulos taxa normal de 20-50). </li></ol></li><li> Amplificar, gravar e, em média, a resposta elétrica evocada para cada estímulo e intensidade. Use um amplificador com baixo nível de ruído e uma boa relação sinal-ruído, e conectá-lo à entrada AD. NOTA: ABRs têm muito baixas amplitudes, tipicamente abaixo de 1 mV (pico-a-pico) e devem ser gravados utilizando um amplificador com ruído muito baixo. Em camundongos com audição normal, ondas claras ABR surgem após uma média de 100 - 200 respostas, no entanto para obter gravações de alta qualidade, ou, no caso da deficiência auditiva, mais repetições são recomendados (750-1.000) 27. </li><li> Visualmente determinar o limiar ABR durante o ensaio. NOTA: O limite ABR é o menor estímulos sonoros intensidade que provoca uma ABR confiável gravar com ondas I a IV claramente visível e média tensão 2 DP de pico-a-pico acima da atividade de fundo média 31. Estes dados tem que ser confirmado dutocar análise off-line, juntamente com outros parâmetros, incluindo picos e interpicos latência e onda amplitudes. </li><li> Executar análise de dados manual ou automaticamente. <ol><li> Para análise manual, identificar os 4-5 ABR ondas (I, II, III, etc ....) E marcar os picos (P1, P2, P3 ...) e vales (N1, N2, N3, ...) para cada onda. Uma vez que a análise for concluída, os dados de exportação para planilha ou arquivo de texto. NOTA: O software específico para gravação de resposta elétrica normalmente realiza a análise automaticamente. Medições adicionais podem ser determinados na gravação de ABR em resposta a uma intensidade fixa (isto é, 70 ou 80 dB SPL) ou em intensidades relativas de limiares de clique individuais (isto é, 15 dB SPL limiar). </li></ol></li></ol></li><li> Realizar a análise estatística dos dados ABR utilizando o software apropriado. Dependendo do desenho experimental, o uso padrão emparelhado T-teste ou análise de variância (ANOVA) para comparar principal parâme ABRters nos diferentes grupos 26, 30. NOTA: Em estudos longitudinais, muitos dados funcionais são recolhidos a partir do mesmo animal em diferentes pontos temporais (ou seja, antes e após microcirurgia). Neste caso, um modelo repetido teste de medida linear geral fornece uma análise de variância detalhado. </li></ol> 3. Preparação de Veículo <ol><li> Preparar e usar soluções de veículo em condições estéreis. NOTA: As soluções líquidas são normalmente eliminadas rapidamente através da trompa de Eustáquio. Diferentes sistemas de libertao injectel pode ser utilizada para aumentar o tempo de residência da droga no ouvido médio, incluindo hidrogeles e nanopartículas 32. <ol><li> Para preparar CGP-hidrogel, dissolver 75% de quitosano desacetilado em ácido acético 0,2 M obtendo-se uma solução de quitosano de 1,5-2% (peso / peso). Adicionar 9% glicerofosfato (peso / peso) a esta solução 7. Preparar a soluçãoimediatamente antes da administração e armazenar o hidrogel a 4 ° C até à sua utilização. NOTA: O CGP-hidrogel é moderadamente viscosa mas ainda injectável a esta temperatura. Abaixo de 4 ° C muda para uma fase sólida, bloqueando a sua aplicação. Após a aplicação, CGP sofre uma transição de fase para um gel semi-sólido, em cerca de 15 min a 37 ° C. </li><li> Alíquota (0,5 ml) de tampão RL comercial e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. </li></ol></li></ol> 4. procedimentos microcirúrgicos <ol><li> Induzir a anestesia geral com cetamina base de analgésicos e sedativos (isto é, a cetamina 100 mg / kg, medetomidina 0,05 mg / kg e phentanile 0,025 mg / kg) por injecção intraperitoneal, seguido de agentes inalantes (isto é, isoflurano). <ol><li> Depois de administrar agentes injetáveis, ajuste a máscara anestésico ao focinho do mouse e conecte o fornecimento de O 2 ao vapor de isoflurano. Manter a anestesia inalatória durante omicrocirurgia e monitorar o plano anestésico com o reflexo toe-pitada e padrão de respiração. Começar a preparação cirúrgica, quando o reflexo é totalmente abolida eo mouse apresenta respiração regular. </li><li> Manter a temperatura corporal com almofadas de aquecimento durante todo o procedimento e proteger os olhos de queratite na córnea com um gel à base de hidroxipropil metilcelulose. </li></ol></li><li> Prepare uma área cirúrgica limpa usando campos estéreis. Esterilizar os instrumentos microcirúrgicos com um esterilizador-esferas de vidro antes da cirurgia. Manter condições estéreis durante todo o procedimento cirúrgico (luvas estéreis, cortinas, instrumentos cirúrgicos, etc.). </li><li> microcirurgia <ol><li> Bullostomy NOTA: Bullostomy é um procedimento unilateral. Operar uma orelha do mouse e usar o ouvido contralateral como controle. <ol><li> Posicione o mouse na posição supina decúbito. Prepare a área cirúrgica na superfície ventral do pescoço para usando cortadoresremover a pele. Limpe a pele com solução anti-séptica com base iodopovidona, e cobri-lo com campos estéreis. </li><li> Usando um bisturi, faça uma incisão longitudinal de 2 cm da mandíbula até a clavícula. </li><li> Sob ampliação com um microscópio cirúrgico, identificar as glândulas submandibular e separar ambos com fórceps. Retrair as glândulas submandibulares e localizar a origem do músculo digástrico e do nervo facial. </li><li> Realizar uma incisão na origem do músculo digástrico com uma tesoura, e recolhê-lo ventralmente, expondo o aspecto inferior-medial subjacente da bula timpânica. </li><li> Realizar uma abertura na bula por perfuração nela com uma agulha 27 G (Figura 2A). Localizar a artéria estapediano eo caudal de membrana RW para ele (Figura 2B). Limpar o sangue a partir da área perfurada com uma esponja de gelatina absorvível. </li><li> Usando um G cateter 34 e uma seringa micro vidro, injecte lentamente 3-5 μL de solução de veículo (CGP-hidrogel ou RL) através da bullostomy directamente sobre o nicho RW, enchendo-a (Figura 2C). Selar o bullostomy com 1-2 gotas de cola de tecido. </li><li> Devolver os glândula submandibular à sua posição inicial e fechar as incisões na pele com 5-0 seda sutura cirúrgica. Aplicar um anti-séptico ao redor da incisão para evitar a infecção da ferida à base de clorexidina. NOTA: suturas absorvíveis e não-absorvíveis podem ser utilizados. suturas não absorvíveis deve ser removido em 2 semanas. Seda não é recomendado para o fechamento da pele desde a sua utilização está associada com a infecção da incisão e reações teciduais locais. </li></ol></li><li> injeção transtimpânica bilateral <ol><li> Posicione o mouse na posição de decúbito lateral e preparar uma área cirúrgica asséptica abaixo do conduto auditivo externo, conforme descrito em 4.3.1.1. </li><li> Faça incisão de 0,5 centímetro longitudinal na parte vertical do canal auditivo externo próximo ao tragus e sexão da dobra cutânea interna do pavilhão auricular (opcional). </li><li> Localize a membrana timpânica, no final do canal auditivo externo usando um microscópio cirúrgico (Figura 2E) e identificar os pars superiores flácida e da pars inferiores Tensa, que é dividido em seções anterior e posterior do cabo do martelo (Figura 2F) . </li><li> Faça um pequeno myringostomy na porção caudal dos pars flácida. Realizar uma incisão adicional na pars tensa da membrana timpânica, para permitir a evacuação do ar durante a injecção 33. Suavemente injectar 10-15 ul de veículo (CGP-hidrogel ou RL) solução com uma seringa de vidro de micro L ligado a um cateter 34 através da pars flácida, perto do nicho RW até ao ouvido médio é claramente completo. </li><li> Fechar as incisões na pele com uma sutura cirúrgica de seda 5-0 e limpo como descrito no 4.3.1.7. </li><li> Posicione o mouse sobre o seu outro lado e opercomeu a orelha contralateral (passos 4.3.2.1-to 4.3.2.5). </li></ol></li></ol></li><li> Mantenha o mouse sobre uma almofada de aquecimento até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. </li><li> Monitorar a condição corporal, atividade e da presença de sinais de dor ou estresse. Fornecer analgésicos, se necessário (isto é, buprenorfina 0,05 mg / kg, carprofeno 5-10 mg / kg). Rever a ferida cirúrgica diária e remover tampas de pele 7-14 dias de pós-operatório após verificar que a ferida esteja curada. </li></ol> 5. morfológica Avaliação da Coclear citoarquitetura <ol><li> Eutanásia do rato no final da experiência (neste trabalho 28 dias postmicrosurgery), com uma sobredosagem de pentobarbital por via intraperitoneal (100 mg / kg) para estudar os efeitos a longo prazo da intervenção cirúrgica. </li><li> Executar uma perfusão transcardial com o frio de 0,1 M fosfato tamponadaSalino (PBS), pH 7,5, seguido de 4% (p / v) de paraformaldeído (PFA) em PBS a 0,1 M, pH 7,5, tal como descrito 26. CUIDADO: O paraformaldeído é altamente tóxico; evitar o contato com a pele, olhos ou membranas mucosas. Evite respirar o pó durante a medição e preparação. </li><li> Use uma lupa para dissecar o ouvido interno do osso temporal, conforme descrito 34, 35 sem separar o vestibular e componentes cocleares do ouvido interno. </li><li> Corrigir o ouvido interno isolado com 4% (p / v) de PFA em PBS a 0,1 M, pH 7,5 a 4 ° C durante 12 h com agitação suave. Lavar 3x durante 5 min com PBS 0,1 M, pH 7,5. </li><li> Descalcificar as amostras com ácido etilenodiaminotetra-acético 10% (EDTA) preparado em PBS a 0,1 M, pH 6,5 a 4 ° C, durante 10 d, com agitação constante, mudando a solução de EDTA a cada 3 d. </li><li> Quando cócleas adquirir uma consistência macia, remover EDTA e lavar 3x durante 5 min com PBS 0,1 M, pH 7,5, With agitação à TA. </li><li> Incorporar as amostras em cera de parafina, como descrito 34 e fazer 7 mm seções cocleares espessura paralela ao modíolo. </li><li> Avaliar citoarquitetura coclear, seções mancha com hematoxilina e eosina (H &amp; E) de 30 e usar um microscópio de luz conectado a uma câmera digital para capturar imagens com 4X e 20X lentes. </li></ol> 6. Coclear Gene Expression <ol><li> Limpe a superfície de trabalho e instrumentos cirúrgicos com solução de descontaminação RNAse. </li><li> Euthanize o rato como descrito em 5.1 e rapidamente dissecar o ouvido interno do osso temporal usando um microscópio. Mergulhe o ouvido interno em um prato de vidro contendo ácido ribonucleico protector (RNA) e reagente estabilizador. </li><li> Remova o osso petroso restante com pinças de joalheiro e suavemente separar a cóclea do vestíbulo com uma tesoura olho de Vanna 35. </li><li> imediatamente transfer a cóclea para um tubo de microcentrífuga de 2 mL com 80 solução protector e estabilizador uL de ARN e congelar o tecido colocando o tubo em gelo seco. Preservar amostras cocleares a -70 ° C até à sua utilização. </li><li> Isolar RNA coclear como descrito 35 e determinar a sua qualidade e quantidade espectrofotometricamente. </li><li> Gerar cDNA coclear a partir de quantidades iguais de RNA total rato usando um kit comercial de transcrição reversa. </li><li> Execute qRT-PCR para amplificar ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) em triplicado para medir transcritos do gene 35, 36. NOTA: Neste pro- trabalho e transcritos do gene anti-inflamatórias de IL1B, IL6, TGFb1, TNFA, IL10 e Dusp1 foram medidos. </li><li> Calcular os rácios de expressão relativa, normalizando os níveis de limiar de ciclo transcrito alvo (Ct) para o média aritmética do nível do gene de referência e a quantificação relativa por normalização dagrupo problema níveis de transcrição para a média aritmética do grupo calibrador 37. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Distribuição local de fármacos para o ouvido interno pode ser feito directamente por injecção intracoclear ou indirectamente por administração intratimpânicas, colocando a droga no ouvido médio 4, 19, 39. administração intracocleares fornece controlada e entrega da droga precisa para a cóclea, evitando a difusão através das membranas das janelas, basal-para-apical gradientes de concentração e de apuramento através da trompa de Eustáquio. No entanto, é geralmente um procedimento altamente invasivo que requer uma complexa e delicada microcirurgia 7, 39. Neste contexto, a indústria está a desenvolver novos, revestidos, dispositivos implantáveis para liberação sustentada de drogas 40, 41. Por outro lado, a administração intratimpânicas é um procedimento minimamente invasivo e fácil de realizar, que permite a injecção de grandes volumes do dtapete para o ouvido médio, embora a farmacocinética não é fácil de controlar. A maioria da droga é limpa através do tubo de Eustáquio e a fracção restante tem de se difundir através da membrana para chegar ao RW 18 cóclea. RW é o local de absorção máxima de substâncias do ouvido médio para o ducto timpânica cheio de perilinfa da cóclea 7. É uma estrutura de três camadas semi-permeável, embora a sua permeabilidade depende das características da droga (tamanho, de concentração, de solubilidade e de carga eléctrica) e em sistemas de transporte transmembranar (difusão, transporte activo ou fagocitose) 42. A janela oval e cápsulas óticas são entradas alternativas, mas menos eficazes à cóclea 43, 44. Aqui demonstramos e comparar dois métodos de microcirurgia para entrega alvo de drogas para dentro do ouvido do meio do mouse: bullostomy e transtympaprocedimentos de injecção NIC. etapas críticas comuns a esses procedimentos incluem: i) uma avaliação da audição antes e depois da microcirurgia, ii) preparação de uma solução de veículo homogênea em condições estéreis, iii) a supervisão cuidadosa do procedimento anestésico e monitoramento de animais da temperatura corporal e constantes, iv ) colocação lenta do volume apropriado de veículo alvo a RW, e iv) a recolha de amostras cocleares para completar a análise molecular e morfológica. Abordagens retroauriculares e ventral para bullostomy foram descritos 7, 45. Utilizamos a aproximação ventral, porque em nossa experiência que resultou em menor morbidade e forneceu um melhor acesso ao RW 46. Injecções transtimpânico geralmente são realizados através da pars tensa da membrana timpânica, anterior ou posterior à manubrium malleus 12. DentroNeste trabalho foi feita uma modificação da técnica, uma injecção através da pars flácida além do martelo com um punção adicional anterior da pars tensa para permitir a evacuação do ar durante a injecção. A injeção transtimpânica foi menos invasiva do que a bullostomy, embora ambas as microcirurgias foram rápida (20 e 5 min por orelha para bullostomy e abordagem transtimpânico respectivamente), com tempos de recuperação pós-operatórias curtas e ausência de morbidade. Mais importante ainda, ambos os procedimentos mantidos audição e os parâmetros ABR foram idênticos com os valores determinados antes da microcirurgia. A abordagem transtimpânico leva menos tempo do que o bullostomy e pode ser realizada em ambas as orelhas do mesmo animal durante a mesma intervenção. Vantagens da injecção transtimpânico são, portanto, que pode ser realizada bilateralmente e repetidos, se necessário. Por outro lado, bullostomy fornece acesso visual directo à membrana RW e permite que o filling do nicho RW. Em contraste, a injeção transtimpânica não permite controle da colocação do veículo no nicho RW. Os procedimentos relatados nesse trabalho descrevem como realizar um veículo de entrega local de drogas para o ouvido médio para aplicações pré-clínicos, tais como a avaliação da ototoxicidade e avaliação da eficácia na perda de audição. Duas técnicas microcirúrgicas são descritas que proporcionam métodos alternativos com vantagens e desvantagens específicas. Ambos preservação da audição e não causam alterações morfológicas. inflamação local é descrita como uma complicação potencial de bullostomy. Um conjunto de técnicas complementares são também descritos para procedimentos pós-cirúrgicos, incluindo audição, avaliação de expressão do marcador morfológicas e inflamatórias. As aplicações futuras para estas técnicas incluem a avaliação pré-clínica de novas terapias para a perda, incluindo abordagens genéticas, celulares e farmacológicas auditiva, em modelos animais. intratimpânica administratiões assegurar a entrega do tratamento no ouvido médio, em contacto com a membrana da janela redonda, facilitar a passagem para o perilinfa sem danos evidentes coclear.

A deficiência auditiva é o déficit sensorial humana mais frequente e afeta 5,3% da população mundial e 30% dos indivíduos com idade superior a 65 ( <a href="http://www.who.int/topics/deafness/en">http://www.who.int/topics/deafness/en</a> , actualizado 2016). A perda auditiva afeta a aquisição da linguagem em crianças e acelera o declínio cognitivo em idosos. Portanto, é um problema significativo de saúde com um impacto sócio-econômico tremendo. Ela pode ser causada por defeitos genéticos, factores ambientais ou uma combinação de ambos 1, em que a extremidade induzir danos e morte de células ciliadas e neurônios na cóclea. Estas células não se regeneram em mamíferos, por conseguinte, a perda celular e perda auditiva concomitante não pode ser revertida. Opções clínicas são baseados em dispositivos protéticos, incluindo aparelhos auditivos e coclear, ouvido médio e implantes de condução óssea 2. Infelizmente, não há trea restaurador médico específicotimentos para deficiência auditiva e, assim, várias linhas de pesquisa estão focados no desenvolvimento de terapias preventivas e reparadoras. Opções terapêuticas inovadoras incluem terapia génica e celular, bem como o desenvolvimento de pequenas moléculas para a terapia farmacológica 2. Um dos desafios mais importantes na terapia farmacológica coclear é entrega da droga. Os tratamentos sistémicos têm eficácia limitada na cóclea devido à barreira sangue-labirinto 3, endotélio contínuo em contato com os vasos sanguíneos da cóclea, que atua como uma barreira física e bioquímica para manter a homeostase fluido do ouvido interno, portanto, limitando a passagem de drogas para o ouvido interno. É permeável apenas para pequenas moléculas lipossolúveis, embora a permeabilidade pode ser aumentada durante a inflamação coclear, e também com a utilização de diuréticos ou agentes osmóticos. O volume de droga que atinge a cóclea, eventualmente após a administração sistémica é reduzida;Portanto, as doses elevadas que podem causar toxicidade orgânica são necessários. Além disso, o metabolismo hepático da droga pode produzir metabólitos tóxicos ou inativos 4, 5, 6, 7. Em contraste, as intervenções locais permitir a colocação de uma quantidade limitada conhecida do fármaco para dentro do ouvido médio ou interno, sem efeitos secundários indesejáveis, 4, 7, 8, 9. Na prática clínica atual, as administrações intratimpânicas estão limitados a determinadas patologias cocleares, como a gentamicina na doença de Ménière 10, corticosteróides em surdez súbita, doença de Ménière, imunomediada e ruído perda auditiva induzida, 11, 12, 13, 14, 15 e insulin-like growth factor 1 (IGF1) em surdez súbita 4, 16, 17. As formulações para administração local deve preservar a homeostase delicada (pH e osmolaridade) de fluidos cocleares. Além disso, é muito importante para manter a esterilidade durante todo o processo para evitar a contaminação bacteriana do líquido cefalorraquidiano. O excipiente usado para a entrega da droga deve ser biocompatível, e de nonototoxic a consistência adequada. As soluções líquidas são recomendados para injecções intracocleares, mas não são adequados para a via intratimpânicas devido à depuração através do tubo de Eustáquio. Neste caso, os medicamentos são geralmente realizadas por géis semi-sólidos para aumentar a sua permanência no ouvido médio 4, 18, 19. syste de entrega alternativoMS utilizadas como transportadores para aumentar a passagem da droga para o ouvido interno são nanopartículas 20 e 21 de adenovírus aqui foram comparados dois veículos: CGP e uma solução RL. CGP é um hidrogel formado por quitosana, um polissacarídeo linear constituído por D-glucosamina e N-acetil-D-glucosamina obtido a partir de cascas de crustáceos, e β-glicerofosfato, um poliol que forma um escudo de água em torno das cadeias de quitosano e mantém-na forma líquida. CGP é termossensível e pode ser degradado por lisozimas, permitindo uma libertação sustida da droga no ouvido médio 22, 23, 24, 25. Hidrogéis de quitosano a base são veículos adequados para aplicações clínicas, tais como a entrega do fármaco, devido à sua falta de imunogenicidade e a falta de activação de reacções inflamatórias locais 23, 24. No OTHer lado, tampão RL é uma solução isotónica não-pirogénica (273 mOsm / L e um pH de 6,5) destina-se a administração intravenosa em seres humanos como uma fonte de água e electrólitos, especialmente em perda de sangue, traumatismo ou queimaduras porque os subprodutos do metabolismo do lactato no fígado neutralizar a acidose. Aqui nós descrever e comparar dois métodos cirúrgicos que foram refinados para entrega local de drogas para o ouvido interno mouse. O perfil de segurança de ambas as técnicas foi avaliada por meio de testes funcionais, morfológicos e moleculares. A audição foi avaliada por meio de tronco encefálico (ABR) 26, 27 realizadas antes e após microcirurgia em momentos diferentes. procedimentos ponto final foram usadas para dissecar a cóclea e comparar o impacto anatômico, celular e molecular destes dois procedimentos de microcirurgia.

<table><tbody><tr><td>Cetamina (Imalgene)</td><td>Merial</td><td># 2529</td><td>CUIDADO: evite o contato da droga com a pele ou os olhos ou injeções autoinfligidas acidentais</td></tr><tr><td>Xylacine (Xilagesic)&nbsp;</td><td>Calier</td><td># 6200025225</td><td></td></tr><tr><td>Gel lubrificante para os olhos (Artific)</td><td>Angelini</td><td># 784710</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de água&nbsp;</td><td>Gaymar</td><td># TP472</td><td></td></tr><tr><td>Desinfetante de superfície</td><td>Jos&eacute; Collado SA</td><td># CR-36</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos de agulha subdérmicos&nbsp;</td><td>Spes Medica</td><td># MN4013D10SM</td><td></td></tr><tr><td>Headstage de Baixa Impedância&nbsp; (RA4LI)</td><td>Alto-falantes Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Alto-falante Magnético Multi-Campo MF1)</td>Estação de Trabalho de Potencial Evocado System 3 da <td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td>O Sistema é composto por: processador RP2, estação base RA16, atenuador PA5, amplificador SA1, amplificador de microfone MA3, headstage de impedância RA4LI e pré-amplificador medusa RA4A&nbsp;</td></tr><tr><td>Software SigGenRP</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de aquecimento (almofadas TP)</td><td>Gaymar</td><td># TP3E</td><td></td></tr><tr><td>Software estatístico (SPSS)</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chitosan (desacetilado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># C3646</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético (glacial)</td><td>VWR</td><td># 20103.295</td><td>CUIDADO: líquido inflamável, corrosão da pele, respiratório e da pele sensibilizador</td></tr><tr><td>Glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td># SLBG3671V</td><td></td></tr><tr><td>Ringer&agudo; s tampão lactato</td><td>Braun</td><td># 1520-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidina (Domtor)</td><td>Esteve</td><td># 02400190</td><td></td></tr><tr><td>Fentanile (Fentanest)</td><td>Kern Pharma</td><td># 756650.2</td><td>CUIDADO: &nbsp; &nbsp; evite o contato do medicamento com feridas abertas ou injeções autoinfligidas acidentais</td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoVet)</td><td>Braun</td><td># 469860</td><td>CUIDADO: Evite exposições em concentrações máximas superiores a 2 ppm de qualquer agente anestésico halogenado durante um período de amostragem não superior a 1 h.</td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico (OPMI pico)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campo estéril (Foliodrape)</td><td>Hartmann</td><td># 277546</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td> <td># 18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi</td><td>Swann Morton</td> <td># 0205</td><td>CUIDADO</td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td> <td># 91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-séptico à base de iodo de povidona (Betadine)</td> <td>Meda Pharma SAU</td> <td># M-12207</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de adventícia (SAS18-R8)</td> <td>S & T</td><td># 12075-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura curva</td><td>CM Instrumente</td><td># AJ023-18</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>CM Instrumente</td><td># BB019-18</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de gelatina (Spongostan)</td><td>ProNaMAc</td><td># MS0001</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 27 G</td><td>Becton Dickinson</td><td># 302200</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de microlitro (701 RN SYR)</td><td>Hamilton</td># <td>80330</td><td></td></tr><tr><td>Cateter (Microfil 34 G)</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td># MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de Tecido (Vetbond)</td><td>3M</td><td># 1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas (Porta-agulhas com cabo redondo)&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td># 12075-12</td><td></td></tr><tr><td>Sutura cirúrgica de seda (Seda trançada 5/0)</td><td>Arago</td><td># 990011</td><td></td></tr><tr><td>clorexidina (Cristalmina)</td><td>Salvat</td><td># 787341</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital&nbsp; (Doletal)</td><td>Ventoquinol</td><td># VET00040</td><td>CUIDADO: &nbsp; &nbsp; evitar o contato da droga com feridas abertas ou injeções autoinfligidas acidentais</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio (Leica)</td> <td>Meyer Instruments</td> <td># MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Micro-dissecação (Olho) Tesoura</td> Spring <td>Action Harvard Apparatus</td> <td># 28483</td><td></td></tr><tr><td>Joalheiro ' s forceps (Dumont)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td># 11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Descontaminação RNase&nbsp; (RNaseZap)</td><td>Solução de Estabilização de RNA Sigma-Aldrich</td><td># R2020</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; (RNAlater)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># R0901</td><td></td></tr><tr><td>Kit de RNA de purificação (RNeasy)</td><td>Qiagen</td><td># 74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># 4368814</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de expressão gênica (sondas TaqMan)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real (7900HT)</td><td>Applied Biosystems</td><td># 4329001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Merck</td><td># 1040051000</td><td>TÓXICO: PFA é um potencial&nbsp; carcinógeno</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Merck</td><td># 405491</td><td>CUIDADO:&nbsp; prejudicial se inalado, pode causar danos ao trato respiratório através de exposição prolongada ou repetida se inalado.</td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># E4382</td><td>Perigos: causa irritação ocular grave</td></tr></tbody></table>

um estudo comparativo de drogas métodos de entrega direcionados à orelha de rato inner: bullostomy versus injeção transtimpânica

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Nós apresentamos duas técnicas de microcirurgia minimamente invasivas em roedores para entrega específica de drogas para o ouvido médio para que ele possa chegar ao ouvido interno. O primeiro procedimento consiste na perfuração da bula timpânica, denominado bullostomy; a segunda é uma injecção transtimpânico. Ambos imitar procedimentos intratimpânicas clínicos em humanos. O quitosano-glicerofosfato (CGP) e tampão de lactato de Ringer (RL) foram usadas como veículos biocompatíveis para distribuição local de fármacos. CGP é um polímero biodegradável não tóxico amplamente utilizados em aplicações farmacêuticas. É um líquido viscoso à temperatura ambiente mas congela a uma fase semi-sólido à temperatura do corpo. RL é uma solução isotónica usado para administrações por via intravenosa em seres humanos. Um pequeno volume do veículo é colocado precisamente no nicho da janela redonda (RW) por meio de um bullostomy. A injeção transtimpânica enche o ouvido médio e permite menos controle, mas o acesso mais amplo para o ouvido interno. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Os perfis de segurança de ambas as técnicas foram estudados e comparados por meio de testes funcionais e morfológicas. Ouvindo foi avaliada por registrar o Auditivo de Tronco Encefálico (ABR) antes e várias vezes após microcirurgia. O nível citoarquitetura e preservação das estruturas da cóclea foram estudados por técnicas histológicas convencionais em fixo-paraformaldeído e descalcificados amostras cocleares. Em paralelo, amostras não fixadas, foram tomadas cocleares e imediatamente congeladas para analisar os perfis de marcadores inflamatórios de expressão do gene por reacção de transcriptase inversa quantitativa em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR). Ambos os procedimentos são adequados como métodos de entrega de drogas para o ouvido médio do mouse, embora a injeção transtimpânica provou ser menos invasiva em comparação com bullostomy.

Auditiva foi testado pela ABR antes e durante várias vezes após microcirurgia para avaliar o impacto sobre a função auditiva (Figura 1A). Registros do ABR foram realizadas sob anestesia para evitar animais movimento e tensão artefactos e, portanto, melhorar a sua reprodutibilidade 27. Administrado por via intraperitoneal a associação de cetamina base ou isoflurano por via inalatória foram usualmente empregado para anestesiar animais durante os testes ABR. A combinação de cetamina / xilazina fornece uma indução de curta duração (2-3 min) e uma fase de manutenção segura estável durante a execução de registros da ABR. Deve notar-se que o isoflurano pode afectar a sensibilidade de medição 38 ABR. Para registros da ABR, eléctrodos subcutâneos são colocados em locais específicos (Figura 1B) e a impedância elétrica é medido. Se a impedância é de 3 kOhm ou superior, posicionamento dos eletrodos tem de ser verificado para evitar altrações em ABR amplitude da onda. Intratimpânica entrega é realizada em ratos por dois procedimentos microcirúrgicos (Figura 2). Exposição da bula durante bullostomy envolve retração das glândulas submandibular e músculo digástrico. Este procedimento é realizado com extremo cuidado porque a artéria carótida e do nervo vagai são muito próximo (Figura 2A). Em seguida, a bolha é perfurado para localizar a artéria estapediana e a membrana RW (Figura 2B). Para evitar a fissuração do osso, uma pequena abertura de 0,5 milímetros é feita com uma agulha 27 G antes da perfuração. O G cateter 34 é dirigido através da membrana em direcção ao bullostomy RW e um pequeno volume de veículo é entregue no nicho da janela (Figura 2C). A injecção transtimpânico é realizada através de uma incisão na parte flácida da membrana timpânica com uma agulha 27 G; um maior pode provocar aorelha na membrana. Antes da injecção, é recomendável fazer uma incisão adicional na pars tensa para permitir a saída do ar durante a injecção do veículo (Figura 2F). É fundamental para evitar danos da artéria estapediano, um ramo da artéria carótida interna, o que levaria a hemorragia com risco de vida. Ratos com bullostomy ou transtimpânicas cirurgias audiência ao longo da experiência, idêntica à dos controlos não operados (figura 3) em conserva. limiares ABR em resposta a cliques e estouros de tom não mudou significativamente após microcirurgia em comparação aos valores basais. Não foram observadas diferenças significativas entre bullostomy e abordagens transtimpânicas. Estudos morfológicos foram realizados para confirmar a entrega do veículo correto para o ouvido médio e para avaliar as possíveis alterações causadas pelos procedimentos do citoarquitetura coclear. Nenhum dos principais cocleares regiões salterações morfológicas howed e animais de ambos os procedimentos apresentada uma morfologia similar de todas as estruturas da cóclea (Figura 4A). Além disso, os perfis da cóclea para a expressão de genes de citoquinas pró-inflamatórias e anti também foram estudados. Apesar da falta de diferenças funcionais em dados de ABR entre os dois processos, bullostomy causou uma resposta inflamatória mais forte do que a abordagem transtimpânico (Figura 4B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig1.jpg"> Figura 1. Desenho Experimental e Avaliação Auditiva. (A) Diagrama do procedimento experimental. Auditiva foi avaliado com ABR antes e após microcirurgia. amostras cocleares foram obtidas 28 dias após a microcirurgia. (B) rato anestesiado em decúbito ventral sobre a almofada de aquecimento dentro de uma câmara de atenuação do som, com electrod subdérmicoES colocados no couro cabeludo entre as orelhas sobre o vértice do crânio (activo, positivo); na região da parótida abaixo do pavilhão auricular (referência negativa) e na parte de trás (terra). O alto-falante livre de campo é colocado a uma distância fixa (5 cm) de frente para a orelha direita. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig2.jpg"> Figura 2. Microcirurgia para aplicação em veículos. (A) Vista ventral da bula timpânica. O bullostomy é realizada caudal ao nervo facial com uma agulha 27 G. (B) e RWN artéria estapediana pode ser observado através da perfuração. (C) O G cateter 34 é dirigido através do bullostomy para o nicho RW. (D) Um mês após a bullostomy, uma pequena ósseacicatriz está presente no local de abertura (seta). (E) Vista lateral da orelha, mostrando a incisão no conduto auditivo externo e da membrana timpânica (praça). (F) Detalhe da membrana timpânica. A punção foi feita no quadrante superior caudal da membrana timpânica usando um 27 agulha G (asterisco preto, nos pars flácida); a injecção foi feita por meio desta perfuração utilizando um cateter de 34 g. Um buraco adicional foi feita no quadrante inferior craniana da membrana (asterisco branco, na pars tensa) antes da injecção, para equilibrar a pressão timpânica. (G) Vista do G cateter 34 através da perfuração da membrana timpânica. (H) Vista do coclear região 24 h após a microcirurgia. RWN preenchido com uma solução de veículo (asterisco). Lat, lateral; Ro, rostral; Fazer, dorsal; Ma, martelo; Co, cóclea; OW, a janela oval; RWN, nicho da janela redonda. Barras de escala = 200 um em A, D, F; Barras de escala = 100 um em B, C, H; Barras de escala = 1.000 mm em E, G. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig3.jpg"> Figura 3. A avaliação auditiva. Evolução dos limiares ABR (média ± SEM, em dB SPL) em resposta ao clique (A) e tone burst (B) estímulos, antes e 7, 14 e 28 dias após a micro-cirurgia em machos de oito semanas de idade C57BL / 6J ratos. Bullostomy (laranja; n = 11); injeção transtimpânica (azul; n = 6); não operado (cinza; n = 11), <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig3large.jpg" target="_blank">por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> jpg "/&gt; Figura 4. Coclear Morfologia e Análise de Expressão Gênica. (A) Morfologia das principais estruturas da cóclea na base da cóclea. Hematoxilina-eosina de seções meados de modiolar parafina (7 ^ m), de orelhas de camundongos não operados e ratos, um mês após a intervenção microcirurgia por bullostomy ou injeção transtimpânica. O compartimento de escala média (a, b, c) apresenta todos os componentes principais. Os detalhes de cada uma destas estruturas (caixas numeradas) são mostrados nas imagens subsequentes: gânglio da espiral (1), órgão de Corti (2), o ligamento espiral (3) e da estria vascular (4). células ciliadas internas (asterisco); células ciliadas externas (cabeça de seta). Barras de escala = 100 pm, em a, b, c; Barras de escala = 50 um em um-1,2,3,4. (B) a expressão Coclear de marcadores inflamatórios 28 d após a microcirurgia. Comparação entre bullostomy (laranja) e injeção transtimpânica (azul) e aos ratos não operados (branco). *: Vs. não operadogrupos operados; ^: Comparação entre os grupos operados. Níveis de expressão génica são representados como 2 - ΔΔCt, ou a diferença de n vezes em relação ao group.Values não operados são apresentados como média ± SEM de triplicados de amostras do pool de três ratos por condição. A significância estatística: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Duas abordagens de microcirurgia para administração local de medicamentos no ouvido interno são descritas aqui e comparadas em termos de impacto nos parâmetros auditivos, citoarquitetura coclear e expressão de marcadores inflamatórios.

Um Estudo Comparativo de drogas métodos de entrega direcionados à orelha de rato Inner: Bullostomy Versus Injeção transtimpânica

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

O objetivo geral deste trabalho é descrever e comparar duas abordagens de microcirurgia para administração local de medicamentos na orelha interna em termos de impacto nos parâmetros auditivos e marcadores de citoarquitetura coclear. Esses procedimentos podem nos ajudar a responder a perguntas-chave no campo auditivo, especialmente no desenvolvimento de estudos pró-químicos em animais. A principal vantagem dessas técnicas é que elas são minimamente invasivas.E isso permite que a substância chegue didaticamente ao ouvido interno. A aplicação dessas técnicas se estende à terapia da perda auditiva, pois seus procedimentos microcirúrgicos são adequados para parto seco na orelha média. A demonstração pacífica desse método é fundamental, pois a bulostomia e a injeção transtimpânica são difíceis de aprender e requerem conhecimento anatômico e treinamento cirúrgico.Para começar, coloque um tampão na orelha contralateral de um camundongo anestesiado para obter respostas predominantemente mono-aurais. Em seguida, coloque o mouse em decúbito ventral em uma almofada de aquecimento dentro de uma câmara de atenuação de som. Coloque o eletrodo de agulha subdérmica de aço inoxidável positivo no couro cabeludo entre as orelhas sobre o vértice do crânio.Coloque o eletrodo de referência na região parótida abaixo do pavilhão auricular. Em seguida, coloque o eletrodo de aterramento na região das costas, cauda ou membros posteriores. Verifique a impedância elétrica nos eletrodos positivo e negativo.Certifique-se de que a impedância seja inferior a três kiloohms. Coloque o alto-falante pré-preenchido a uma distância fixa voltado para a orelha selecionada, com o centro do alto-falante alinhado com o canal auditivo externo. Certifique-se de que não haja obstáculos entre o alto-falante e o ouvido e que o pavilhão auricular esteja completamente aberto.Conecte a saída da estação de trabalho digital para analógica ao alto-falante selecionado. Alto-falantes de campo livre são usados aqui. Conecte um amplificador com baixo ruído e uma boa relação sinal-ruído à entrada analógico-digital.Em seguida, inicie o processo de entrega de estímulos acústicos no canal auditivo externo usando estímulos predefinidos ou novos sinais projetados com o software apropriado. Apresente os estímulos começando com alta intensidade e reduzindo a intensidade em etapas de nível de pressão sonora de cinco a 10 decibéis. Registre a resposta elétrica nos primeiros 10 milissegundos após a estimulação, pois as respostas evocadas do PEATE aparecem em seis a oito milissegundos.Use o software para determinar o limite ABR conforme descrito na parte escrita do protocolo. Depois de administrar a anestesia de acordo com os protocolos aprovados, verifique se um plano cirúrgico de anestesia foi alcançado pela ausência de reação a uma pinça no dedo do pé e pela apresentação de respiração regular. Use uma tesoura para remover o pelo na superfície ventral do pescoço e proteja os olhos da ceratite da córnea com um gel à base de hidroxi-propilmetilcelulose.Coloque o camundongo na área cirúrgica estéril em decúbito dorsal. Limpe a pele com uma solução anti-séptica à base de iodopovidona e cubra com uma cortina estéril. Depois de usar um bisturi para fazer uma incisão longitudinal de dois centímetros da mandíbula até a clavícula, olhe através do microscópio cirúrgico e identifique as glândulas submandibulares.Separe as duas glândulas submandibulares com uma pinça, retraia-as e localize a origem do músculo digástrico no nervo facial. Em seguida, faça uma incisão na origem do músculo digástrico com uma tesoura e retraia-o ventralmente, expondo o aspecto medial inferior subjacente da bolha timpânica. Em seguida, use uma agulha de calibre 27 para perfurar a bula e criar uma abertura.Limpe o sangue da área perfurada com uma esponja de gelatina absorvível. Localize a artéria estapedial na membrana da janela redonda aninhada a ela. Usando um cateter de calibre 34 e uma microsseringa de vidro, injete lentamente de três a cinco microlitros de solução veicular através da bulostomia e diretamente no nicho da janela redonda para preenchê-la.Sele a bulostomia com uma a duas gotas de adesivo tecidual. Retorne as glândulas submandibulares à sua posição inicial e feche as incisões na pele com sutura cirúrgica de seda 5-0. Aplique anti-séptico à base de iodopovidona ou clorexidina ao redor da incisão para evitar infecção da ferida.Mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Devolva o animal à gaiola de casa somente depois que ele estiver totalmente recuperado. Coloque o camundongo em decúbito lateral e prepare-o em uma área cirúrgica séptica abaixo do conduto auditivo externo, conforme mostrado anteriormente.Após fazer uma incisão longitudinal de 0,5 centímetro na parte vertical do meato acústico externo, localize a membrana timpânica com o auxílio do microscópio cirúrgico. Identifique a pars flácida superior na pars tensa inferior, que é dividida em seções anterior e posterior pela alça do martelo. Em seguida, faça uma pequena miringostomia na porção caudal da pars flaccida e uma incisão adicional na pars tensa da membrana timpânica para permitir a evacuação do ar durante a injeção.Use uma microsseringa de vidro conectada a um cateter de calibre 34 para injetar suavemente 10 a 15 microlitros de veículo através da pars flácida, perto do nicho da janela redonda, até que o ouvido médio esteja claramente cheio. Feche as incisões na pele com uma sutura cirúrgica de seda 5-0 e limpe conforme descrito anteriormente. Este gráfico mostra os limiares ABR em camundongos C57BL/6J machos de 8 semanas de idade em resposta a estímulos clique antes da cirurgia e sete, 14 e 28 dias após a microcirurgia.Os dados de bulostomia são mostrados em laranja, os dados de injeção transtimpânica são mostrados em azul e os dados de animais não operados são mostrados em cinza. Este gráfico mostra os limiares do PEATE em resposta a estímulos tone-burst na faixa de oito a 40 kilohertz no mesmo período de tempo após a microcirurgia. Novamente, não foram observadas diferenças significativas entre as abordagens de bulostomia e transtimpânica.Estudos morfológicos demonstram que a escala média não apresenta alterações após a entrega do veículo por bulostomia ou injeção transtimpânica, indicando que nenhum dos procedimentos isoladamente resulta em dano. Ao tentar o procedimento de bulostomia, é importante lembrar de revisar a estrutura crítica e anatômica ao redor da orelha média e interna dos roedores. Após esses procedimentos, outras técnicas poderiam ser realizadas.Por exemplo, amostragem de Berlim para estudos farmacocinéticos Após seu desenvolvimento, essas técnicas abrem caminho para pesquisadores no campo da neurociência auditiva explorarem potenciais terapias locais em modelos animais, principalmente em roedores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como administrar medicamentos no ouvido médio e como avaliar a audição em roedores.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a injeção intracerebroventricular mediada por ommaya em um modelo de camundongo. O método permite a entrega localizada de potenciais candidatos a medicamentos e evita a barreira hematoencefálica.

Injeção intracerebroventricular em camundongo: um método de administração direta de medicamentos mediado por Ommaya para administrar medicamentos aos ventrículos cerebrais do cérebro de camundongos

Este vídeo mostra a canalostomia, um procedimento que permite a administração local de drogas no ouvido interno de um camundongo através do canal semicircular com danos mínimos à audição e à função vestibular. Este método permite a inoculação de vetores virais, produtos farmacêuticos e pequenas moléculas no ouvido interno do camundongo.

Canalostomia para administração local de medicamentos no ouvido interno de um camundongo adulto

Um modelo do rato de reconstrução endoscópica da base do crânio humano foi desenvolvido que cria uma interface semipermeável entre o cérebro eo nariz com enxertos mucosas nasais. Este método permite que os investigadores a estudar a libertação no sistema nervoso central de terapêutica de elevado peso molecular, que são de outro modo excluídos pela barreira sangue-cérebro, quando administrado sistemicamente.

Heterotópico mucosa enxertando Procedimento para entrega da droga direto para o cérebro em ratos

A abordagem cirúrgica pós-auricular descrita permite a entrega rápida e direta na escala timpânica coclear do camundongo, minimizando a perda de sangue e a mortalidade animal. Este método pode ser usado para terapia coclear usando entrega molecular, farmacológica e viral a camundongos pós-natais através da membrana da janela redonda.

Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

Existem vários métodos para a introdução de agentes ototóxicos na cóclea de modelos animais. Apresenta-se um protocolo cirúrgico para entrega de agentes ototóxicos no nicho da janela redonda. O procedimento é confiável, cria lesões intracocleares direcionadas e evita danos mecânicos à microarquitetura. O exame do autorreparo/regeneração coclear é possível.

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Apresentamos uma técnica para administração localizada de drogas através da rota trans-timpânicas na cóclea. Entrega da droga através desta rota não iria interferir com a eficácia de anticâncer dos medicamentos quimioterápicos tais como a cisplatina.

Entrega de trans-timpânicas drogas para o tratamento da ototoxicidade

Nós relatamos um método cirúrgico para administrar medicamentos para o ouvido interno de um primata não-humano, o sagui comum (Callithrix jacchus), através da membrana da janela redonda.

Um procedimento cirúrgico para a administração de drogas para o ouvido interno em um Non-Human primatas Sagui (Callithrix jacchus)

Neste estudo, descrevemos a abordagem de canal semicircular posterior como um método confiável para a entrega de gene do ouvido interno em camundongos neonatais. Mostramos que a entrega do gene através do canal semicircular posterior é capaz de perfundir toda orelha interna.

Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal

Aqui descrevemos o procedimento canalostomy, que permite a entrega de drogas local para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatais através do canal semicircular com danos mínimos para a função auditiva e vestibular. Esse método pode ser usado para inocular vetores virais, fármacos e moléculas pequenas para o ouvido interno do rato.

Canalostomy como uma abordagem cirúrgica para entrega de drogas para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatal

Teste de sensibilidade visual em lagartos usando um paradigma de condicionamento operante, que emprega a reprodução de vídeo de random-dot kinematograms e computer-generated invertebrados.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Aprenda duas técnicas microcirúrgicas de entrega de fármacos para o ouvido interno em camundongos: bullostomy e injeção transtimpânica. Este método compara os efeitos na audição e na citoarquitetura coclear.

Um Estudo Comparativo de drogas métodos de entrega direcionados à orelha de rato Inner: Bullostomy Versus Injeção transtimpânica (Vídeo) | JoVE Journal

Um Estudo Comparativo de drogas métodos de entrega direcionados à orelha de rato Inner: Bullostomy Versus Injeção transtimpânica

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