Name: Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um In Vitro Sistema (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a detectar aberrações cromossômicas induzidas por matéria particulada do ar ambiente usando macrófagos RAW264.7 in vitro. Este método permite visualizar diretamente danos no material genético.

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O trabalho foi apoiado, em parte, pelo Instituto Nacional do Centro de Pesquisa Biológica Excelência [número de concessão 1P20GM109005], o Grant Consortium Arkansas espaço através do National Aeronautics and Space Administration [número de concessão NNX15AK32A] Saúde e do Instituto Nacional de Segurança Ocupacional e saúde (NIOSH) [número de concessão 2T420H008436]. Os autores gostariam de agradecer a Christopher Fettes para revisão e edição deste manuscrito.

1. Recolha de partículas e Preparação <ol><li> Calibração do dispositivo de amostragem partículas total de alto volume suspensa <ol><li> Desligar o motor amostrador a partir do controlador de fluxo de massa e ligar o motor a uma fonte de alimentação de CA estável (Figura 1). NOTA: Um filtro não é usado durante este procedimento. </li><li> Monte o orifício calibrador e superior placa adaptadora de carregamento para o amostrador. Aperte os principais adaptador de carga porcas de fixação da segurança para garantir que não há vazamentos de ar estão presentes. Permitir que o motor amostrador aquecer até à sua temperatura de funcionamento normal (aproximadamente 10-15 min). </li><li> Realizar um teste de vazamento, cobrindo os furos na parte superior do orifício e da pressão da torneira no orifício com as mãos. Ouvir um som agudo estridente feito por escapar ar. Se este som é ouvido, volte a apertar os principais adaptador de carga porcas de sujeição como um vazamento está presente. Se o som é mais baixo, o vazamento é perto de uma das outras juntas nas sysTEM. </li><li> Conectar um lado de um manómetro de água da torneira à pressão no lado do orifício com um tubo de vácuo de borracha. Deixar o lado oposto do manómetro aberto para a atmosfera. Segure um manómetro verticalmente para garantir leituras precisas. Tocar na parte traseira do gravador de fluxo contínuo vai ajudar a centrar a caneta e fornecer leituras precisas. </li><li> Repita o passo 1.1.2, usando cinco vazões que representam as taxas de fluxo que operam a partir de 30 a 60 pés / min (aproximadamente a cada 5-6 pés 3 / min). Ajuste o botão no orifício variável em cinco posições diferentes e ter cinco leituras diferentes. </li><li> Grave a temperatura ambiente do ar, pressão ambiente, número de série amostrador, número de série orifício, inclinação orifício e intercepção com data do último certificado, a data, local do site, e as iniciais do operador sobre a folha de calibragem. </li></ol></li><li> Coleta de amostra total de partículas suspensas e análise gravimétrica <ol><li> enrole uma8 &quot;x 10&quot; filtro de fibra de quartzo em duas camadas de folha de alumínio. Colocar o filtro envolvido na fornalha e ajustar a temperatura a 550 ° C. Coza no filtro durante pelo menos 4 h. Deixe o fresco do forno e recuperar o filtro. Colocar o filtro no exsicador com CaCO3. </li><li> Pesa-se o filtro numa microbalança com precisão de 10 ug. Repetir a medição três vezes durante um dia. medições individuais deverão estar dentro de 25 ug. Se isto não for conseguido, devolver o filtro enrolado para o exsicador e repetir o processo no dia seguinte. </li><li> Abrir a tampa do abrigo (Figura 2). Retire o filtro chassis de suporte soltando os quatro porcas de asa, permitindo que os parafusos de latão e arruelas para oscilar para baixo fora do caminho. Desdobrar o filtro da folha de alumínio, e utilize uma pinça limpas para centralizá-lo cuidadosamente, lado mais áspero para cima, na tela de apoio. Alinhe corretamente o filtro na tela. </li><li> Coloque a moldura na tela e prenda-o comos parafusos e anilhas de metal enquanto aplica pressão suficiente para evitar fugas de ar nas extremidades. Limpe qualquer acúmulo de poeira de todo o suporte do filtro com um pano limpo. Feche a tampa abrigo com cuidado e prendê-lo. </li><li> Certifique-se de todos os cabos estão conectados a suas bases receptáculo apropriado e a tubulação entre a torneira de pressão do motor do ventilador e o gravador de fluxo contínuo está ligado. </li><li> Prepara-se o gravador de fluxo. Deprimir a pena braço levantador para levantar ponto caneta e inserir um novo gráfico. Alinhe a guia do gráfico para o cubo de acionamento do gravador e pressione com o polegar para abaixar o centro de gráfico no cubo. tempo definido pela rotação do cubo de acionamento dos ponteiros do relógio até a hora correta no gráfico é alinhada com o ponteiro índice de tempo. </li><li> alternar manualmente no amostrador e iniciar a coleta. Monitorar o gravador para ter certeza de que está cobrindo corretamente e o indicador de tempo decorrido para ter certeza de que está funcionando corretamente. </li><li> No final do período de recolha de amostras, desligar o amostrador, fichao tempo decorrido e recuperar o gráfico. Remover o quadro para expor o filtro. Retire o filtro exposta a partir da tela de suporte, segurando-o delicadamente nas extremidades com a pinça. Dobre o filtro de comprimento de modo que a amostra toca amostra duas vezes e envolvê-la na folha de alumínio original. </li><li> Armazenar o filtro em um exsicador com CaCO3 para, pelo menos, 24 h antes da pesagem. Repita o passo 1.2.2 para medir o peso dos filtros após a amostragem. Coloque o filtro em um saco plástico zip e guarde-a -80 ° C até análise. </li></ol></li><li> Análise de amostra de partículas totais em suspensão recolhidas <ol><li> Recuperar o filtro armazenados, abra a folha de alumínio e transferir o filtro sobre uma superfície de Teflon limpa. Utilizando uma pinça e bisturi, cortar a parte exterior (branco) do filtro e descarte. <ol><li> Em seguida, cortou o filtro em 0,5 &quot;x 0,5&quot; pedaços e peças para um balão de 100 ml. Adicionar 50 ml de água ultrapura. Colocar o recipiente em um ultra-sombanheira e sonicate durante 60 minutos a 33 ± 3 kHz. </li></ol></li><li> extrato de filtro através de um filtro de seringa em polipropileno de 0,45 um a um frasco de 100 ml de fundo redondo. Evapora-se a água usando um aparelho evaporador rotativo sob pressão a 50 ° C até cerca de 5 ml de extracto permanece no frasco. <ol><li> Evapora-se a água restante em um frasco de 15 ml em forma de pêra de peso conhecido. Pesa-se o balão com o extracto seco e registar a massa do extracto seco. </li></ol></li><li> Dissolve-se a amostra seca com 400 ul de D 2 O por sonicação durante 15 minutos e transferir para um tubo de RMN de 5 mm padrão. Centrifugar durante 5 min a 12.000 xg, à temperatura ambiente para remover qualquer matéria não dissolvida. </li><li> Repetir com 300 ul de D 2 O. Adicionar 10 ul de NaN3 1,4% (concentração final .: 0,02% w / v) no tubo de RMN. Adicionam-se 10 ul (32 ug) de partículas totais em suspensão (TSP) D4 (3,2 mg / ml) em D 2 O (concentração final de 0,258 mM) no tubo de RMN. </li><li>Adquirir espectros de 1 H RMN utilizando um espectrómetro de RMN operando a 600,17 MHz. <ol><li> Inserir o tubo de RMN em crio-sonda de ressonância tripla. Calibrar o aparelho na seguinte ordem: fechamento, melodia, calço, calibragem de comprimento de 90 ° de pulso e ajuste de ganho do receptor. </li><li> Medir espectros a 25 ° C com um 1 D sequência de excitação esculpir usando 180 pulsos seletiva de água em modo de detecção de Quad Digital, 8.192 exames, 4 scans manequim, largura de varredura de 8012,57 Hz, freqüência de offset para a supressão do sinal de água fixado em 4,70 ppm, 1,70 seg tempo de aquisição, pontos de dados de domínio 32.768 tempo (DT), 1 gradiente de duração ms (p16), 100 ms de atraso recuperação após gradiente (d16). </li></ol></li><li> Processo 1 H RMN Os espectros através da aplicação de um alargamento de linha de 1 Hz e de enchimento de zero por um factor de 2 (65.536 pontos de dados). Corrigir a fase e de linha de base manualmente e integrar. Definir pico TSP-d4 em 0,0 ppm. </li></ol></li></ol> Exposição 2. Partícula<ol><li> Cultura configurado <ol><li> meios de crescimento completo quente contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) e solução de penicilina-estreptomicina (100 U / ml), solução de tripsina a 0,25% e de magnésio de fosfato de cálcio livre tampão salino (PBS) num banho de água (a 37 ° C) durante pelo menos 30 min antes do início da cultura. </li><li> Retire um frasco T75 a partir de 5% de CO 2 incubadora contendo células cultivadas RAW264.7 e lavar as células com 2 ml de PBS pré-aquecido duas vezes. </li><li> Desalojar as células aderentes RAW264.7 a partir do fundo do recipiente de cultura de tecido usando 1 ml de solução de tripsina pré-aquecida, seguido por raspagem. </li><li> Recolher as células a partir do vaso de cultura de tecidos e fazer uma suspensão de células individuais por pipetagem repetida. Contar o número de células com azul de tripano e a placa a uma densidade de 8000 / cm2 (500.000 células totais) em uma placa de cultura de tecidos de 100 mm, com meio completo pré-aquecido. Ajustar o volume de suporte de 10 ml para uma concentração final de 50000 célulaspor ml. NOTA: dobrar o número de placas se a análise de metilação do DNA também é realizada. </li><li> Colocar as células plaqueadas RAW264.7 recém volta em 5% de CO2 a 37 ° C e deixa-se aderir durante 24 h. </li><li> Também em uma cabine de segurança biológica, ressuspender as partículas filtradas. Por exemplo, dilui-se as partículas a uma concentração de 0,5 mg / ml em PBS estéril para uma dose de tratamento de 5 ug / ml e de 5 mg / mL para uma dose de tratamento de 50 ug / ml. As diluições podem ser preparados até meses de antecedência e guardadas a -80 ° C. </li></ol></li><li> O tratamento com material particulado <ol><li> Retire as células de 5% de CO 2 incubadora e verificar em 10x utilizando um microscópio invertido para o crescimento celular, morfologia celular, condição de cultura e contaminação. Deve-se esperar ter, pelo menos, 30% de células confluentes na presente fase. </li><li> Assepticamente, aspirar a mídia que usa a pipeta esterilizada e lavar o recipiente de cultura com 2 ml 37 ° C PBSduas vezes para remover completamente os meios de comunicação e células flutuantes ou mortas. </li><li> Adicionar dose pré-determinada de material particulado por meio fresco nos vasos de cultura e incuba-se durante o tempo desejado a 37 ° C em 5% de CO2. Neste estudo, o tratamento de células com RAW264.7 PM durante 72 horas para paralelo a exposição utilizada para a análise e genotóxica epigenotoxic concomitante. NOTA: A citotoxicidade pode afetar negativamente a qualidade da análise citogenética. Assim, ensaios adicionais, tais como citotoxicidade, a metilação do DNA, Western blotting, ou análise da expressão do gene são tipicamente realizadas em células tratadas. Expor as células como descrito e prosseguir com o ensaio específico desejado. usuários inexperientes também pode querer incluir um controlo positivo, tais como metanossulfonato de metilo para testar a sua capacidade de detectar CAs. </li></ol></li></ol> 3. Ensaio citogenética <ol><li> Tratamento para prender células em metáfase <ol><li> Aqueça o colcemid assimlução (10 ug / ml) num banho de água a 37 ° C durante 30 min. Limpe a tampa com álcool a 70% no âmbito de um gabinete de biossegurança para minimizar o risco de contaminação </li><li> Remover completamente os meios de comunicação de forma asséptica e lavar os recipientes de cultura com 2 ml de pré-aquecido PBS duas vezes. </li><li> Adicionar meio fresco pré-aquecido (2 ml de meio / 10 6 células) contendo solução colcemida (5 ul / ml) no recipiente de cultura e incuba-se durante 2 h. </li></ol></li><li> colheita celular <ol><li> solução de tripsina quente e PBS num banho de água mantido a 37 ° C durante 30 min. A partir deste passo em diante, não há necessidade de manter a condição asséptica. </li><li> Remover completamente meios, lavar os recipientes de cultura com 2 ml de 37 ° C de PBS por duas vezes, adicionar o volume necessário de uma solução de tripsina pré-aquecido (em geral, de 2 ml para placa de cultura de 60 mm ou frasco T25 e 4 ml de placa de 100 mm ou frasco T75 ), e colocar o recipiente de cultura de volta em 5% de CO2 a 37 ° C durante 1 min. </li><li> Take o recipiente de cultura, retire as células usando um raspador, e adicione 10 ml de PBS para parar a ação de tripsina. </li><li> Pipeta cima e para baixo, pelo menos, dez vezes para fazer a suspensão única célula e as células de transferência em um tubo de 15 ml de fundo cónico de centrífuga. </li><li> suspensão de células Centrifugar a 400 xg durante 5 minutos em um balanço para fora centrifugadora à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante, quebrar o sedimento celular batendo suavemente, adicionar 10 ml de PBS e, novamente, centrifugar durante cinco minutos. </li></ol></li><li> Tratamento hipotónico e fixação <ol><li> Pré-aquecido solução de cloreto de potássio 0,075 M em um banho de água 37 ° C pelo menos durante 30 min. </li><li> Remover o sobrenadante sem perturbar o pelete de células e deixar cerca de 0,5 ml de PBS. </li><li> Suavemente quebrar o sedimento de células e fazer a suspensão de células isoladas usando uma pipeta P200. </li><li> Adicionar gota 4 ml de solução pré-aquecida de cloreto de potássio a gota, com agitação suave. </li><li> Incubar as células em p hipotónicasolução de cloreto de otassium em um banho de água a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Faça solução acetomethanol fresco adicionando 3-peças metanol com 1-parte de ácido acético glacial. Manter este fixador recentemente preparada à temperatura ambiente. </li><li> Após o tratamento hipotónico, adicionar um volume igual (4 ml) do fixador no tubo e misturar suavemente a solução por inversão do tubo. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante. Com esse tamanho de pelotas de células estágio aumenta, tornar-se esbranquiçada e mais visível. </li><li> Remover o sobrenadante, adicionar 4 ml de fixador e mantê-la à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifuga-se a 400 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e dar mais duas lavagens com 4 ml de fixador. </li></ol></li><li> De limpeza de slides e preparação metafase <ol><li> Imergir as lâminas de vidro completamente em detergente líquido a 10% durante 30 min. </li><li> Enxaguar as lâminas cuidadosamente com água corrente fria por 30 min. </li><li> Rinse desliza três vezes com água destilada para remover completamente o detergente, mergulhe em água destilada, e guarde na geladeira para uso futuro. NOTA: A limpeza lâminas antes do uso facilita a uniformidade do espalhamento e aumenta a qualidade metáfase. </li><li> Gota suspensão de células 10 ul no slide molhado gelada e deixe-o ar seco durante a noite à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Coloração e montagem <ol><li> Prepare 50 ml de solução de coloração Giemsa pela mistura de uma parte da solução Giemsa com uma parte da PBS e despeje em um frasco Coplin. </li><li> Imergir as lâminas em solução de coloração para 20 min. </li><li> Lavar as lâminas em água destilada para remover o excesso de corante e imediatamente secar as lâminas através de um secador de cabelo. </li><li> Deixar as lâminas à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Aplique uma gota de meio de montagem no slide, coloque delicadamente uma lamela sobre o meio de montagem, permitem que o meio para espalhar sobre a lâmina lentamente e removao excesso de meio com uma toalha de papel. Permitir que a corrediça montada a secar durante pelo menos 1 h antes de se mudar ou visualização sob um microscópio para evitar o movimento da lamela. Cuidado: É importante colocar a lamela cuidadosamente sem formar quaisquer bolhas durante este passo. A utilização de excesso de calor para remover as bolhas não é recomendado. </li></ol></li><li> Tipos de observação microscópica e de aberração <ol><li> Examine os CAs estruturais na metáfase se espalha pelo 100X usando um de boa qualidade microscópio de campo brilhante. </li><li> Marque pelo menos 50 a 100 metáfase espalha para cada grupo de tratamento para tratamentos que induzem um grande número de autoridades de certificação. Para tamanhos de efeito menores, a análise de até 300 metáfase é aconselhada. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

estudo de citogenética ou análise microscópica dos números ou estruturas de cromossomos, principalmente nos spreads metáfase, fornece informações cruciais para o prognóstico, avaliação de risco e tratamento de várias doenças. está agora bem estabelecido que anomalias citogenéticas estão associados com a progressão e desenvolvimento de várias doenças, incluindo câncer. Até à data, as CAs foram encontrados em todos os principais tipos de tumores. CAs pode surgir espontaneamente ou por qualquer estímulos externos ou intern...

Estima-se que a exposição ao material particulado (PM) faz com que mais de 3 milhões de mortes em excesso por ano, principalmente por doenças cardiopulmonares e cancro do pulmão 1. Na verdade, PM foi reconhecido como carcinogênico para humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre Câncer (Grupo 1), com um risco aumentado de câncer de pulmão com o aumento dos níveis de exposição a PM foi mostrado 2. Curiosamente, quase todas as células cancerosas abrigar anormalidades cromossômicas numéricas e / ou estruturais. carbono orgânico particulado é uma variante, complexo e mistura heterogénea, cuja composição e tamanho de distribuição depende das emissões, bem como as transformações físicas e químicas. É responsável 35-55% da massa urbana PM 2,5 (PM 2,5 mm de tamanho e menores) e mais de 60% do fundo rural e continental PM 2,5 em massa 3, 4. A fração solúvel em água é responsável por 30-90% dos aerossóis orgânicos. Um grande número de compostos orgânicosForam identificados, incluindo os hidrocarbonetos alifáticos, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, e seus derivados oxigenados e nitrados, aldeídos alifáticos e álcoois, ácidos gordos livres e os seus sais, ácidos di-carboxílicos, compostos multifuncionais, proteínas e macromoléculas húmicos-like (HULIS) usando métodos cromatográficos acoplados com técnicas de espectrometria de massa 5-8. Estes compostos representam menos de 10-20% do carbono orgânico particulado, assim, a maioria de carbono orgânico é desconhecida 9. A evidência experimental sugere que a citotoxicidade, o stress oxidativo, e a inflamação estão envolvidos no desenvolvimento de estados patológicos PM-associados. Recentemente, foi mostrado, no entanto, que a exposição a PM também resulta num certo número de alterações epigenética, incluindo alterações na metilação do ADN de elementos repetitivos, tanto experimental em sistemas in vitro e em indivíduos humanos 10-12. De particular interesse são os efeitos dePM em DNA satélite - maiores e menores satélites - que são encontrados na região heterocromática em torno do centrômero dos cromossomos. Mostrou-se que estes efeitos podem ser persistente, por natureza, uma vez que pode ser detectado durante pelo menos 72 horas após a exposição 12. Alterações na metilação do ADN, em particular ao redor de centrómeros, pode levar a uma acumulação de transcritos de ARNm de ADN cromossómico por satélite, integridade compromisso durante a divisão celular e, subsequentemente, resultam no desenvolvimento de uma variedade de estados patológicos 13. Adaptação de abordagem citogenética para a análise de CAs como um ponto final de alterações epigenética causadas por PM, portanto, é de grande importância. Aqui, nós relatamos a abordagem para a recolha PM ambiente e preparação, a exposição in vitro e análise de CAs usando o murino sistema de macrófagos modelo RAW264.7. Os macrófagos compreendem a primeira linha de defesa contra os objectos estranhos inaladas e, por conseguinte, tsua linha celular serve como um modelo mais utilizado em toxicologia partícula 11, 12, 14, 15 e estabelecido.

<table><tbody><tr><td>Amostrador de partículas em suspensão total</td><td>Tisch</td><td>Environmental TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de RMN Bruker Avance III&nbsp;</td><td>Software Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Processor Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 macrófagos murinos</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Alta glicose DMEM GlutaMAX media</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>Warm in a 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Quente em um 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Quente em um 37 &graus; C banho-maria antes</td></tr><tr><td>do uso Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Quente em um 37 &graus; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Quente em um 37 &graus; C banho-maria antes de usar</td></tr><tr><td>KaryoMAX Solução de Colcemida em PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>Quente em um 37 &deg; C banho-maria antes de usar</td></tr><tr><td>Solução de Cloreto de Potássio KaryoMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>Quente em um 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Metanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Detergente Líquido</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Soluções de Coloração Wright e Wright-Giemsa</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Meio</td> <td>de Montagem PermanenteFisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

análise da aberrações cromossômicas induzidas matéria ambient particulate usando um<em&gt; in vitro</em&gt; sistema

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

A exposição a partículas (PM) é um importante problema de saúde mundial, que pode danificar vários componentes celulares, incluindo o material genético nuclear. Para avaliar o impacto da PM na integridade genética nuclear, aberrações cromossómicas estruturais são marcados nos spreads metáfase de macrófagos do rato RAW264.7. PM é recolhida a partir do ar ambiente com um amostrador de partículas totais alto volume suspenso. O material recolhido é solubilizado e filtrou-se para reter a porção fina solúvel em água. As partículas são caracterizadas por composição química por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Diferentes concentrações de suspensões de partículas são adicionados para uma cultura in vitro de macrófagos de ratinho RAW264.7 para um tempo total de exposição de 72 horas, juntamente com as células de controlo não tratadas. No final da exposição, a cultura é tratada com colcemida para prender células em metafase. As células são então recolhidas, tratou-se com uma solução hipotónica, fixo em acetomethanol, dropped em lâminas de vidro e, finalmente, corados com solução de Giemsa. Slides são examinados para avaliar as aberrações estruturais cromossómicas (CAs) em metáfase se espalha de 1000X ampliação usando um microscópio de campo brilhante. 50 a 100 metafase são marcados para cada grupo de tratamento. Esta técnica é adaptado para a detecção de aberrações estruturais cromossómicas (CAs), como quebras de tipo chromatid, trocas do tipo chromatid, fragmentos acêntricos, cromossomas dicêntricos e anel, minutos duplos, endorreduplicação, e translocações Robertsonianas in vitro após exposição a PM. É um método poderoso para associar um ponto de extremidade citogenética bem estabelecida a alterações epigenética.

Grande deve ser tomado cuidado na escolha da localização do dispositivo de amostragem de TSP, bem como a altura do ano em que a recolha é realizada. A composição química, bem como o tamanho das partículas pode influenciar significativamente os resultados. O material recolhido deve ser visível em relação ao filtro branco. Um rato metaphase propagação normais terá 40 cromossomos acêntricos. O objectivo da técnica é demonstrar uma alteração (ou ausência da mesma) na proporção de cromossomas...

Este protocolo descreve técnicas para a quantificação e caracterização de aberrações cromossómicas in vitro em macrófagos de camundongos RAW264.7 após o tratamento com partículas do ar ambiente.

Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

O objetivo geral deste experimento é detectar danos cromossômicos induzidos pela exposição de células a material particulado, extraído do ar ambiente. Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental na área do material particulado, que é saber se a exposição ao material particulado induz danos cromossômicos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a visualização direta dos danos induzidos no material genético.Após coletar e analisar as partículas de acordo com o protocolo descrito, realize a exposição às partículas aquecendo o meio de crescimento completo, a tripsina a 0,25% e o PBS em banho-maria a 37 graus celsius, por pelo menos 30 minutos antes da iniciação do cultivo. Após lavar as células RAW 264.7, adicione um mililitro da solução de tripsina aquecida ao recipiente e desprenda as células do fundo do frasco de cultura de tecidos por meio de raspagem. Em seguida, colete as células e prepare uma suspensão de células simples por pipetagem repetida.Com azul de tripano, conte o número de células e, em seguida, utilize meio completo pré-aquecido para semeá-las numa densidade de 8000 por centímetro quadrado em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros. Em seguida, utilize meio completo para ajustar o volume a 10 mililitros, obtendo uma concentração final de 50.000 células por mililitro. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ por 24 horas para permitir sua adesão.Em uma cabine de segurança biológica, use PBS estéril para diluir partículas filtradas a uma concentração de 0,5 miligramas por mililitro, para uma dose de tratamento de 5 microgramas por mililitro, e a 5 miligramas por mililitro, para uma dose de tratamento de 50 microgramas por mililitro. Para tratar as células com material particulado, verifique as células cultivadas sob microscópio com aumento de 10x quanto ao crescimento celular, morfologia celular, condição do cultivo e contaminação. Nesta etapa, as células devem estar com pelo menos 30% de confluência.Usando uma pipeta estéril, aspire assépticamente o meio e utilize dois mililitros de PBS a 37 graus celsius para lavar o recipiente de cultura duas vezes. Adicione uma dose previamente determinada de material particulado com meio fresco e incube as culturas a 37 graus celsius e 5%CO2, em paralelo à exposição utilizada para análise concomitante de genotoxicidade e epigenotoxicidade. Para deter as células na metáfase, após lavar as células, adicione dois mililitros de meio pré-aquecido com cinco microlitros por mililitro de solução de colcemida ao cultivo e incube a 37 graus celsius e 5%CO2 por duas horas.Após a incubação, remova completamente o meio e use PBS quente para lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione a solução de tripsina e incube as culturas a 37 graus celsius por um minuto. Usando um espátula celular, desprenda as células e adicione 10 mililitros de PBS para inativar a tripsina.Em seguida, aspire e reponha as células para cima e para baixo pelo menos dez vezes para obter uma suspensão de células isoladas e transfira as células para um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Coloque os tubos em uma centrífuga com rotor pendular e centrifugue a suspensão celular a 400 × g, em temperatura ambiente, durante cinco minutos. Para realizar o tratamento hipotônico, remova o sobrenadante dos tubos sem perturbar o pellet celular e deixe aproximadamente 0,5 mililitros de PBS.Quebre suavemente o pellet celular e use uma pipeta P200 para obter uma suspensão simples de células. Em seguida, adicione quatro mililitros de solução pré-aquecida de cloreto de potássio gota a gota, com agitação suave. Incube a suspensão celular em banho-maria a 37 graus celsius por 20 minutos.Após o tratamento hipotônico, fixe as células adicionando um volume igual de fixador ao tubo e misture suavemente invertendo o tubo. Centrifugue os tubos a 400 vezes g, à temperatura ambiente, por cinco minutos e remova o sobrenadante. Nesta etapa, o pellet celular terá aumentado de tamanho, ficando com coloração esbranquiçada e mais visível.Remova o sobrenadante. Adicione quatro mililitros de fixador fresco e incube os tubos à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, centrifugue os tubos, remova o sobrenadante e lave as células mais duas vezes com quatro mililitros de fixador.Mergulhe completamente as lâminas de vidro em detergente líquido a 10% durante 30 minutos. Em seguida, enxágue bem as lâminas com água da torneira fria corrente por 30 minutos. Utilize água destilada para enxaguar as lâminas três vezes, removendo completamente o detergente.Em seguida, mergulhe-os em água destilada e armazene as lâminas na geladeira durante a noite. Coloque dez microlitros de suspensão celular sobre uma lâmina úmida gelada e deixe secar durante a noite à temperatura ambiente. Para corar e montar as amostras, prepare 50 mililitros de solução de coloração de giemsa misturando uma parte de solução de corante giemsa com uma parte de PBS e despeje em um frasco coplin.Imersão das lâminas na solução de coloração por 20 minutos, depois enxaguar as lâminas em água destilada para remover o corante em excesso e, imediatamente, usar um secador de cabelo para secar as lâminas. Deixar as lâminas à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, aplicar uma única gota de meio de montagem sobre a lâmina.Coloque suavemente uma lamínula por cima e permita que o meio de montagem se espalhe lentamente sobre a lâmina. Em seguida, use uma toalha de papel para remover o excesso de meio. Por fim, utilize um microscópio de campo claro com ampliação de 100x para examinar as aberrações cromossômicas estruturais nas metáfases espalhadas.Esta imagem mostra que um cariótipo normal de metáfase de camundongo terá 40 cromossomos acêntricos. O tratamento com material particulado induz diversas aberrações cromossômicas, como quebra de cromátide, fragmento acêntrico, cromossomo em anel, cromossomo dicêntrico, minutos duplos, translocação de Robertson e endorreduplicação. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que apenas células em proliferação devem ser utilizadas.Após este procedimento, outros métodos, como M-FISH e SKY, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como a presença de aberrações intercromossômicas estáveis. Não se esqueça das precauções e dos agentes cancerígenos, e de medidas como o uso de luvas, que devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Xenopus egg extracto é um sistema modelo útil para investigar o checkpoint danos no DNA. Este protocolo é para a preparação de extractos de ovos de Xenopus e os danos do ADN reagentes indutores de ponto de verificação. Estas técnicas são adaptáveis ​​a uma variedade de abordagens que danificam o ADN no estudo da sinalização checkpoint danificam o DNA.

Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando<em&gt; Xenopus</em&gt; Os extratos de ovos

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em imunofluorescência altamente sensível para detectar danos oxidativos induzidos por PM2.5 no coração de embriões de peixe-zebra, medindo os níveis de 8-OHdG e γH2AX, que indicam danos ao DNA e quebras de DNA de fita dupla, respectivamente.

Ensaio de imunofluorescência para detectar danos ao DNA mediados por PM2.5 em embriões de peixes

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células vivas, tais como linfócitos ou fibroblastos de pele, e a partir de organismos, incluindo seres humanos ou ratinhos. Estas preparações cromossômicas pode ser ainda utilizado para a rotina de bandamento G e procedimentos de citogenética molecular, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY).

Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Vias de reparo de DNA são essenciais para a manutenção da integridade genômica e mutação prevenção e câncer. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica por observação direta de aberrações cromossômicas em metáfase se espalha a partir de células de rato B usando hibridização in situ fluorescente (FISH) para repetições de DNA telomérico.

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

Descrevemos as etapas detalhadas de um ensaio químico de alto rendimento no nematóide Caenorhabditis elegans usado para avaliar a toxicidade da linha germinativa. Neste ensaio, a interrupção da função germinativa após a exposição química é monitorada usando um repórter fluorescente específico para embriões aneuploides.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Um protocolo para avaliar alterações nos níveis de dano ao DNA e na capacidade de reparo do DNA que podem ser induzidas por irradiação crônica in vivo de baixa dose em linfócitos do baço de camundongo, medindo a histona fosforilada H2AX, um marcador de quebras de fita dupla de DNA, usando citometria de fluxo é apresentado.

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica<em&gt; In Vivo</em&gt; A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação

O presente protocolo descreve a utilidade da hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH) e do cariótipo espectral (SKY) na identificação de aberrações estáveis intercromossômicas nas células da medula óssea de camundongos após exposição à irradiação total do corpo.

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

O ensaio de micronúcleos in vitro é um método bem estabelecido para avaliar a genotoxicidade e a citotoxicidade, mas marcar o ensaio utilizando a microscopia manual é trabalhoso e sofre de subjetividade e variabilidade interscorer. Este papel descreve o protocolo desenvolvido para executar uma versão inteiramente automatizada do ensaio usando a citometria do fluxo da imagem latente Multispectral.

Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

Nós descrevemos aqui métodos para a quantificação sensível e exata das lesões 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-DGUO) no ADN. Os métodos foram aplicados na avaliação dos efeitos da matéria particulada fina ambiente (PM2,5) nos tecidos (pulmão, fígado e rim) de camundongos a/J expostos.

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Desenvolvemos um método QuEChERS-HPLC modificado para avaliar os níveis internos de 16 PAHs em embriões de peixe-zebra.

Um método QuEChERS-HPLC modificado para detecção de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos em embriões de peixe-zebra expostos a partículas finas

Aprenda a detectar aberrações cromossômicas induzidas por matéria particulada do ar ambiente usando macrófagos RAW264.7 in vitro. Este método permite visualizar diretamente danos no material genético.

Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um

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