Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um In Vitro Sistema

O objetivo geral deste experimento é detectar danos cromossômicos induzidos pela exposição das células ao material particulado, extraído do ar ambiente. Este método pode ajudar a responder a uma questão-chave no campo do material particulado, que é a exposição ao material particulado induz danos cromossômicos? A principal vantagem desta técnica, é que permite a visualização direta dos danos induzidos no material genético.

Depois de coletar e analisar as partículas de acordo com o protocolo de texto, realize a exposição às partículas aquecendo o meio de crescimento completo, 0,25% de tripsina e PBS em banho-maria a 37 graus Celsius, por pelo menos 30 minutos antes do início da cultura. Depois de lavar as células 264,7 cruas, adicione um mililitro da solução quente de tripsina ao prato e desaloje as células do fundo do vaso de cultura de tecidos por raspagem. Em seguida, colete as células e faça uma suspensão unicelular por pipetagem repetida.

Com o azul de tripano, conte o número de células e, em seguida, use meio completo pré-aquecido para colocá-las em placas a uma densidade de 8000 por centímetro quadrado em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros. Em seguida, use o meio completo para ajustar o volume para 10 mililitros para uma concentração final de 50.000 células por mililitro. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas para permitir que elas se fixem.

Em um gabinete de biossegurança, use PBS estéril para diluir partículas filtradas a uma concentração de 0,5 miligramas por mililitro, para uma dose de tratamento de 5 microgramas por mililitro, e a 5 miligramas por mililitro, para uma dose de tratamento de 50 microgramas por mililitro. Para tratar células com material particulado, verifique as células cultivadas sob um microscópio com ampliação de 10x quanto ao crescimento celular, morfologia celular, condição de cultura e contaminação. As células devem estar pelo menos 30% confluentes nesta fase.

Usando uma pipeta estéril, aspire assepticamente o meio e use dois mililitros de PBS a 37 graus Celsius para lavar o recipiente de cultura duas vezes. Adicione uma dose pré-determinada de material particulado com meio fresco e incube as culturas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 para paralelamente à exposição usada para análises genotóxicas e epigenotóxicas simultâneas. Para prender as células na metáfase, após a lavagem das células, adicione dois mililitros de meio pré-aquecido com cinco microlitros por mililitro de solução de colcemida à cultura e incube a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por duas horas.

Após a incubação, remova completamente o meio e use PBS quente para lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione a solução de tripsina e incube as culturas a 37 graus Celsius por um minuto. Usando um raspador de células, separe as células e adicione 10 mililitros de PBS para inativar a tripsina.

Em seguida, pipete as células para cima e para baixo pelo menos dez vezes para criar uma suspensão de célula única e transfira as células para um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros. Coloque os tubos em uma centrífuga giratória e gire a suspensão da célula a 400 vezes g e temperatura ambiente por cinco minutos. Para realizar o tratamento hipotônico, remova o sobrenadante dos tubos sem perturbar o pellet celular e deixe aproximadamente 0,5 mililitros de PBS.

Quebre suavemente o pellet celular e use uma pipeta P200 para fazer uma suspensão de célula única. Em seguida, adicione quatro mililitros de solução de cloreto de potássio pré-aquecida gota a gota com agitação suave. Incube a suspensão celular em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos.

Após o tratamento hipotônico, fixe as células adicionando um volume igual de fixador ao tubo e misture suavemente invertendo o tubo. Centrifugar os tubos a 400 vezes g à temperatura ambiente durante cinco minutos e retirar o sobrenadante. Nesta fase, o pellet celular terá aumentado de tamanho e se tornará de cor esbranquiçada e mais visível.

Remova o sobrenadante. Adicione quatro mililitros de fixador fresco e incube os tubos em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, centrifugue os tubos, remova o sobrenadante e use quatro mililitros de fixador para lavar as células mais duas vezes.

Mergulhe as lâminas de vidro completamente em detergente líquido a 10% por 30 minutos. Em seguida, enxágue bem as lâminas em água fria corrente por 30 minutos. Use água destilada para enxaguar as lâminas três vezes para remover completamente o detergente.

Em seguida, mergulhe-os em água destilada e guarde as lâminas na geladeira durante a noite. Solte dez microlitros de suspensão de células em uma lâmina úmida resfriada e deixe secar durante a noite em temperatura ambiente. Para corar e montar as amostras, prepare 50 mililitros de solução de coloração giemsa misturando uma parte da solução de coloração giemsa, com uma parte de PBS, e despeje em um frasco de coplin.

Mergulhe as lâminas em solução de coloração por 20 minutos, depois enxágue as lâminas em água destilada para remover o excesso de manchas e use imediatamente um secador de cabelo para secar as lâminas. Deixe as lâminas em temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, aplique uma única gota de meio de montagem no slide.

Coloque suavemente uma lamínula na parte superior e deixe o meio de montagem se espalhar lentamente sobre o slide. Em seguida, use uma toalha de papel para remover o excesso de meio. Finalmente, use um microscópio de campo brilhante com ampliação de 100x para examinar as aberrações cromossômicas estruturais nas propagações da metáfase.

Esta imagem mostra que uma metáfase normal de camundongo terá 40 cromossomos acêntricos. O tratamento com material particulado induz várias aberrações cromossômicas, como quebra de cromátide, fragmento acêntrico, cromossomo em anel, cromossomo dicêntrico, minutos duplos, translocação robertsoniana e endoreduplicação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que apenas células em proliferação devem ser usadas.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como M-FISH e SKY, podem ser usados para responder a perguntas adicionais. Como se aberrações estáveis intercromossômicas estão presentes. Não se esqueça dos cuidados e carcinógenos, e precauções como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.