Name: Cultura de murino embrionárias Metatarsos: Um modelo fisiológico de Endocondral ossificação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a cultivar metatarsos embrionários de murinos para estudar ossificação endocondral e mineralização óssea. Este modelo ex vivo mantém interações celulares fisiológicas para investigar o crescimento ósseo.

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Somos gratos ao Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BBSRC) pelo financiamento DH (BB/J01446X/1), CF e VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). Também agradecemos à Arthritis Research UK pelo financiamento do KAS (20413). Agradecemos à Srta. Elaine Seawright por sua assistência com os experimentos detalhados, ao Dr. Neil Mackenzie por sua assistência com as técnicas lentivirais e ao Sr. Darren Smith e ao Sr. Alex Robertson (Roslin Institute BRF) por sua assistência com os estudos em animais.

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram realizados em conformidade com os Animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act 1986 e os animais foram mantidos de acordo com o Ministério do Interior publicou Código de Boas Práticas para o alojamento e tratamento dos animais criados, transmitidos ou utilizados para fins científicos. NOTA: As experiências levadas a cabo utilizando o tipo selvagem C57BL / 6J são bem estabelecida e descrita a seguir. Metatarsos embrionárias a partir de diferentes estirpes de ratinho podem similarmente ser cultivadas in vitro, apesar de as suas taxas de crescimento e a mineralização pode ser diferente para os aqui detalhados. 1. As condições dissecação e preparação de instrumentos <ol><li> Executar toda a preparação de mídia, tecidos dissecções e trabalhar a cultura em uma capela de fluxo laminar para garantir a esterilidade da mídia e rudimentos embrionárias. </li><li> Permitir cultura e meios de dissecção a equilibrar durante, pelo menos, 1 hora num banho a 37 ° C, 5% de CO2 antes da utilização. </li><li> esterilizar dissecçãotesouras, Dumont # 5 e # 4 Dumont pinças ao lado de um par de superfino Vannas micro tesoura (8 cm em linha reta, lâminas de 3 mm) por autoclavagem. Após autoclavagem, mergulhar o material de dissecação em etanol 70% antes da utilização. </li></ol> 2. Preparação de Dissecção e Meios de Cultura <ol><li> Prepare meio de dissecção <ol><li> Dilui-se meio essencial mínimo α-(sem nucleósidos, aMEM) em tampão fosfato salino (PBS) (01:13) e ressuspender a albumina de soro bovino (BSA) a 2 mg / m L, antes da esterilização por filtração através de uma seringa de diâmetro de 0,22 um, 33 milímetros filtro. NOTA: O meio de dissecção podem ser feitas, esterilizada por filtração e armazenada em alíquotas a -20 ° C indefinidamente. </li></ol></li><li> Prepare meio de cultura <ol><li> Culturas metatarsos embrionárias em 300 ul de meio de cultura (em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços). Prepara-se o meio de cultura pela adição de 0,2% w / v de BSA; 5 ug / ml de L-ASCOfosfato ácido rbic; 1 mM β-glicerofosfato (βGP; opcional - veja seção de resultados); 0,05 mg / ml de gentamicina e 1,25 mg de anfotericina B a aMEM e filtro de esterilização através de um filtro de seringa de 0,22 um de diâmetro, 33 mm. </li></ol></li></ol> 3. Murino Embryonic metatarso Dissecção e Cultura <ol><li> Abater o mouse grávida, abrigando embriões de 15 dias de idade, por deslocamento cervical, de acordo com as diretrizes de escritório em casa no Reino Unido </li><li> Coloque o supino animais e desinfectar a pele por pulverização com 70% de etanol. Utilizando tesouras de dissecação fazer uma grande incisão na linha média, penetrar a pele e o peritoneu para expor a cavidade abdominal. </li><li> Localizar os dois cornos uterinos do animal na região dorsal da cavidade do corpo. Retire os cornos uterinos, começando por libertar cada uterina do mesométrio por incisões cuidadosas com tesouras de dissecação e, finalmente, cortar os cornos uterinos livre em sua base. Place cornos uterinos em meio de dissecção. </li><li> Separe cada embrião, cortando entre locais de implantação ao longo do corno uterino e remover os embriões de seus sacos individuais usando uma pinça. embriões de reforma por decapitação, em conformidade com as diretrizes de escritório em casa no Reino Unido </li><li> Após desinfecção da pele por pulverização com 70% de etanol, usa Vannas micro tesouras para remover os membros posteriores dos embriões por incisão em torno do fémur proximal. Isto assegura tanto do membro posterior quanto possível é removido. Colocar os membros posteriores para uma placa de Petri em meio submerso dissecção antes da dissecação metatarso. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, começar a remover a pele ao redor do pé embrionário, por beliscar e puxá-lo usando o # 5 pinças, enquanto segurando o membro posterior constante usando o # 4 pinças. Isto é mais eficazmente realizada, agarrando a pele em torno do nível da tíbia e puxando para as falanges. A utilização de tesouras, nesta fase, para cortar opele muito fina não é necessária. </li><li> Cuidadosamente manter os tarsos do pé embrionária com # 4 pinças e retire o primeiro e quinto metatarsos por beliscar fora perto dos tarsos utilizando # 5 pinças e descarte. </li><li> Com o pé realizada na mesma posição, utilize o # 5 pinças para perturbar os tecidos conjuntivos entre as três falanges restantes e metatarsos. Insira a ponta do # 5 pinças na articulação entre as falanges e metatarsos para remover as falanges dos metatarsos. </li><li> Finalmente, use # 5 pinças para perturbar os tecidos conjuntivos entre os tarsos e metatarsos. Mais uma vez colocar a ponta do # 5 pinças no espaço da articulação entre os tarsos e metatarsos e gentilmente liberar os metatarsos dos tarsos. </li><li> Levante com cuidado os metatarsos agora livres com # 4 pinças e lugar em meio dissecção fresco. NOTA: dissecção cuidadosa deve fornecer 6 metatarsos de cada embrião. </li><li> Quando todos os metatarsos necessários foram dissecados, carefully lugar metatarsos individualmente em placas de 24 poços pré-aquecido contendo 300 ul de meio de cultura. Metatarsos de cultura a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5% durante até 14 dias. NOTA: Não altere os meios de comunicação de culturas E15, pelo menos até o dia 5 de cultura como isso afeta a sua capacidade de mineralização 26. As razões para isso não são claras, mas o crescimento linear e mineralização da matriz pode ser dependente de estimulação por fatores de crescimento liberados a partir dos metatarsos. </li></ol> 4. Análise e manipulação de culturas Metatarsal <ol><li> No dia da dissecção (dia 0) fazer medições longitudinais iniciais utilizando um microscópio com uma câmara montada e análise de imagem digital de software. Medir o comprimento da zona de mineralização central quando aparece depois de alguns dias de cultura. </li><li> Periodicamente, se necessário, fazer as medições posteriores (geralmente a cada 2º dia) até o último dia da cultura em que ponto mossos etatarsal são processados ​​depende de resultados necessários (discutido na introdução). </li><li> Médio Suplemento de culturas metatarso de órgãos com vários factores exógenos, por exemplo, fatores de crescimento, hormônios e agentes farmacológicos do dia 0 da cultura 22,24. Em todos os estudos deste tipo, o controlo não tratados metatarsos são necessários. NOTA: Embora seja aconselhável que os ossos de controle são o rudimento equivalente da perna contralateral, até hoje não houve quaisquer diferenças no crescimento linear ou potencial mineralização da cultura E15 2º, 3º e 4º metatarsos (ver abaixo, Figura 2) . </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A cultura dos metatarsos embrionárias murinas fornece um modelo altamente fisiológica de crescimento endocondral e mineralização. Os primeiros estudos têm validado que E15 metatarsos do rato passar por um padrão normal de crescimento do esqueleto e diferenciação. A cartilagem (condrócitos) e o osso (osteoblastos e osteoclastos) células e as respectivas matrizes colagénicas são indistinguíveis dos observados in vivo. No entanto, existem algumas limitações reconhecidas desse modelo. A velocidade da diferenciação dos osteoclastos é prejudicada, como é o crescimento ósseo (mas não cartilagem diferenciação). O crescimento ósseo é de aproximadamente 50% mais lenta do que a observada in vivo e pode ser devido a deficiências em factores sistémicos que influenciam a produção de factores locais (por exemplo, IGF-1, BMP, etc.) 31. Além disso, é bem reconhecido que o osso é sensível ao ambiente mecânico e este é também o caso para metatarsos cultivadas, que respondem a CHanges em 32,33 carga mecânica. Por isso, em situações de carga, como descrito no presente protocolo, a mineralização e reabsorção mineral pode ser comprometida. No entanto, o modelo metatarso oferece a capacidade de medir directamente o crescimento ósseo linear que não é possível através de 2D e 3D em sistemas de cultura in vitro. Nós fornecemos uma descrição abrangente do protocolo envolvido na dissecção e cultura de E15 metatarsos murino e, na verdade, pela primeira vez, confirmar a validade de reunir o 2º, 3º e 4º metatarsos para experimentos. Metatarsos de E17 / E18 são comumente utilizados para investigar os mecanismos de crescimento de osso, devido ao seu grande potencial para crescer ex vivo por longos períodos de tempo (isto é, para além de 14 dias em cultura). Eles são um modelo bem estabelecido para investigar os papéis de fatores de crescimento no crescimento ósseo longitudinal embrionário.Além disso, a dissecção e a cultura de metatarsos pós-natal é normalmente utilizados para delinear os mecanismos que rodeiam o crescimento do osso pós-natal, como é entendido que o crescimento do osso e o crescimento pós-natal do osso fetal são reguladas de forma diferente 21. O crescimento do osso observada nos metatarsos cultivadas pós-natais é contudo significativamente menor do que a observada em rudimentos embrionárias 25,34, o que limita o seu potencial em estudos a longo prazo e destacando a influência sistémica mais no crescimento ósseo, nesta fase, pós-natal. Com efeito, 3 dias de idade de ratos pós-natais metatarsos são tipicamente o último estágio que podem ser usadas para se obter 34 crescimento mensurável. Aqui nós descrevemos nosso protocolo para o isolamento de ossos metatarsos embrionárias em E15. A ausência de mineral nos ossos metatarsos hydroxyapaptite E15 significa que eles proporcionam um modelo inigualável para investigar não apenas os mecanismos em torno do crescimento longitudinal do osso, mas também a iniciaçãode mineralização óssea. A matriz mineralizada da zona de condrócitos hipertrófica terminal fornece um andaime para invadir osteoblastos fixar um osso matriz específica (osteóide), que é posteriormente mineralizada, e como tal esta mineralização inicial é vital para a formação óssea bem-sucedido e funcional 35. Com efeito, uma série de relatórios recentes que utilizam metatarsos E15 já confirmaram a sua capacidade única para a investigação do 28,36,37 processo de mineralização. Além disso, os investigadores descreveram a utilização de metatarsos E15 como um modelo de angiogénese 38, destacando o potencial de metatarsos embrionárias como modelo fora do ambiente de crescimento de osso / mineralização. O protocolo, descrevemos requer apenas equipamentos de laboratório padrão, incluindo um capuz de fluxo laminar, um microscópio de dissecação para a realização da dissecção e uma incubadora de CO 2 para a cultura de rudimentos excisadas. Além disso, um cul muito básicostura contendo meio aMEM, BSA, antibióticos, antimicóticos e ácido L-ascórbico (um co-factor na síntese de hidroxiprolina e hidroxilisina, dois ácidos aminados essenciais para a produção de colagénio 39) evita o uso de aditivos não definidos, tais como soros de animais . Tradicionalmente, os investigadores têm adicionado βGP aos meios usados ​​para cultura metatarsos embrionárias mas como revelado nos nossos resultados, o uso de uma fonte de fosfato adicional não é necessária para a mineralização sucesso neste sistema de cultura. Este é um achado importante em nossa busca da compreensão dos mecanismos subjacentes ECM mineralização. Metatarsos tenham sido previamente infectadas com adenovírus contendo formas dominantes negativas de Smad2 para explorar o papel do fator transformador de crescimento β na regulação do desenvolvimento a longo osso 40. Aqui, também revelam a transfecção bem sucedida de ossos de tipo selvagem E15 metatarsos com partículas de vírus GFP, indicando ttécnicas de chapéu de lentivírus podiam ser facilmente adotado para manipular a expressão de genes em culturas metatarso. Da mesma forma, o sistema de cultura de órgãos metatársico é um excelente modelo em que a comparação do crescimento de ossos de ratos geneticamente alterados para melhor compreender o papel de um gene em particular no processo de crescimento do osso. Os nossos estudos anteriores têm utilizado o sistema de cultura de órgãos metatarso para determinar o papel de supressor de citocina-2 (SOCS2) no crescimento do osso endocondral. Usando ossos metatarsos de ratinhos deficientes em SOCS2, temos mostrado que o hormônio do crescimento é capaz de simular a sua independência crescimento longitudinal de insulina como fator de crescimento (IGF-1), ao contrário dos ossos metatarsos do tipo selvagem que não respondem ao crescimento tratamento hormonal 34, 41. Isto realça a medida em que as culturas metatarsos pode ser manipulado para examinar os efeitos de diferentes genes e / ou factores exógenos de crescimento de osso endocondral. Em resumo, temos detaiconduziu a um método para a extracção e cultura bem sucedida de ossos metatarsos embrionárias que podem ser manipulados e examinada usando uma variedade de análises. Este modelo ex vivo mantém célula-célula e as interacções célula-matriz, assim como contém condrócitos em diferentes fases de condrogénese, proporcionando assim um modelo mais fisiológico do que as células em monocamada ou cultura 3D. culturas de órgãos metatarsos são, portanto, um modelo único para investigar os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela ossificação endocondral, e são essenciais para promover nossa compreensão de ambos fisiologia óssea e fisiopatologia

O esqueleto é um órgão altamente complexa, dinâmico e complexo que tem uma gama de funções que vão desde a locomoção, a homeostasia iónica. Composto de osso e cartilagem, o esqueleto consiste em populações de células funcionalmente distintos que operam para manter a sua integridade estrutural, bioquímica e mecânica 1. Uma das funções primárias do esqueleto é o seu papel no desenvolvimento e crescimento. Esses processos requerem a orquestração de várias populações celulares que são reguladas através do sistema endócrino apertado e controle genético. Com a excepção da escápula ossos chatos por exemplo, crânio e esterno, o esqueleto dos mamíferos é formado por meio do processo conhecido como ossificação endocondral. Este processo, regulada tanto molecularmente e espacialmente, começa com a condensação de células mesenquimais derivadas principalmente a partir da mesoderme 2. Sob a influência do factor de transcrição SOX9, células em the interior das condensações diferenciar em condrócitos, expressar e segregar componentes de cartilagem específicos da matriz extracelular (ECM), tais como o colagénio de tipo II e agrecana. Células na margem da condensação, expressam colágeno tipo I e formar o pericôndrio, delineando o osso prospectivo 3. Mais tarde, os osteoprogenitores do pericôndrio diferenciar em osteoblastos, dirigido por a expressão dos factores de transcrição, e Runx2 osterix 4. Isto leva a uma predominância de osteoblastos e esta camada é renomeado o periósteo que forma um colar ósseo mineralizado em torno da secção média do osso. Penetração vascular do periósteo e invasão do andaime cartilaginoso ocorre trazendo com ela, haematopoetically células derivadas de osso, reabsorção de osteoclastos, que reabsorvem os restos de condrócitos e a maior parte da matriz cartilaginosa 5. Os espaços formados são preenchidos por osteoprogenitoras que dão origem à ossificação primáriacentro que ocupa o núcleo progressivamente da diáfise e funde-se com o periósteo. Outras células dão origem à medula óssea. Por volta de nascimento, vasos sanguíneos e osteoprogenitoras penetrar na matriz rica cartilagem em ambos os lados (epífise) da diáfise desenvolvimento para formar o centro de ossificação secundário. Situado entre a epífise e diáfise em cada extremidade dos ossos longos é uma banda da cartilagem - a placa de crescimento epifisária - que é responsável pela coordenação de crescimento linear de todos os ossos longos 6. Condrócitos dentro da placa de crescimento inicialmente proliferar e posteriormente progredir através de zonas morfologicamente distintas, coordenados pela expressão seqüencial de fatores de transcrição e de crescimento. A culminação dessa sequência de eventos é a saída do ciclo celular e hipertrofia dos condrócitos no centro deste precursor cartilagem. condrócitos hipertróficos expressar fortemente colágeno X tipo e metaloproteinases da matriz-13 (MMP13) e sua ampliação considerável volume na direção do crescimento longitudinal fornece a maior contribuição para o crescimento ósseo em mamíferos 7,8. Além disso, condrócitos hipertróficos mineralizar sua ECM envolvente através da liberação de vesículas da matriz, estruturas de membrana delimitada especializada para a produção de fosfato de cálcio amorfo através da sua inclusão das fosfatases (tecido não-específico de fosfatase alcalina (TNAP) e PHOSPHO1) e proteínas de cálcio canalização (Anexinas ) 9-11. Esta cartilagem calcificada é invadido por vasos sanguíneos a partir da medula subjacente resultando no recrutamento de osteoclastos e reabsorção da matriz. Isto é seguido pela migração de osteoblastos e de alinhamento para a superfície dos restos de cartilagem calcificada onde eles estabelecem uma camada de osteóide que é rapidamente mineralizado. O tecido ósseo da esponjosa primária é posteriormente remodelado para osso lamelar da esponjosa secundária 12. fusão resulta na epifisárioscessação de ossificação endocondral 13. Ossificação endocondral está sob regulação apertada por muitos hormônios endócrinos e parácrinos e fatores de crescimento, de modo a prevenir o desenvolvimento perturbado e / ou crescimento ósseo longitudinal 14. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e celulares que sustentam esses processos é, portanto, imperativo em nossa busca de avanços clínicos no sentido de benefício humano. Pesquisas anteriores sobre as semelhanças e diferenças entre placas de crescimento de diferentes idades, locais e espécies têm melhorado bastante a nossa compreensão dos mecanismos fisiológicos que cercam a dinâmica da placa de crescimento 15,16. No entanto, o estudo de condrócitos isolados é difícil, tal como a remoção de condrócitos a partir de seu ambiente pode conduzir a desdiferenciação, acompanhado de perda de expressão de marcadores de chave, tais como COL2A1 17. O mouse metatarso cultura explante órgão, pioneered pelo Prof. Elisabeth Burger e colegas na Holanda, é um modelo altamente fisiológico ex vivo para estudar a ossificação endocondral e crescimento ósseo como a taxa de crescimento dos ossos na cultura que imitam visto in vivo 18. De forma única, a cultura de órgãos metatarso permite o exame de condrócitos em diferentes fases de condrogénese e mantém-célula e as interacções célula-matriz, o que proporciona condições para mais perto a situação in vivo do que as células em cultura de 19-21. Além disso, este modelo permite o exame directo do crescimento ósseo linear que não é possível em culturas de condrócitos primários. Além disso, permite a separação de factores sistémicos e locais, por conseguinte, que permitem a análise específica dos efeitos locais sobre a placa de crescimento. A cultura dos metatarsos permite a investigação de vários parâmetros. medições diárias de comprimento total e das regiões mineralizadas derudimentos pode ser realizada com microscopia de contraste de fase normal e software de análise de imagem. Histológica, hibridação in situ e a coloração imuno-histológica pode ser prontamente realizada em secções do metatarso, o que permite a resolução espacial de ambas as entidades moleculares e celulares, uma vantagem importante sobre os métodos tradicionais de cultura de células. A imuno-histoquímica abordagem inclui a detecção e quantificação de 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina absorção (BrdU) a proliferar por condrócitos 22. Adicionalmente, o tratamento posterior dos tecidos metatarsos podem ser realizados para permitir a análise a jusante da expressão de ARNm (RT-qPCR), proteína e análise intracelular de sinalização (Western blotting), ou composição lipídica (espectrometria de massa). A maioria dos estudos até agora usar metatarsos embrionárias cultivadas em vez de metatarsos dos animais pós-natais. Embora ambos os modelos podem ser informativo, o estudo dos ossos embrionárias tem várias vantagens: eles crescem mais rapidamente e pode ser exploITED para estudar a iniciação e progressão do processo de mineralização 23-25. Este protocolo descreve em detalhes a dissecção intrincada de metatarsos embrionárias a partir do membro posterior do dia embrionário 15 (E15) embriões de ratinho. Além disso, o crescimento e mineralização dos metatarsos anatomicamente distintas é mostrada.

<table><tbody><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoclave esterilizar antes do uso</td></tr><tr><td>Pinça Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoclave esterilizar antes do uso</td></tr><tr><td>Pinça Dumont #4</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>Autoclave esterilizar antes</td></tr><tr><td>do uso Tesoura SuperFine Vannas</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td>501778</tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Diluir a 70% v/v em dH2O</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM sem nucleosídeos</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>22561021</tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa (0,22 &mu; m) 33 mm de diâmetro</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de fosfocolina sal de cálcio tetrahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Adicionar diretamente ao meio antes da experimentação</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico-2-fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Maquiagem estoque a 5mg / ml e alíquota a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>Make up stock soution a 150mM e alíquota a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato sal dissódico hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td>Make up stock soution em 1mM e alíquota em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15710049</tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15290018</tr><tr><td>Placas de 24 poços tratadas com cultura de células Nunc</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>142475</tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura de murino embrionárias metatarsos: um modelo fisiológico de endocondral ossificação

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

O processo fundamental de ossificação endocondral está sob regulação rígida no indivíduo saudável, de modo a evitar o desenvolvimento perturbado e/ou o crescimento ósseo longitudinal. Como tal, é imperativo que aprofundemos nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes envolvidos em tais distúrbios, de modo a fornecer avanços para o benefício do paciente humano e animal. A cultura de explante de órgãos metatarsais de camundongos é um modelo ex vivo altamente fisiológico para estudar a ossificação endocondral e o crescimento ósseo, pois a taxa de crescimento dos ossos em cultura imita a observada in vivo. Excepcionalmente, a cultura de órgãos metatarsais permite o exame de condrócitos em diferentes fases da condrogênese e mantém as interações célula-célula e célula-matriz, proporcionando condições mais próximas da situação in vivo do que as células em monocamada ou cultura 3D. Este protocolo descreve em detalhes a intrincada dissecção de metatarsos embrionários do membro posterior de embriões murinos E15 e as análises subsequentes que podem ser realizadas para examinar a ossificação endocondral e o crescimento ósseo longitudinal.

O objectivo deste método foi isolar metatarsos e cultura los embrionárias para exame do crescimento longitudinal do osso e ECM mineralização. Utilizando o nosso protocolo aqui descrito, ossos metatarsos embrionários foram dissecados com sucesso, como visualizado por microscopia de luz. As medições de ossos metatarsos, realizados como indicado na Figura 1, demonstrou a sua capacidade para crescer em comprimento longitudinal e mineralizar sua ECM (Figuras 2 e 3). Mineralização da matriz é referido pela primeira vez em meados da diáfise do rudimento óssea e é facilmente observado por microscopia de luz. Nenhuma coloração é necessária, embora a absorção de calceína pode oferecer visualização melhorada do mineral recém-formado. Estudos utilizando metatarsos embrionárias até à data 22,27,28 reuniram a dissecados 2º, 3º e 4º (CENtrais três) metatarsos, assumindo o crescimento in vitro e mineralização de ser comparáveis. In vivo do desenvolvimento de metatarsos murino, no entanto, revela que os 3º e 4º dígitos ter provas de mineralização antes de todas as outras metatarsos e falanges 29. Avaliação do potencial de crescimento e mineralização dos individualmente isoladas e cultivadas E15 2º, 3º e 4º metatarsos não revelou diferenças significativas na aparência ou a extensão da mineralização após 7 dias de cultura (Figura 2). Nenhuma diferença na percentagem de aumento da linha de base foi encontrado durante o período de cultura. Como há diferenças no potencial de mineralização foi observado o protocolo padrão de congregar as 2ª 3ª e 4ª metatarsos parece válida para estudos futuros. Tradicionalmente, os investigadores acrescentaram βGP aos meios de comunicaçãousado para cultura metatarsos embrionárias para promover ECM mineralização. No entanto, em estudos de cultura de células, demonstrou-se que se TNAP enzima é adicionada aos meios de comunicação osteogénicos contendo βGP, a deposição mineral de hidroxiapatite ectópica ainda ocorre mesmo na ausência de células 30. Para examinar os efeitos de vários substratos de mineralização e agonistas da capacidade do metatarso mineralização, foi realizada cultura metatarsos E15 em meios de cultura contendo uma variedade de suplementos, e as imagens e medições de comprimento foram registados diariamente. Os resultados indicaram que E15 ossos metatarsos ainda crescer e mineralizar sua ECM na ausência de βGP. E15 ossos metatarsos cultivadas em ácido ascórbico meios que apenas apresentaram aumentos comparáveis de comprimento e mineralização como metatarsos cultivadas na presença de βGP (Figura 3). Também mostrámos que lentivírus podem ser utilizados para transfectar ADN exógeno em metata cultivadasrsals. Aqui nós transfectadas com sucesso ossos metatarsos no dia 0 de cultura (isto é, dia da dissecção) com 2 x 10 6 de proteína fluorescente (GFP) partículas de vírus por verdes metatarso. Para permitir que a transdução de vírus, polibreno foi adicionada simultaneamente às culturas a 1: 500. As culturas foram deixados durante 7 dias, sem mudanças de meio, conforme necessário para E15 metatarso mineralização de ocorrer, antes de serem incubados com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) mancha durante 5 min e, em seguida, directamente visualizadas utilizando um microscópio confocal ( A Figura 4). A nossa prova de conceito experiências mostram claramente a transdução eficaz. No entanto, seria prudente examinar as secções ao longo da totalidade do metatarso para avaliar a sua transfecção e eficaz manipulação genética. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> Figura 1: Metodologia padrão utilizada para medir tele Comprimento e Mineralização Zone of embrionárias Metatarsos. (A) Total de medição do comprimento dos metatarsos E15 no dia 0 da cultura (dia de dissecção), tomada através do centro do metatarso. (B) Medidas de comprimento longitudinal total de um metatarso após sete dias em cultura. Note-se a ligeira curvatura no metatarso. (C) A medição do comprimento da zona de mineralização após sete dias de cultura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> Figura 2: Crescimento e Mineralização Capacidade de Anatomicamente Distintas E15 Metatarsos de imagem e medição do 2º, 3º e 4º metatarsos do membro posterior de ratos E15 w.como foi executado. (A) imagens em série do 2º, 3º e 4º metatarsos durante todo o período de cultura. (B) Aumento percentual do comprimento a partir do dia 0 em cada dia de cultura. (C) comprimento Mineral do 2º, 3º e 4º metatarsos durante o período de cultura, expressa em percentagem do comprimento total metatarso. Dados em são representados como média ± erro padrão da média (SEM), (n = 6). (D) C57BL / 6J comprimentos metatarso em cada dia de cultura. Dados em são representados como média ± desvio padrão (n = 6). Preto bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> Figura 3: Crescimento e mineralização Capacidade do tipo selvagemE15 Metatarsos cultivadas em vários meios de comunicação Osteogénica. (A) imagens seriadas de metatarsos cultivadas em apenas ácido ascórbico, βGP 1 mM, fosfocolina 3 mM, cloreto de cálcio 1,5 mM ou cloreto de cálcio 3 mM contendo mídia. (B) Aumento percentual em comprimento desde o dia 0 de metatarsos cultivadas com os vários suplementos. (C) de comprimento mineral de metatarsos cultivadas em vários meios, expressa em percentagem do comprimento total do metatarso. Os dados são representados como média ± erro padrão da média (SEM), (n = 6). Preto bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> Figura 4: Transfecção de E15 Metatarsos com vírus GFP Partigos. ossos metatarsos (A) E15 foram transfectadas com partículas de vírus GFP para prova de conceito. (B) Os ossos foram coradas com DAPI para visualização DNA. (C) as imagens duplas indicada a transfecção bem sucedida de vírus GFP em toda a totalidade dos ossos metatarsos. As barras brancas = 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um protocolo para dissecar e cultivar ossos metatarsais murinos embrionários do dia 15 (E15). Este modelo ex vivo altamente fisiológico de ossificação endocondral fornece condições mais próximas da situação in vivo do que as células em monocamada ou cultura 3D e é uma ferramenta vital para investigar o crescimento e desenvolvimento ósseo.

Cultura de murino embrionárias Metatarsos: Um modelo fisiológico de Endocondral ossificação

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

O objetivo geral deste procedimento é dissecar e cultivar metatarsos de camundongos embrionários para fornecer um modelo ex vivo que permita o estudo do crescimento ósseo endocondral e da mineralização. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a ossificação endocondral, o processo pelo qual os ossos longos crescem. Em particular, é especialmente adequado para investigar os mecanismos de início da mineralização esquelética.A principal vantagem desta técnica é que ela fornece, por meio da manutenção das interações célula a célula e célula à matriz, um modelo mais fisiológico de ossificação endocondral em comparação com células em cultivo 2D ou 3D. Para começar, prepare o meio de dissecação diluindo o meio mínimo essencial alfa na proporção de um para 13 em PBS. Em seguida, reconstitua a BSA a dois miligramas por mililitro e, depois, filtre esterilizando por meio de um filtro de seringa.Em seguida, prepare o meio de cultura e filtre-o esterilizando-o com o mesmo tipo de filtro de seringa utilizado para a BSA. Após filtrar o meio de cultura, adicione 300 microlitros do meio de cultura em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços. Em seguida, coloque a placa de cultura celular de 24 poços e o meio de dissecação em uma incubadora por pelo menos uma hora para equilibrar.Em seguida, imergir o equipamento de dissecação autoclavado em etanol 70%. Obtenha embriões C57 black 6J selvagens E15 conforme descrito no protocolo de texto complementar e coloque-os em uma placa de Petri contendo meio de dissecação. Após decapitação, lave a pele com etanol 70% e use tesoura microcirúrgica de Vannas para remover os membros posteriores dos embriões mediante incisão ao redor do fêmur proximal.Isso garante que o maior possível da pata traseira seja removido. Coloque as patas traseiras em uma placa de Petri e imerja-as no meio de dissecação antes da dissecação do metatarso. Em seguida, coloque-as sob um microscópio estereoscópico.Use uma pin&ccedil;a n&uacute;mero quatro para segurar o membro firmemente enquanto utiliza uma pin&ccedil;a n&uacute;mero cinco para remover a pele ao redor do p&eacute; embrion&aacute;rio. Isso &eacute; mais eficazmente realizado segurando a pele aproximadamente no n&iacute;vel da t&iacute;bia e puxando em dire&ccedil;&atilde;o &agrave;s falanges. Em seguida, use a pin&ccedil;a n&uacute;mero quatro para segurar cuidadosamente os t&aacute;rsos do p&eacute; embrion&aacute;rio enquanto utiliza a pin&ccedil;a n&uacute;mero cinco para remover e descartar o primeiro e o quinto metatarsos.Com o pé mantido na mesma posição, use a pinça número cinco para romper os tecidos conjuntivos entre as três falanges remanescentes e os metatarsos. Em seguida, insira a ponta da pinça número cinco na articulação entre as falanges e os metatarsos para remover as falanges dos metatarsos. Por fim, use a pinça número cinco para romper os tecidos conjuntivos entre os tarsos e os metatarsos.Novamente, posicione a ponta da pinça número cinco no espaço articular entre os tarsos e os metatarsos e libere suavemente os metatarsos dos tarsos. Em seguida, pegue delicadamente os metatarsos agora soltos com a pinça número quatro e coloque-os em meio de dissecação fresco. É fundamental que os metatarsos embrionários não sejam danificados nem sequem durante os passos de dissecação e manipulação.Danos nos metatarsos afetam seu crescimento e mineralização. Quaisquer tecidos moles remanescentes se desprenderão dos metatarsos durante a cultura, portanto, não se preocupe excessivamente com sua remoção completa durante a dissecação. Quando todos os metatarsos necessários tiverem sido dissecados, posicione cuidadosamente os metatarsos individualmente na placa de 24 poços pré-aquecida contendo 300 microlitros de meio de cultura.Em seguida, realize medições longitudinais iniciais utilizando um microscópio com câmera digital acoplada e software de análise de imagem. Cultive os metatarsos por até 14 dias. No entanto, não troque o meio de cultura dos metatarsos E15 antes do quinto dia de cultivo, pois isso afeta sua capacidade de mineralização.Após alguns dias em cultura, meça o comprimento da zona de mineralização central quando ela aparecer. Após alguns dias em cultura, ocorre a mineralização da matriz na região mediodiafisária do rudimento ósseo e pode ser facilmente observada por microscopia de luz. Os segundo, terceiro e quarto metatarsos são frequentemente agrupados para estudos embrionários.Após sete dias de cultivo, os metatarsos segundo, terceiro e quarto não revelaram diferenças significativas na aparência ou na extensão da mineralização, validando essa prática. Para examinar os efeitos de diversos substratos e agonistas de mineralização na capacidade de mineralização dos metatarsos, metatarsos E15 foram cultivados em meio contendo uma variedade de suplementos conforme mostrado aqui. As imagens e as medidas de comprimento foram registradas diariamente.Entre todos os substratos testados, o ácido ascórbico aumentou mais significativamente o comprimento dos minerais, com efeitos mais semelhantes aos do beta-glicerofosfato. A transfeção com lentivírus do plasmídeo GFP em metatarsos E15 resultou na expressão de GFP em todo o metatarso. Isso destaca o uso do lentivírus para transfeção bem-sucedida de metatarsos embrionários.Essa técnica também pode ser utilizada para reduzir ou superexpressar genes-alvo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que os metatarsos E15 são extremamente frágeis. A integridade do metatarso é fundamental para o sucesso do cultivo subsequente.Após a dissecção e cultura de metatarsos E15, diversas análises podem ser realizadas. Por exemplo, a expressão de mRNA e de proteínas pode ser avaliada por RTQPCR e por Western blot, respectivamente. Além disso, a imunohistoquímica pode ser utilizada para localizar proteínas dentro do metatarso.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissecar com sucesso os metatarsos dos membros posteriores de camundongos no dia embrionário 15. Este método pode ser adaptado para metatarsos no dia embrionário 17 ou 18, que são mais úteis para o estudo do crescimento ósseo.

culture-murine-embryonic-metatarsals-physiological-model-endochondral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Aqui, nós apresentamos um método para a cultura ex vivo de ossos murino longos em estágios fetal e recém-nascido, apropriados para analisar o desenvolvimento do osso e da cartilagem e o homeostase em circunstâncias controladas ao recapitulando o processo in vivo.

Cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido

Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal adulta do falange do rato para investigar a formação mamífero do blastema e a ossificação intramembranosos, analisadas pelo immunohistochemistry fluorescente e pelo tomography microcomputado in-vivo seqüencial.

Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para o estabelecimento de uma fratura diafisária no fêmur de camundongos, que é estabilizada com um fio intramedular, para estudos de consolidação da fratura.

Estabelecimento de um Modelo de Fratura Diafisária do Fêmur em Camundongos

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Este protocolo descreve um modelo de camundongo aprimorado para lesões na placa de crescimento ósseo de adolescentes. Usando camundongos transgênicos com repórteres fluorescentes de tri-linhagem para colágeno tipos I, II e X, as matrizes primárias associadas a três substratos diferentes da placa de crescimento, a colocação da lesão é guiada pela fluorescência nativa ao microscópio.

Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento

O modelo de lesão da medula óssea murina é uma ferramenta útil para estudar a osteogênese pós-natal por ossificação intramembranosa. Este protocolo cirúrgico simplificado descreve o procedimento de ablação da medula óssea para avaliação a jusante da nova formação óssea e respostas celulares após a lesão.

Metodologia aprimorada para estudar a osteogênese pós-natal via ossificação intramembranosa em um modelo de lesão da medula óssea murina

Aprenda a cultivar metatarsos embrionários de murinos para estudar ossificação endocondral e mineralização óssea. Este modelo ex vivo mantém interações celulares fisiológicas para investigar o crescimento ósseo.

Cultura de murino embrionárias Metatarsos: Um modelo fisiológico de Endocondral ossificação

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