De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

O objetivo geral deste procedimento é usar respirometria de alta resolução para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nas síndromes e doenças associadas à disfunção mitocondrial, como; sepse, diversas doenças neurológicas e distúrbios relacionados à idade. As principais vantagens desta técnica é que ela possui maior sensibilidade e capacidade de realizar experimentos de titulação de substrato em inibidores acoplados com um pequeno número de amostras biológicas, como células intactas ou permeabilizadas.

Demonstrando o procedimento estará Sandra Nansoz, uma técnica do meu laboratório. Antes de iniciar o procedimento, calibre os sensores polarográficos de oxigênio, ressuspenda as células no tampão respiratório para uma concentração de uma vez dez elevado à sexta células por mililitro e substitua o meio respiratório em uma câmara do oxígrafo por 2,1 mililitros da suspensão celular. Feche a câmara com a rolha e ajuste a barra de agitação magnética na câmara para 700 rotações por minuto.

Em seguida, registre a respiração celular por 5 a 10 minutos até que um sinal de fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Em seguida, use uma seringa para injetar dois microlitros de rotenona através da porta de injeção de titânio na câmara do oxígrafo e registre a respiração celular por mais 5 a 10 minutos. Quando um sinal de fluxo de oxigênio estável for alcançado, injete 20 microlitros de um succinato molar seguido por 10 microlitros de ADP 0,5 molar.

Em seguida, injete dois volumes de dois microlitros de digitonina de dois milimolares e registre a respiração celular por dois a cinco minutos após cada injeção, seguida pela injeção gradual de dois a quatro microlitros de digitonina de dois milimolares até que o sinal de fluxo de oxigênio atinja o nível máximo e outras injeções de digitonina não aumentem a taxa de respiração. Para avaliação da integridade da membrana externa mitocondrial, prepare uma câmara de oxígrafo, como acabamos de demonstrar, e injete dois microlitros de digitonina de oito milimolares para permeabilizar as células. Após cinco minutos, injete 20 microlitros de um succinato molar e registre a respiração celular por 5 a 10 minutos até que um sinal de fluxo de oxigênio estável seja alcançado.

Em seguida, injete 10 microlitros de ADP 0,5 molar para estimular o complexo dois e induzir um aumento no consumo de oxigênio. Quando um sinal de fluxo estável for alcançado, injete cinco microlitros de quatro milimolares citocromo c seguidos por um microlitro de quatro miligramas por mililitro de ligamicina. Para medir a respiração estimulada por ADP das células do carcinoma hepatocelular hepático, prepare uma câmara de oygraph como acabamos de demonstrar e injete dois microlitros de digitonina oito milimolares na câmara de oxigênio para permeabilizar as células por cinco minutos, seguido pela injeção de 12,5 microlitros de mallade 0,8 molar e 10 microlitros de glutamato de dois molares.

Quando um fluxo de oxigênio estável for alcançado, injete 10 microlitros de ADP 0,5 molar para aumentar o consumo de oxigênio, seguido por dois microlitros de rotenona 0,2 milimolar e 20 microlitros de succinato de um molar. Em seguida, injete dois microlitros de antimicina cinco milimolares e registre a respiração celular. Quando o sinal diminuir e se estabilizar, injetar 2,5 microlitros de escorbato 0,8 milimolar seguido da injeção imediata de 2,5 microlitros de TMPD 0,2 milimolar, registrando a respiração celular até que o sinal do fluxo de oxigênio aumente e se estabilize.

Em seguida, injete 10 microlitros de azito de sódio molar na câmara do oxigrama e registre a aspiração celular até que o sinal do fluxo de oxigênio diminua e se estabilize. Para medir o consumo de oxigênio da célula intacta, prepare uma câmara de oxigrama como acabamos de demonstrar e injete 1 microlitro de quatro miligramas por mililitro de aligimicina seguido por injeções de um e três microlitros de FCCP 0,2 milimolar. Em seguida, titule o FCCP em etapas de 0,1 a 0,3 micromolares, injetando um a três microlitros de FCCP de 0,2 a um milimolar até que o sinal do fluxo de oxigênio atinja seu nível máximo sem aumentos adicionais e, em seguida, comece a diminuir.

Em seguida, injete dois microlitros de rotenona 0,2 milimolar e dois microlitros de antimicina A de cinco milimolares e registre a respiração até que o sinal do fluxo de oxigênio diminua e se estabilize. Na ausência de digitonina, a respiração celular é muito baixa, e a respiração de células intactas e não permeabilizadas não é estimulada na presença de substrato mitocondrial e ADP. Após a adição gradual de digitonina, no entanto, a membrana plasmática celular torna-se permeabilizada e a respiração mitocondrial aumenta até a permeabilização total, momento em que o succinato e o ADP entram nas células.

A integridade da membrana externa mitocondrial pode ser comprometida, no entanto, se quantidades excessivas de digitonina forem empregadas, induzindo uma redução na respiração do complexo para o estado dependente três. O citocromo c não aumenta a respiração do complexo para o estado dependente três em células tratadas com digitonina, indicando que não há perda de citocromo c da membrana externa mitocondrial e que a integridade mitocondrial é preservada, embora o citocromo c possa aumentar a respiração de células tratadas com doses muito altas de digitonina. A adição de substratos exógenos da atividade do complexo mitocondrial pós-permeablização da digitonina induz um aumento nas frequências respiratórias máximas dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial um, dois e quatro.

A geração de níveis respiratórios reduzidos pode ser devido à contaminação das câmaras do oxígrafo com inibidores mitocondriais do experimento anterior. Na presença de aligimicina e na adição sequencial de FCCP, observa-se a frequência respiratória máxima desacoplada das células. Uma vez dominada, qualquer uma dessas técnicas pode ser feita em menos de uma hora se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar extensivamente as câmaras e rolhas do oxígrafo de lavagem após cada experimento. Após este procedimento, outros métodos, como medições do conteúdo de ATP celular, cada um apresentado em atividade cimática, níveis de substrato mitocondrial podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se as mudanças nas taxas respiratórias são devidas à falta de substratos mitocondriais ou à atividade reduzida dos cinatos de ATP. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da bionegética explorarem a função mitocondrial em áreas como doenças mitocondriais adquiridas e genéticas, estresse oxidativo, lesão de perfusão cutânea e envelhecimento em células ou fibras intactas ou permeabilizadas e mitocôndrias isoladas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como auxiliar a função das mitocôndrias em células permeabilizadas e intactas usando respirometria de alta resolução. Não se esqueça que trabalhar com antimicina a, rotenona, iozida de sódio, FCCP e aricomicina pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de luvas e jalecos de laboratório devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.