Name: Um Modelo de Lesão Medular Contusiva Baseado em Cilindrada de Tecidos em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a criar lesões medulares contusivas consistentes em camundongos adultos usando um modelo baseado em deslocamento de tecidos. Esta técnica reprodutível permite estudar mecanismos de lesão e avaliar terapias experimentais de forma confiável.

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Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562; Merit Review Award I01 BX002356 do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA; Fundação Craig H Neilsen 296749; Fundação de Investigação de Lesões Cerebrais de Indiana e Fundação de Fundação Mari Hulman George (XMX); Norton Healthcare, Louisville, KY (YPZ); Estado de Indiana ISDH 13679 (XW); E a Fundação NeuroCures.

Todos os procedimentos de tratamento cirúrgico e animal foram realizados conforme aprovado pelo Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Conselho Nacional de Pesquisa) e as Diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Indiana. 1. Preparando o animal e realizando a Laminectomia espinhal T10 <ol><li> Esterilize os instrumentos cirúrgicos e o estabilizador da espinha do metal em uma autoclave. Limpe a mesa de operação cirúrgica. Aquecer uma almofada de aquecimento a 37 ° C. Coloque a almofada de aquecimento na mesa de operação e cubra-a com cortinas cirúrgicas estéreis. Use a técnica estéril durante toda a operação. </li><li> Use ratos adultos C57 / 6J adultos com 10 semanas de idade para este estudo. Anestesiar cada animal com uma injeção intraperitoneal (ip) de uma mistura de cetamina (87,7 mg / kg) e xilazina (12,3 mg / kg). Confirme a anestesia completa, provocando nenhuma resposta a uma estimulação de nocicepção induzida por pitada da pata. </stro<html> Ng&gt; <ol><li> Administre subcutaneamente buprenorfina (0,01-0,05 mg / kg), um agente analgésico e carprofeno (5 mg / kg), um fármaco antiinflamatório não esteróide. </li></ol></li><li> Raspar o cabelo sobre a coluna toracolumbar usando uma tosquinha elétrica. Esfregue a pele com solução de betadina e 70% de toalhetes de álcool. </li><li> Aplique pomada oftálmica nas córneas para proteger os olhos da secagem durante a cirurgia. </li><li> Com um bisturi, faça uma incisão da pele da linha média de 1,5 cm na parte de trás do animal para expor as lâminas vertebrais torácicas de 9 a 11. Empurre o tecido adiposo subcutâneo rostralmente. Disseca os músculos paraspinal longe dos processos espinhosos e das lâminas, em direção às facetas laterais de cada lado. </li><li> Posicione o mouse na calha em forma de U do estabilizador ( Figura 2A E 2B ). Aperte bilateralmente os braços de aço inoxidável sob as facetas expostas da vértebra T10 (G &quot;&gt; Figura 4A) e aperte usando os parafusos de polegar anexados aos braços ( Figura 2A ). </li><li> Remova o processo espinhoso T10 e a lâmina (laminectomia) utilizando um micro-rongeur que expõe a dura-máter na cobertura da medula espinhal ( Figura 4B ). </li></ol> 2. Realizando a lesão T10 Contusion usando o Impactor LISA <ol><li> Gire o botão do regulador de pressão no tanque de nitrogênio para ajustar o nitrogênio comprimido para 20 PSI ou 138 kPa ( Figura 1A ) para este estudo. NOTA: A pressão é ajustável de 10-120 PSI. Uma pressão mais alta resultará em um impacto de maior velocidade. A ponta do dispositivo SCI com um diâmetro de 1,2 mm é projetada para ratos e a ponta com um diâmetro de 2,2 mm é projetada para ratos. Ao mudar de ratos para ratos, a ponta de diâmetro maior pode ser formada adicionando um anel à ponta de metal (id 1.2 mm / od 2.2 mm). Utilizamos a ponta de 1,2 mm nos ratos SCI sTudy. Esterilize a dica SCI antes de usar. </li><li> Ligue o computador para iniciar o software. Botão 1 ( Figura 1B ) para ativar a ponta do pêndulo em uma posição completamente estendida ( Figura 3A -1 ). NOTA: A função do botão 1 é ativar ou desativar manualmente o cilindro pneumático. </li><li> Coloque o recipiente em forma de U com o mouse no palco ( Figura 2B ). Corrigir o estágio no lugar apertando os parafusos de polegar do suporte ( Figura 2B ). </li><li> Sob a zona &quot;SET ZERO LEVEL&quot; (verde), defina o nível zero, com um sensor laser que mede a distância para a ponta do êmbolo totalmente estendido, clicando no botão &quot;INICIAR LEITURA&quot; ( Figura 3A ). A distância será mostrada no parâmetro &quot;Range&quot; nesta zona ( Figura 3A ). Clique no botão &quot;SET ZERO&quot; ( por exemplo, 8,951 mm, mostrado na Figura 3A ). </li><li> Pressione o botão 1 ( Figura 1B ) para retirar a ponta do impactor ( Figura 3B -1 , indicada por uma seta superior) e desbloqueie o parafuso de fixação 1 ( Figura 2B ). Puxe o parafuso na posição direita ( Figura 3B -1 , indicada por uma seta lateral) para afastar a ponta do caminho do raio laser e girar o parafuso 90 ° no sentido horário para bloquear o parafuso. </li><li> Mova o palco ajustando os micro-drivers frontal e lateral ( Figura 1C ) para apontar o feixe de laser para o centro da medula espinal dorsal exposta. Depois que a localização da lesão for direcionada, mude a distância do tecido clicando no botão &quot;INICIAR LEITURA&quot; sob o &quot;SET BJ LIGHT&quot;Zona EVEL (azul) ( Figura 3B e 3B-1 ). </li><li> Ajuste lentamente a distância entre o sensor e a medula espinhal através do microcircuito vertical ( Figura 1C ) para atingir o parâmetro de deslocamento desejado ( por exemplo, 0,500 mm, mostrado na caixa de parâmetros &quot;Lamentação&quot;) na zona &quot;SET NJ. LEI&quot; (Azul) ( Figura 3B ). <ol><li> Quando o deslocamento de lesão desejado for atingido, grave a distância do tecido ( por exemplo, 8,451 mm, mostrado na caixa de parâmetros &quot;Range&quot;) ( Figura 3B ). Defina o deslocamento desejado (Lesão) = distância da ponta (Zero) - distância do tecido (Faixa) ( Figura 3B ). Quando a lesão desejada ( p. Ex., Deslocamento de tecido de 0,500 mm) é alcançada ( Figura 3B ), clique no botão &quot;SET BUG&quot; na seção &quot;SET NJ PRIORITY&quot; paraDefinir a lesão. </li></ol></li><li> Gire o Parafuso 1 90 ° no sentido anti-horário para destravar o parafuso, empurre a ponta de impacto de volta para a trajetória do raio laser ( Figura 3C -1 , direção indicada por uma seta) e bloqueie o Parafuso 1 girando 90 ° no sentido horário. </li><li> Clique no botão Executar sob a zona vermelha &quot;RUN EXPERIMENT&quot; ( Figura 3C ) para executar o impacto. As caixas de parâmetros dentro desta zona mostrarão o (s) tempo (s) de lesão, a força (mV), a velocidade (m / s) e o deslocamento da lesão (mm) ( Figura 3C ). </li><li> Depois de todos os dados de lesões serem gravados e salvos, remova a calha em forma de U com o mouse do palco. Confirme visualmente a lesão da medula espinhal sob o microscópio cirúrgico ( Figura 4C ). </li><li> Suturar os músculos paravertebrais, fáscia superficial e pele com sutura contínua com seda 3-0 (Henry Schein, 776-SK). </li><li> Inject thE animal com 1 mL de solução salina a 0,9% subcutânea para hidratação e colocá-lo em uma almofada controlada por temperatura até que a consciência completa tenha sido recuperada. Coloque o mouse em uma gaiola com comida e água acessíveis. </li><li> Para cuidados pós-operatórios, expresse manualmente a bexiga até retornar espontaneamente a veia da bexiga. Para analgesia, injete Buprenorfina (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 8-12 h / dia durante 2 dias. Se ocorrer infecção da bexiga urinária, injete Baytril (SQ, 5-10 mg / kg em 0,1 mL, 1 dose diariamente) durante 7-10 dias. Se ocorrer uma infecção regional / sistémica, injete Gentamicina (SQ, 5-8 mg / kg, diluída em 1 ml de solução salina estéril, a cada 8-12 h) durante 4 dias. </li><li> Remova os fios da sutura em 14 dias pós-SCI. </li><li> No dia 42 do pós-lesão, os camundongos serão sacrificados pela perfusão. Após a anestesia adequada como 1,2, serão perfundidos com 30 ml (0,01 M) de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 30 ml de paraformaldeído a 4% em PBS 0,01 M. Um centímetro da medula espinhal incluindo a lesão épicaEnter será coletado e processado para análise de seção e histológica. </li></ol>

<ol><li>Young, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+contusion+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spinal cord contusion models.</a> Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).</li>
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</ol>

Christopher B. Shields, MD possui a propriedade do Louisville Injury System Apparatus (LISA) produzido pelo Louisville Impactor System, LLC.

Em 1911, Allen descreveu o primeiro modelo de queda de peso usando um peso fixo para induzir feridas nas cordas espinhais expostas dos cães 12 . Modelos de queda de peso similares foram desenvolvidos com base no modelo Allen, incluindo o pêndulo 3 , 6 , 13 , 14 da NYU / MASCIS. Além do modelo de queda de peso, outros dispositivos SCI foram criados. O modelo OSU / ESCID 5 , 7 usa um mecanismo de deslocamento de tecido para controlar a gravidade da lesão, e o modelo IH, 4 , 8 usa a força para criar um SCI graduável. Nestes sistemas, a estabilização vertebral é obtida através do aperto dos processos espinhosos rostral e caudal ao local da lesão. Esses dispositivos utilizam baixas velocidades de lesão, especificamente 0,33 a 0,9 m / s (NYU / MASCIS), 0,148 m / s (OSU / ESCID),E 0,13 m / s (IH). Estabilizar os processos espinhosos rostral e caudal pode causar flexibilidade da coluna vertebral e movimento da coluna durante o impacto, o que pode afetar a precisão da lesão. O método LISA tenta superar as deficiências dos modelos existentes, particularmente em relação à instabilidade da coluna vertebral e baixa velocidade de lesão. Este método usa estabilização de faceta bilateral e evita artefatos de movimento associados à lesão. Este dispositivo utiliza uma velocidade de alto impacto que pode ser ajustada entre 0,5-2 m / s 11 , 15 . O sensor laser é mais avançado que o Vibrador Ling usado no modelo ESCID e mede com precisão a distância da superfície da medula espinhal sem necessidade de contato com os tecidos. O modelo foi originalmente desenvolvido para produzir um SCI de rato, e agora foi adaptado para produzir SCI em camundongos e em primatas não humanos 16 , com modificações. Espinha dA abilização reduz a variabilidade em todos os métodos de SCI experimentais, particularmente em modelos de deslocamento de tecido. O sensor de distância laser determina a magnitude do deslocamento do tecido da medula espinhal durante os movimentos respiratórios. É importante que o ponto da medula espinhal em que o laser esteja focado seja o ponto idêntico atingido pelo pêndulo. Este passo é realizado durante o passo de calibração ( Figura 3 ), quando a ponta do impactor e o raio laser estão alinhados. Uma fraqueza potencial deste modelo é que a magnitude do deslocamento do tecido é medida a partir da superfície dural. Embora a espessura da duraçao constitua uma diferença insignificante entre animais, pode haver variabilidade significativa no espaço subaracnóideo preenchido com líquido cefalorraquidiano (LCR). A variabilidade nos resultados de lesões pode ocorrer ao produzir uma lesão de contusão muito leve usando um pequeno deslocamento de tecido. Em geral, a consistência da lesão é principalmente dependenteSobre a precisão do deslocamento do tecido e também sobre a velocidade e o tempo de contato do tecido do êmbolo. A amplitude de deslocamento do tecido é ampla (precisão: 0-10 ± 0,005 mm). Com base em dados piloto anteriores e informações publicadas em roedores e primatas não humanos, um deslocamento de 20% do diâmetro ântero-posterior do SC produz um SCI suave, um deslocamento de 30-40% produz um SCI moderado e um deslocamento&gt; 50% Produz SCI severo a uma velocidade de 1 m / s. Haverá pequenas diferenças dependendo das espécies animais. O tempo de permanência é ajustável de 0 a 5 s usando um relé de tempo. Em nosso estudo, o tempo de permanência foi fixado em 300 ms. Isso pode ser facilmente ajustado para replicar os tempos de permanência de outros dispositivos SCI, incluindo os modelos NYU e IH. Em resumo, desenvolvemos um modelo baseado em deslocamento de SCI contusiva em camundongos adultos. O modelo usa um estabilizador em forma de U para estabilizar as facetas da coluna vertebral bilateral, evitando o cordãoArtefatos de movimento associados à medição guiada por laser da superfície do cabo. Este modelo pode produzir lesões de corda de alta velocidade de 0,5-2 m / s. O sensor laser é mais preciso do que o método convencional para determinar a velocidade e a distância da superfície de impacto. O modelo pode produzir lesões na medula espinhal em todos os níveis, de leve a grave. Quando modificado, este dispositivo também pode produzir lesões em ratos e animais grandes, como primatas não humanos.

A lesão da medula espinhal (SCI) mais comum ocorrendo em humanos é uma SCI 1 contundente. Para investigar os mecanismos de lesão e as várias estratégias terapêuticas que seguem a SCI, é necessário um modelo SCI contusivo preciso, consistente e reprodutível em roedores. Muitos modelos de lesões contusivas da medula espinhal com vários mecanismos de produção de lesões foram utilizados na pesquisa experimental SCI 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Três modelos SCI contusivos - especificamente, o pêndulo 3 , 6 , o pórtico / dispositivo eletromagnético SCI (ESCID) da Universidade de Estado de Ohio (OSU), o economista de Nova Iorque (NYU) / Multicenter Animal Spyder Medical Injury Studies (MASCIS) 7 , umD o Impacto Infinite Horizon (IH) 4 , 8 - são amplamente aceitos no campo de pesquisa SCI. O pêndulo NYU / MASCIS ou um equivalente produz ferimento deixando um peso fixo de diferentes alturas para a medula espinhal alvo para criar múltiplas severidades de lesões 3 , 6 . O OSU / ESCID causa lesão ao induzir o deslocamento do tecido 5 , 7 . O pêndulo IH produz lesões aplicando diferentes forças na medula espinhal 4 , 8 . Cada impactor usa uma velocidade diferente, que é um parâmetro importante que influencia os resultados de lesões. O aparelho NYU / MASCIS gera velocidades variando de 0,33-0,9 m / s. O dispositivo IH possui uma velocidade máxima de 0,13 m / s 4 . O pêndulo OSU / ESCID tem uma velocidade fixa de 0,148 m / s 5 . Notavelmente, as velocidades doSe modelos são inferiores aos observados em velocidades clínicas, que normalmente excedem 1,0 m / s 9 . Aqui, apresentamos um novo dispositivo SCI contundente baseado em deslocamento, denominado Aparelho do Sistema de Lesões de Louisville (LISA), para produzir SCI em camundongos com alta velocidade de impacto 10 . Este sistema inclui um estabilizador vertebral, que estabiliza firmemente a vértebra no local da lesão, permitindo a produção de uma SCI constante e reprodutível. O sensor laser do dispositivo garante a determinação precisa do deslocamento do tecido e a gravidade resultante do SCI. A velocidade do êmbolo no ponto de contato com a medula espinhal pode ser ajustada de 0,5 a 2 m / s. Estes parâmetros de lesão replica de perto a SCI traumática vista clinicamente.

<table><tbody><tr><td>Cetamina (7,2 mg / mL) / Xilazina (0,475 mg / mL) / Acepromazina</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-890-8598 / 07-869-7632 / 07-808-1947</td><td>Agente anestésico</td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,03 mg / mL)</td> <td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-9756</td><td>Agente de alívio da dor</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td><td>agente antibiótico</td></tr><tr><td>Purdue Products Betadine Surgerical Scrub</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>para esterilizar a pele</td></tr><tr><td>Esponjas de Gaze Dukal</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>para esterilizar a pele</td></tr><tr><td>Decon Etanol 200 Prova</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>para esterilizar a pele</td></tr><tr><td>1 mL NORM-JECT</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>D-78532</td><td>para anestesia/alívio da dor/injeção de agente antibiótico</td></tr><tr><td>10 mL Seringa</td><td>TERUMO</td><td>REF SS-10L</td><td>para injeção salina</td></tr><tr><td>Lágrimas artificiais pomada para os olhos</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-870-5261</td><td>olhos provent de pomada</td></tr><tr><td>antiobiótica</td> seca <td>Webster Veterinary</td><td>07-877-0876</td><td>cirurgia provent cortada de infecção</td></tr><tr><td>Aplicadores com ponta de algodão</td><td>Fisher Scientific</td><td>1006015</td><td>parar o sangramento</td></tr><tr><td>Instrumento Esterilizador</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>18000-50</td><td>para esterilização de ferramenta cirúrgica</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>agarrar tecido</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>corte de pele</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi # 15</td><td>Fisher Scientific</td><td>10015-00</td><td>corte de pele</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td>parar de sangrar</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>laminectomia</td></tr><tr><td>Agricola Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td>mantenha a visão da cirurgia aberta</td></tr><tr><td>Tesoura fina Fine</td><td>Science Tools</td><td>14040-10</td><td>para músculo separado da coluna</td></tr><tr><td>Suturas estéreis</td><td>Fine Science Tools</td><td>12051-10</td><td>fechamento da pele</td></tr><tr><td>Estabilizador vertebral de camundongo</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N / A</td><td>Estabilizar e expor a vértebra</td></tr><tr><td>LISA</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N/A</td><td>Produzir uma lesão experimental de contusão da medula espinhal em camundongos</td></tr></tbody></table>

um modelo de lesão medular contusiva baseado em cilindrada de tecidos em ratos

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

A produção de uma lesão contusiva consistente e reprodutível da medula espinhal (SCI) é fundamental para minimizar as variações comportamentais e histológicas entre animais experimentais. Vários modelos SCI contusivos foram desenvolvidos para produzir lesões usando diferentes mecanismos. A gravidade do SCI é baseada na altura que um determinado peso cai, a força de lesão ou o deslocamento da medula espinhal. No presente estudo, apresentamos um novo dispositivo SCI contundente para o mouse, o pêndulo do Aparelho do Sistema de Lesões de Louisville (LISA), que pode criar uma SCI com base em deslocamento com alta velocidade de lesão e precisão. Este sistema utiliza sensores de distância laser combinados com software avançado para produzir lesões graduadas e altamente reprodutíveis. Realizamos um SCI contusivo no 10º nível vertebral torácico (T10) em camundongos para demonstrar o procedimento passo a passo. O modelo também pode ser aplicado nos níveis cervical e lombar da coluna vertebral.

Este dispositivo consiste em cinco componentes principais: (1) um corpo com uma ponta do impactor ( Figura 1C ), (2) um computador com software ( Figura 1B ), (3) uma caixa de controle elétrico ( Figura 1B ), (4) a Estabilizador vertebral ( Figura 2A ) e (5) ar comprimido para o sistema de controle pneumático ( Figura 1A ). Para induzir o deslocamento preciso do tecido, o sistema depende de um sensor laser para medir a distância entre a ponta do êmbolo totalmente estendida e a superfície dorsal da medula espinhal direcionada. O software leva em conta a espessura de 4 mm da ponta devido ao fato de o raio laser atingir a superfície refletiva do pêndulo ( Figura 2B e Figura 3A -1 ). Existem duas posições nas quais a ponta do êmbolo pode ser colocada: (1) iN o caminho do raio laser ( Figura 3A -1 ) ou (2) em uma posição lateral longe do raio laser ( Figura 3B -1 ). Quando o êmbolo está no caminho do raio laser ( Figura 3A -1 ), mede a distância da ponta do impactor e monitora a velocidade da ponta do impactador durante o movimento entre a extensão e a retração. Quando o êmbolo está na posição lateral longe do caminho do raio laser ( Figura 3B -1 ), a distância entre o laser e a medula espinal é medida. A estabilização da vértebra T10 usando nosso estabilizador vertebral é um componente integral do procedimento ( Figura 2A ) 10 , 11 . Medições de distância confiáveis ​​usando o sensor laser dependem da sCapacidade do alvo, que pode ser distorcida se o movimento estiver presente. Para determinar a precisão e consistência deste sistema, 8 camundongos foram submetidos a lesões de deslocamento de 0,5 mm. Estes animais mostraram uma variabilidade de deslocamento de ± 0,001 mm (± DP), indicando que o sistema é altamente preciso e reprodutível. A Figura 4 demonstra a vértebra alvo imobilizada no estabilizador ( Figura 4A ) e a medula espinal T10 exposta antes ( Figura 4B ) e após a contusão ( Figura 4C ) sob um microscópio cirúrgico. A pressão do ar comprimido controla a velocidade do pêndulo no momento da lesão. Nossos dados demonstram que a velocidade do impacto é de 0,81 ± 0,0345 m / s (média ± DP) a uma pressão de 138 kPa. O botão ( Figura 1B ) nos controles da caixa elétricaA duração do contato da ponta-cabo (tempo de permanência) após a lesão e pode ser ajustada entre 0 e 5,000 ms. O tempo de permanência do cabo da ponta na maioria dos experimentos é ajustado em 0,32 ± 0,0147 s (média ± DP) ( Figura 5 ). Utilizando este dispositivo, podem ser produzidas lesões contusivas dependentes da gravidade com deslocamentos de tecido de 0 mm (controle simulado), 0,2 mm (lesão leve), 0,5 mm (lesão moderada) e 0,8 mm (lesão grave) em camundongos adultos ( Figura 6 ). <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig1.jpg"> Figura 1: O Aparelho do Sistema de Lesões de Louisville (LISA). ( A ) O sistema consiste em um pêndel, um sistema de controle e uma fonte de ar comprimido. ( B ) O sistema de controle inclui uma caixa de controle e um computador laptop. O software e os botões de controle da caixa de controle permitem que o usuário estabeleçaParâmetros de lesões. ( C ) O sensor laser é o componente-chave do dispositivo e mede a posição do alvo de lesão, a distância da medula espinhal ao sensor e a velocidade de lesão. O rápido movimento para baixo e para cima da ponta de impacto é alimentado por ar comprimido. A localização da lesão e a gravidade do deslocamento do tecido são ajustadas por microdrivers, que controlam o movimento em três dimensões. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig2.jpg"> Figura 2: O estabilizador e o suporte do mouse. ( A ) O estabilizador da coluna consiste em uma calha em forma de U e dois braços metálicos para manter a vértebra do mouse. ( B ) O estabilizador é montado no dispositivo do impactor. TA linha vermelha indica o caminho do raio laser. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig3.jpg"> Figura 3: Método para produzir uma SCI contundente. ( A - C ) O software da Interface Gráfica do Usuário (GUI) com três parâmetros / zonas de lesão são mostrados. ( A , A-1 ) A zona verde (SET ZERO LEVEL) calibra a distância da ponta do êmbolo. A linha vermelha indica o caminho do feixe de laser. ( B , B-1 ) A zona azul é usada para ajustar o nível de lesão (SET NJ. LEÃO). O pêndulo é levantado e movido lateralmente para o lado direito para permitir que o raio laser atinja a superfície dorsal da medula espinhal para ajustar o nível zero. A linha vermelha indica o laser b Eam caminho. ( C , C-1 ) Antes do impacto, a ponta é movida de volta para o caminho do raio laser para executar a lesão (RUN). Os parâmetros de lesão estão sob a zona vermelha (RUN EXPERIMENT). A linha vermelha indica o caminho do feixe de laser. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig4.jpg"> Figura 4: exposição e avaliação de lesões. ( A ) Os braços metálicos do estabilizador da coluna estabilizam a vértebra T10. ( B ) laminectomia T10 para expor a medula espinhal, com os vasos dorsais claramente vistos. ( C ) A contusão induzida pelo impacto (flecha) na superfície dorsal da medula espinal confirma a lesão. Barra de escala = 2 mm.G4large.jpg "target =" _ blank "&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig5.jpg"> Figura 5: Parâmetros de lesão. Os parâmetros consistentes de lesão incluem deslocamento de tecido (mm), velocidade de lesão (m / s) e tempo (s) de espera da ponta. N = 8, média ± DP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig6.jpg"> Figura 6: Avaliação histológica. As secções transversais representativas das cordas espinhais, coradas com Cresyl Violet e Eosin, mostram lesões dependentes da gravidade e deslocamento após ( A ) farsa (0 mm), ( B ) leve (0,2 mm), ( C D ) graves (0,8 mm) contusivos SCIs em T10 usando o dispositivo LISA. As imagens foram tiradas no epicentro das lesões. Barra de escala = 500 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um modelo de lesão medular contundente baseado em deslocamento de tecido que pode produzir uma lesão contundente consistente da medula espinhal em camundongos adultos.

Um Modelo de Lesão Medular Contusiva Baseado em Cilindrada de Tecidos em Ratos

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

O objetivo geral deste vídeo é apresentar um novo modelo de lesão medular contusiva baseado em deslocamento de tecido, que pode produzir uma lesão medular contusiva consistente em camundongos adultos. Este modelo de contusão pode ajudar a responder a questões-chave no campo experimental da lesão medular. A principal vantagem desta técnica é que ela produz lesões medulares muito consistentes.As implicações desta técnica se estenderam para a terapia da lesão medular porque este modelo fornece ferramentas confiáveis e reprodutíveis para estudar os mecanismos de lesão e os efeitos das terapias experimentais. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque não estão familiarizados com o novo impactor. A demonstração visual desse método é crítica, pois várias etapas são difíceis de aprender devido às operações manuais e de software.Comece trazendo os instrumentos cirúrgicos de autoclave e o estabilizador de coluna de metal para a mesa cirúrgica limpa. Aqueça uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius. Em seguida, coloque a almofada de aquecimento na mesa de operação e cubra com campos cirúrgicos estéreis.Camundongos fêmeas C57BL6J de 10 semanas de idade são usados para este estudo. Após a administração de uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina, verifique se há um nível adequado de anestesia pela ausência de qualquer resposta à estimulação da nocicepção induzida pela pinça da pata. Administre buprenorfina, um agente analgésico e carprofeno, um anti-inflamatório não esteróide por via subcutânea.Use uma tesoura elétrica para raspar o cabelo sobre a coluna toracolombar. Esfregue a pele com solução de betadine e lenços umedecidos com álcool 70%. Aplique pomada oftálmica nas córneas, para proteger os olhos do ressecamento.Depois de fazer uma incisão na pele da linha média de 1,5 centímetro nas costas do animal sobre a nona à 11ª lâmina vertebral torácica, empurre o tecido adiposo subcutâneo rostalmente. Usando tesouras finas, pinças finas e um afastador agrícola, disseque os músculos paraespinhais longe dos processos espinhosos e lâminas em direção aos fascets laterais de cada lado. Posicione o mouse no recipiente em forma de U do estabilizador, prenda os braços de aço inoxidável sob as facetas expostas da vértebra t10 bilateralmente e aperte os braços com os parafusos de aperto manual presos a eles.Use um micro rongeur para remover o processo espinhoso t10 e a lâmina que expõe o modelo de dura-máter que cobre a medula espinhal. Coloque o recipiente em forma de U com o mouse no palco do impactor e fixe o palco no lugar apertando os parafusos de aperto manual do suporte. Para configurar o impactor, primeiro gire o botão do regulador de pressão no tanque de nitrogênio para definir o nitrogênio comprimido para 20 libras por polegada quadrada ou 138 quilopascais para o estudo.Esterilize a ponta de impacto de 1,2 mililitro com álcool 70%. Em seguida, abra o pacote de software no computador. Premir um botão da caixa de comando para activar a ponta do impactor para uma posição totalmente estendida.Na tela do computador, em definir nível zero, clique em iniciar leitura para medir a distância até a ponta do êmbolo totalmente estendida. A distância será mostrada como o parâmetro de alcance nesta zona. Em seguida, clique em definir zero e um número em mililitros aparecerá na caixa de parâmetro zero.Em seguida, pressione o botão um na caixa de controle para retirar a ponta do impactor. Em seguida, destrave o parafuso de fixação, puxe o parafuso para afastar a ponta do caminho do feixe de laser e gire o parafuso 90 graus no sentido horário para travar. Agora mova o estágio de montagem, ajustando os microdrivers frontal e lateral para apontar o feixe de laser para o centro da medula espinhal dorsal exposta.Depois que o local da lesão for direcionado, meça a distância do tecido clicando no botão iniciar leitura em definir o nível de lesão. Use o micro driver vertical para ajustar lentamente a distância entre o sensor e a medula espinhal, até que o parâmetro de deslocamento desejado seja alcançado. Isso está abaixo do nível de lesão definido, na caixa de parâmetro de lesão.Quando o deslocamento desejado da lesão for atingido, registre a distância do tecido mostrada na caixa de parâmetros de intervalo e, em seguida, defina o deslocamento ou lesão desejada subtraindo a distância ou intervalo do tecido da distância da ponta em zero. Em seguida, clique em definir lesão em definir nível de lesão. Em seguida, destrave o parafuso girando-o 90 graus no sentido anti-horário.Empurre a ponta de impacto de volta para a trajetória do feixe de laser e trave o parafuso girando-o 90 graus no sentido horário, clique no botão executar em executar experimento para executar o impacto. As caixas de parâmetros mostrarão o tempo de lesão em segundos, força em microvolts, velocidade em metros por segundo e deslocamento de lesão em milímetros. Depois que todos os dados de lesão forem registrados e salvos, remova a calha em forma de U com o mouse do palco.Em seguida, confirme visualmente a lesão da medula espinhal sob um microscópio cirúrgico. Após suturar a incisão em camadas, injetar o animal com um milímetro de solução salina a 0,9% por via subcutânea para hidratação e colocá-lo em uma almofada com temperatura controlada até que a consciência seja recuperada. Em seguida, aloje o rato em uma gaiola limpa com água e comida de fácil acesso.Esses dados mostram parâmetros de lesão inconsistentes, demonstram que o pêndulo pode produzir lesões confiáveis e reprodutíveis. Esta seção transversal representativa corada com violeta-eosina de cresila, mostra a região t10 da medula espinhal após lesão simulada com deslocamento de 0 milímetro. Esta imagem mostra o epicentro de uma lesão medular contusiva leve em t10, usando o dispositivo com deslocamento de 0,2 milímetro.Essa lesão moderada foi obtida com deslocamento de 0,5 milímetro. Finalmente, esta lesão grave é resultado de um deslocamento de 0,8 milímetros. Essas imagens demonstram que esse novo impactador pode produzir lesões de contusão graduadas.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de definir zero para a ponta do impactor nos alvos da medula espinhal. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de lesão medular explorarem mecanismos e terapias em camundongos, ratos e primatas não humanos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar esse impactador para produzir lesão contusiva da medula espinhal.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Uma maneira confiável e repetível para produzir uma lesão da medula espinhal cervical unilateral utilizando o pêndulo horizonte infinito é descrito. O método leva vantagem de um quadro projetado e grampo para estabilizar a coluna. O procedimento padronizado e biomecânica lesão os parâmetros resultam em lesões suficientes e sustentados.

Um Modelo contundente de lesão da medula espinhal cervical unilateral Usando o Impactor horizonte infinito

Fonte: Elzat, E. Y. Y., et al., Estabelecendo um modelo de lesão medular por contusão em camundongos com base em uma técnica minimamente invasiva. J. Vis. Exp. (2022). Este vídeo demonstra o método para induzir uma lesão de contusão na medula espinhal no nível T9 em um modelo de camundongo, usando uma plataforma coaxial de lesão da medula espinhal. Um peso é colocado na medula espinhal de nível T9 que cria uma contusão que causa imediatamente descoloração e inchaço do tecido.

Induzindo uma contusão da medula espinhal em um modelo de camundongo usando uma plataforma coaxial de lesão da medula espinhal

Fonte: Kumar, S., et. al. Modelo de camundongo de úlceras por pressão após lesão medular. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra uma indução detalhada de lesão medular em camundongos. O camundongo anestesiado é dissecado para expor as vértebras T9-T10 e seus processos espinhosos são removidos. A medula espinhal exposta é então seccionada para infligir a lesão. A área cirúrgica é então fechada e o camundongo pode se recuperar.

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