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Fonte: Laboratório do Dr. Yuri Bolshan — Instituto de Tecnologia da Universidade de Ontário
A cromatografia em camada delgada (TLC) é um método cromatográfico usado para separar misturas de compostos não voláteis. Uma placa TLC consiste em uma fina camada de material adsorvente (a fase estacionária) fixada a um suporte sólido apropriado, como plástico, alumínio ou vidro1. A(s) amostra(s) e o(s) composto(s) de referência são dissolvidos num solvente adequado e aplicados perto do bordo inferior da placa de TLC em pequenos pontos. A placa TLC é desenvolvida imergindo a borda inferior no solvente de revelação que consiste em uma fase móvel apropriada. A ação capilar permite que a fase móvel suba pela camada adsorvente. À medida que o solvente sobe pela placa de TLC, ele carrega consigo os componentes de cada ponto e os separa com base em suas interações físicas com as fases móvel e estacionária.
1. Placas TLC
2. Manchas
3. Escolhendo um solvente revelador
4. Desenvolvimento
5. Visualização
6. Análise
A cromatografia em camada fina, ou TLC, é um método cromatográfico usado para separar misturas de compostos não voláteis, comumente usado em química orgânica.
A CPT é realizada em uma placa de vidro ou plástico. Uma linha de base é marcada na placa, juntamente com os rótulos. A mistura a ser examinada e os compostos de referência são dissolvidos num solvente adequado e aplicados perto do bordo inferior da placa de TLC em pequenos pontos. A placa é colocada em uma jarra e um solvente (a fase móvel) separa a mistura com base nas propriedades físicas de cada componente.
Apesar do fato de que as técnicas de separação mais pesadas em instrumentos têm mais poder de resolução do que o TLC, é a velocidade e o baixo custo que tornam o TLC uma técnica atraente para análises qualitativas em tempo real. Este vídeo demonstrará a preparação, operação e análise da cromatografia em camada fina.
As técnicas cromatográficas incluem uma fase estacionária e móvel. Na TLC, a fase estacionária consiste em uma fina camada de material fixada à placa. O material é uma substância polar, como o gel de sílica. A fase móvel é um líquido apolar que sobe pela camada adsorvente por ação capilar. À medida que a fase móvel sobe pela placa, ela arrasta os componentes de cada ponto, que são posteriormente separados com base na polaridade.
Compostos menos polares passarão mais tempo na fase móvel à medida que são puxados para cima da placa. Compostos mais polares são mais atraídos para a fase estacionária e, portanto, não se movem tanto para cima na placa.
A separação ocorre em um recipiente de revelação. Podem ser potes com tampas ou copos cobertos com papel alumínio. Use o menor recipiente disponível que acomodará a placa TLC para acelerar a separação.
A fase móvel, ou solvente em desenvolvimento, deve ser o mais apolar possível para uma boa separação. Aqui é mostrada uma série eluotrópica para sílica gel, uma lista de fases móveis comuns em ordem crescente de poder de extração.
Várias fases móveis podem ser testadas simultaneamente. Em uma placa limpa, localize a amostra dissolvida várias vezes, com pelo menos 2 cm de distância. Aplique fase móvel suficiente em cada ponto para formar um círculo de 1-2 cm de diâmetro.
Marque a distância que a fase móvel percorre. Se a fase móvel não for polar o suficiente, a amostra permanecerá próxima ao ponto inicial. Se a fase móvel for muito polar, toda a amostra migrará com a frente do solvente. Uma fase móvel apropriada mostrará anéis bem separados, com o anel mais externo a cerca de 50% da distância até a frente do solvente.
Se necessário, duas fases móveis miscíveis podem ser misturadas em proporções variadas para obter as propriedades desejadas. Aqui, uma mistura 1:1 de acetato de etila e hexano era muito polar, mas uma mistura 1:20 foi apropriadamente separada.
Com a fase móvel escolhida, você está pronto para começar a desenvolver a chapa.
Para iniciar o procedimento, corte uma placa TLC disponível comercialmente no tamanho desejado. Se a placa tiver um suporte de vidro, marque-a com um cortador de vidro e quebre cuidadosamente ao longo da linha.
Com um lápis, marque uma linha de base a cerca de 1 cm do fundo da placa. Marque o local onde as amostras serão vistas ao longo da linha. Certifique-se de que as manchas estejam a pelo menos 1 cm da borda e a 3 mm de distância. Rotule-os adequadamente.
As amostras sólidas devem ser dissolvidas num solvente adequado. Os solventes comuns incluem hexanos, acetato de etila ou diclorometano. Use o solvente menos polar que dissolverá a amostra.
Preparar a mistura amostra/solvente com um capilar de vidro. Toque suavemente a ponta no local desejado na placa TLC e remova-a imediatamente. É importante não perturbar a fase estacionária.
Mantenha o local o menor possível, pois isso leva a uma melhor separação. Se for necessária mais amostra, podem ser aplicados pontos sucessivamente em cada local. Deixe o solvente secar entre as aplicações. Um jato de ar pode ser usado para secar solventes menos voláteis.
A placa TLC agora está pronta para ser desenvolvida. Coloque um pedaço de papel de filtro no fundo do frasco para aumentar a pressão de vapor. Adicione a fase móvel a uma profundidade que não atinja a linha de base. Tampe o frasco quando não estiver em uso para que os vapores do solvente não escapem.
Coloque cuidadosamente a placa de TLC manchada no frasco de revelação. Certifique-se de que a fase móvel esteja abaixo da linha de base. Observe o progresso da frente do solvente - a borda dianteira da fase móvel - pois ela se moverá rapidamente para cima na placa.
Não permita que a fase móvel atinja a borda superior da placa, pois as bandas de amostra começarão a se expandir por difusão. Quando a frente do solvente se aproximar do topo, remova a placa da câmara de revelação e marque a frente do solvente com um lápis antes que o solvente seque.
Se os compostos não forem coloridos, uma lâmpada UV pode ser usada para visualizar as manchas. O composto bloqueará a fluorescência de fundo da placa. Defina a lâmpada para a configuração de ondas curtas e ilumine a placa seca. Usando um lápis, contorne todos os pontos visíveis sob a lâmpada. Usando um lápis, contorne todos os pontos visíveis sob a lâmpada.
Outra técnica de visualização possível é usar permanganato de potássio, um agente oxidante. Usando uma pinça, mergulhe a placa na mancha de permanganato.
Remova e enxugue o excesso de solução com uma toalha de papel. Em uma capela de exaustão, aqueça cuidadosamente a placa com uma pistola de ar quente para visualizar as manchas. Use um lápis para marcar os pontos que aparecerem.
Uma vez que as manchas tenham sido visualizadas, a substância de interesse pode ser comparada aos padrões, como mostrado aqui. Neste exemplo, a incógnita é 1,3-difenilpropinona, um bloco de construção na síntese orgânica. Ao comparar a banda com um padrão conhecido e cloreto de benzoíla, um dos materiais de partida, o produto pode ser identificado.
O fator de retardo, ou Rf, é usado para identificar o composto desconhecido. O Rf é a razão entre a distância que um composto percorre em uma placa TLC e a distância que a fase móvel percorre. O fator é determinado medindo a distância da linha de base até o ponto e dividindo pela distância da linha de base até a frente do solvente.
O Rf de um determinado composto depende das condições usadas no experimento, incluindo a escolha do solvente, a espessura e a atividade do adsorvente, a temperatura e o tamanho da amostra. Deve-se tomar cuidado para manter esses fatores consistentes entre os experimentos.
Existem várias aplicações da cromatografia em camada fina.
Neste exemplo, o conteúdo de triacilglicerídeos das glândulas sebáceas de morcego foi estudado. A fração de superfície lipídica foi primeiro separada por polaridade em uma placa de TLC. A banda de triacilglicerídeo foi então removida da placa com uma espátula. O pó de sílica foi transferido para um tubo de microcentrífuga com solvente. Após a centrifugação, a fase estacionária foi deixada no fundo do tubo, enquanto os compostos permaneceram dissolvidos no solvente. Os triacilgliceridos foram então separados por outra propriedade física. Nesse caso, a segunda dimensão da separação foi o tamanho molecular.
A TLC também pode ser usada para monitorar a progressão de uma reação química. Neste exemplo, o material de partida da reação foi usado como padrão e correu ao lado da solução de reação em uma placa de TLC. Este processo foi repetido em intervalos específicos ao longo da reação. À medida que a reação progredia, a banda do material de partida diminuía e a banda do produto aumentava. Quando não houve mudança nas bandas, ou todo o material de partida foi consumido, a reação foi completa.
Finalmente, as placas de TLC podem ser usadas em bioensaios. Neste exemplo, os compostos foram separados do trevo vermelho com TLC. Cada banda foi então colocada em bactérias que crescem em placas de ágar. As moléculas que mostraram crescimento bacteriano inibido foram analisadas quanto às suas propriedades antimicrobianas.
Você acabou de assistir à introdução da JoVE à cromatografia em camada fina. Agora você deve entender a teoria subjacente da separação, como escolher uma fase móvel apropriada para seu experimento e como configurar e operar uma placa TLC. Obrigado por assistir!
A cromatografia em camada fina, ou TLC, é um método cromatográfico usado para separar misturas de compostos não voláteis, comumente usado em química orgânica.
A CPT é realizada em uma placa de vidro ou plástico. Uma linha de base é marcada na placa, juntamente com os rótulos. A mistura a ser examinada e os compostos de referência são dissolvidos num solvente adequado e aplicados perto do bordo inferior da placa de TLC em pequenos pontos. O prato é colocado em uma jarra, e um solvente? (a fase móvel) separa a mistura com base nas propriedades físicas de cada componente.
Apesar do fato de que as técnicas de separação mais pesadas em instrumentos têm mais poder de resolução do que o TLC, é a velocidade e o baixo custo que tornam o TLC uma técnica atraente para análises qualitativas em tempo real. Este vídeo demonstrará a preparação, operação e análise da cromatografia em camada fina.
As técnicas cromatográficas incluem uma fase estacionária e móvel. Na TLC, a fase estacionária consiste em uma fina camada de material fixada à placa. O material é uma substância polar, como o gel de sílica. A fase móvel é um líquido apolar que sobe pela camada adsorvente por ação capilar. À medida que a fase móvel sobe pela placa, ela arrasta os componentes de cada ponto, que são posteriormente separados com base na polaridade.
Compostos menos polares passarão mais tempo na fase móvel à medida que são puxados para cima da placa. Compostos mais polares são mais atraídos para a fase estacionária e, portanto, não se movem tanto para cima na placa.
A separação ocorre em um recipiente de revelação. Podem ser potes com tampas ou copos cobertos com papel alumínio. Use o menor recipiente disponível que acomodará a placa TLC para acelerar a separação.
A fase móvel, ou solvente em desenvolvimento, deve ser o mais apolar possível para uma boa separação. Aqui é mostrada uma série eluotrópica para sílica gel, uma lista de fases móveis comuns em ordem crescente de poder de extração.
Várias fases móveis podem ser testadas simultaneamente. Em uma placa limpa, localize a amostra dissolvida várias vezes, com pelo menos 2 cm de distância. Aplique fase móvel suficiente em cada ponto para formar um círculo de 1-2 cm de diâmetro.
Marque a distância que a fase móvel percorre. Se a fase móvel não for polar o suficiente, a amostra permanecerá próxima ao ponto inicial. Se a fase móvel for muito polar, toda a amostra migrará com a frente do solvente. Uma fase móvel apropriada mostrará anéis bem separados, com o anel mais externo a cerca de 50% da distância até a frente do solvente.
Se necessário, duas fases móveis miscíveis podem ser misturadas em proporções variadas para obter as propriedades desejadas. Aqui, uma mistura 1:1 de acetato de etila e hexano era muito polar, mas uma mistura 1:20 foi apropriadamente separada.
Com a fase móvel escolhida, você está pronto para começar a desenvolver a placa.
Para iniciar o procedimento, corte uma placa TLC disponível comercialmente no tamanho desejado. Se a placa tiver um suporte de vidro, marque-a com um cortador de vidro e quebre cuidadosamente ao longo da linha.
Com um lápis, marque uma linha de base a cerca de 1 cm do fundo da placa. Marque o local onde as amostras serão vistas ao longo da linha. Certifique-se de que as manchas estejam a pelo menos 1 cm da borda e a 3 mm de distância. Rotule-os adequadamente.
As amostras sólidas devem ser dissolvidas num solvente adequado. Os solventes comuns incluem hexanos, acetato de etila ou diclorometano. Use o solvente menos polar que dissolverá a amostra.
Preparar a mistura amostra/solvente com um capilar de vidro. Toque suavemente a ponta no local desejado na placa TLC e remova-a imediatamente. É importante não perturbar a fase estacionária.
Mantenha o local o menor possível, pois isso leva a uma melhor separação. Se for necessária mais amostra, podem ser aplicados pontos sucessivamente em cada local. Deixe o solvente secar entre as aplicações. Um jato de ar pode ser usado para secar solventes menos voláteis.
A placa TLC agora está pronta para ser desenvolvida. Coloque um pedaço de papel de filtro no fundo do frasco para aumentar a pressão de vapor. Adicione a fase móvel a uma profundidade que não atinja a linha de base. Tampe o frasco quando não estiver em uso para que os vapores do solvente não escapem.
Coloque cuidadosamente a placa de TLC manchada no frasco de revelação. Certifique-se de que a fase móvel esteja abaixo da linha de base. Observar o progresso da frente de solvente? A vanguarda da fase móvel? pois ele se moverá rapidamente para cima na placa.
Não permita que a fase móvel atinja a borda superior da placa, pois as bandas de amostra começarão a se expandir por difusão. Quando a frente do solvente se aproximar do topo, remova a placa da câmara de revelação e marque a frente do solvente com um lápis antes que o solvente seque.
Se os compostos não forem coloridos, uma lâmpada UV pode ser usada para visualizar as manchas. O composto bloqueará a fluorescência de fundo da placa. Defina a lâmpada para a configuração de ondas curtas e ilumine a placa seca. Usando um lápis, contorne todos os pontos visíveis sob a lâmpada. Usando um lápis, contorne todos os pontos visíveis sob a lâmpada.
Outra técnica de visualização possível é usar permanganato de potássio, um agente oxidante. Usando uma pinça, mergulhe a placa na mancha de permanganato.
Remova e enxugue o excesso de solução com uma toalha de papel. Em uma capela de exaustão, aqueça cuidadosamente a placa com uma pistola de ar quente para visualizar as manchas. Use um lápis para marcar os pontos que aparecerem.
Uma vez que as manchas tenham sido visualizadas, a substância de interesse pode ser comparada aos padrões, como mostrado aqui. Neste exemplo, a incógnita é 1,3-difenilpropinona, um bloco de construção na síntese orgânica. Ao comparar a banda com um padrão conhecido e cloreto de benzoíla, um dos materiais de partida, o produto pode ser identificado.
O fator de retardo, ou Rf, é usado para identificar o composto desconhecido. O Rf é a razão entre a distância que um composto percorre em uma placa TLC e a distância que a fase móvel percorre. O fator é determinado medindo a distância da linha de base até o ponto e dividindo pela distância da linha de base até a frente do solvente.
O Rf de um determinado composto depende das condições usadas no experimento, incluindo escolha do solvente, espessura e atividade do adsorvente, temperatura e tamanho da amostra. Deve-se tomar cuidado para manter esses fatores consistentes entre os experimentos.
Existem várias aplicações da cromatografia em camada fina.
Neste exemplo, o conteúdo de triacilglicerídeos das glândulas sebáceas de morcego foi estudado. A fração de superfície lipídica foi primeiro separada por polaridade em uma placa de TLC. A banda de triacilglicerídeo foi então removida da placa com uma espátula. O pó de sílica foi transferido para um tubo de microcentrífuga com solvente. Após a centrifugação, a fase estacionária foi deixada no fundo do tubo, enquanto os compostos permaneceram dissolvidos no solvente. Os triacilgliceridos foram então separados por outra propriedade física. Nesse caso, a segunda dimensão da separação foi o tamanho molecular.
A TLC também pode ser usada para monitorar a progressão de uma reação química. Neste exemplo, o material de partida da reação foi usado como padrão e correu ao lado da solução de reação em uma placa de TLC. Este processo foi repetido em intervalos específicos ao longo da reação. À medida que a reação progredia, a banda do material de partida diminuía e a banda do produto aumentava. Quando não houve mudança nas bandas, ou todo o material de partida foi consumido, a reação foi completa. ?
Finalmente, as placas de TLC podem ser usadas em bioensaios. Neste exemplo, os compostos foram separados do trevo vermelho com TLC. Cada banda foi então colocada em bactérias que crescem em placas de ágar. As moléculas que mostraram crescimento bacteriano inibido foram analisadas quanto às suas propriedades antimicrobianas.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à cromatografia em camada fina. Agora você deve entender a teoria subjacente da separação, como escolher uma fase móvel apropriada para seu experimento e como configurar e operar uma placa TLC. Obrigado por assistir!
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