Name: Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a gerar proteínas solúveis de receptor de células T e HLA peptídeo para análise biofísica e estrutural usando cristalografia de raios X. Este método revela mecanismos de reconhecimento antigênico para imunoterapia contra câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

BM é apoiado por uma bolsa de estudo Cancer Research UK PhD. AG é apoiado por uma bolsa de estudo Life Science Research Network Wales PhD. VB é apoiado por uma bolsa de estudo Cancer Research Wales PhD. DKC é uma Confiança Research Career Development Fellow Wellcome (WT095767). AKS é um investigador Wellcome Trust. GHM é financiado por uma Life Science Research Network País de Gales e Tenovus Cancer Care PhD Studentship conjunta. Agradecemos a equipe no Diamond Light Source para fornecimento de instalações e apoio.

Expressão 1. Proteína <ol><li> Adicione construções de genes para a produção de TCRs solúveis e pHLAs, como descrito em detalhe previamente 17, 18. Conceber cada construção com um 5 &#39;BamH1 e uma 3&#39; local EcoR1 de restrição para inserção no vector pGMT7. </li><li> Transformar coli Rosetta pLysS de E. (DE3) com um vector pGMT7 plasmídeo derivado que contém a sequência que codifica a proteína de interesse por incubação de 1 mL de 50-200 ng / uL do plasmídeo com 5 mL de E. coli durante 5 min a 4 ° C , 2 min a 42 ° C e 5 min a 4 ° C, e a placa durante a noite a 37 ° C numa placa de agar LB suplementado com 50 mg / l de carbenicilina. </li><li> Escolha colónias individuais e crescer a 37 ° C e 220 rpm, em 30 mL de meio TYP (16 g / L de triptona, 16 g / L de extracto de levedura, e 5 g / L HK 2 O 4), suplementado com 100 carbenicilina uM até a suspensão atinge um de ópticonsity (DO600) de entre 0,4 e 0,6. </li><li> Induzir a produção de proteína numa alíquota de 5 mL através da introdução de 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), durante 3 h. Manter 20 ul de suspensão com e sem indução por electroforese em dodecil sulfato de sódio poliacrilamida gel de análise (SDS-PAGE) e coloração do gel. </li><li> Adicionar culturas iniciadoras para 1 L de TYP suplementado com carbenicilina 100 uM e crescer as células como descrito acima na etapa 1.3 até que a suspensão atinja uma OD 600 entre 0,4 e 0,6. </li><li> Induzir a expressão de proteína durante 3 h com IPTG 0,5 mM. Centrifugar as células durante 20 min a 3000 xg e deitar fora o sobrenadante cuidadosamente. </li><li> Dissolve-se o sedimento em 40 mL de tampão de lise (Tris 10 mM, pH 8,1; cloreto de magnésio 10 mM, MgCl2; 150 mM NaCl; e 10% de glicerol), sonicado em gelo durante potência 30 min a 60%, utilizando um 2 s intervalo , e incubar à temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos com 0,1 g / l de ADNase. </li><li> Tratar a suspensão que contém as proteínas, sob a forma de corpos de inclusão (IB), com 100 mL de tampão de lavagem (0,5% de Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,1; NaCl 100 mM; e EDTA 10 mM). </li><li> Centrifugar a amostra durante 20 min a 4 ° C e 8000 x g e deitar fora o sobrenadante cuidadosamente. Re-suspender o sedimento em 100 ml de tampão de ressuspensão (Tris 50 mM, pH 8,1; NaCl 100 mM; e 10 mM de EDTA, pH 8,1), centrifugar como anteriormente à 8000 xg, e decantar cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Finalmente, dissolve-se o sedimento em 10 mL de tampão de guanidina (guanidina 6 M, Tris 50 mM, pH 8,1; EDTA 2 mM, pH 8,1; e 100 mM NaCl) e medir a concentração de proteína a 280 nm utilizando um espectrofotómetro. </li></ol> 2. pHLA e TCR redobramento <ol><li> Para os redobra pHLA, misturar 30 mg de HLA-A2 (ou HLA-A2 com uma etiqueta de biotina) IBS, 30 mg de p2m IBS, e 4 mg de péptido durante 30 minutos a 37 ° C num banho de água num volume final de 6 ml de tampão de guanidina suplementadas com ditiotreitol 10 mM(DTT). </li><li> Iniciar o reenrolamento da proteína por diluição da mistura anterior em 1 L de um tampão de HLA redobrado pré-arrefecido (Tris 50 mM, pH 8,1; 400 mM de L-arginina; EDTA a 2 mM, pH 8,1; cisteamina 6 mM; e cistamina 4 mM). </li><li> Deixar a HLA refold agitação a 4 ° C durante 3 h e, em seguida, transferi-la para um kDa MWCO 12,4 (peso molecular cut-off) de tubo de diálise e diálise duas vezes durante 24 horas contra 20 litros de Tris 10 mM, pH 8,1. </li><li> Para os redobra TCR, misturar 30 mg de TCR de cadeia α IBS e 30 mg de TCR de cadeia β BIs durante 30 min a 37 ° C num banho de água em 6 mL de tampão de guanidina suplementado com 10 mM de DTT. </li><li> Iniciar o reenrolamento da proteína por diluição da mistura desnaturada de TCR em 1 L de um tampão de TCR redobrado pré-arrefecido (Tris 50 mM, pH 8,1; 2,5 M de ureia; EDTA a 2 mM, pH 8,1; cisteamina 6 mM; e cistamina 4 mM) durante 3 h. </li><li> Transferir a redobragem para um tubo de diálise de 12,4 kDa MWCO e diálise duas vezes durante 24 horas contra 20 litros de Tris 10 mM, pH 8,1. </li><li> Filtrar tanto a TCR ou pHLA Refidade, utilizando um filtro de membrana de 0,45 mm para os passos de purificação. </li></ol> 3. A purificação por Cromatografia Líquida de Proteínas Rápida (FPLC) <ol><li> Carregar a preparação redobrado filtrado (quer pHLA ou TCR) para uma média de 7,9 mL, 50 uM coluna de resina permutadora de aniões pré-equilibrada com 20 ml de Tris 10 mM, pH 8,1, em um sistema de cromatografia flexível e intuitiva. </li><li> Elui-se a proteína a 5 ml / min com um gradiente de sal (NaCl 0-500 mM em Tris a 10 mM, pH 8,1, ao longo de 8 volumes de coluna) e recolher fracções de 1 mL. </li><li> Analisar as fracções correspondentes à proteína de interesse por SDS-PAGE, reunir as fracções contendo a proteína de interesse juntamente, e concentrá-las para baixo para 500 ul com 10 kDa MWCO de 20 ou 10 kDa MWCO 4 por centrifugação durante 20 min a 4000 xg , descartando-se o fluxo de passagem. </li><li> Carregar as preparações de proteína concentradas em ansa de injecção de 2 ml para uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho 24 mL pré-equilibrada com o aplicativotampão ropriate eluição: solução salina tamponada com fosfato (PBS), de HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; EDTA 3,4 mM; e 0,005% de tensioactivo), ou tampão de cristal (Tris 10 mM, pH 8,1, e NaCl 10 mM ). </li><li> Elui-se as proteínas a um caudal de 0,5 mL / min ao longo de um volume de coluna; recolher fracções de 1 mL contendo a proteína de interesse verificada por SDS-PAGE. NOTA: Estes métodos foram utilizados para gerar os TCRs solúveis PMEL17 TCR e gp100, bem como todos os pHLAs utilizados neste estudo: HLA-A * 0201 com YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), ou YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). </li></ol> 4. Superfície Plasmon Resonance (SPR) Análise <ol><li> Realizar análise de ligação de equilíbrio ou análise termodinâmica usando um sistema de análise de interação molecular equipado com um chip sensor CM5 19. </li><li> Ativar o chip CM5 por fcia de um mistura 1: 1 de N-hidroxi-succinimida 100 mM (NHS) e mM de 1-etil-3- (3-dimetilpropil) -carboiimide 400 (EDC) durante 10 min a um caudal de 10 mL / min e a 25 ° C. </li><li> Carga de aproximadamente 5.000 unidades de resposta (RU) de estreptavidina (110 mL de 200 ug / ml em acetato 10 mM, pH 4,5) por ligação covalente à superfície do chip em todos os quatro fluxos de células e usar 100 ul de cloridrato de etanolamina 1 M para desactivar quaisquer grupos reactivos remanescentes. </li><li> Pares aproximadamente 500-600 RU de pHLA, a ~ 1 uM em tampão comercial (fornecido pelo fabricante), para o chip sensor CM5 com uma taxa de fluxo lento de 10 mL / min para assegurar uma distribuição uniforme sobre a superfície do chip. </li><li> Saturar a superfície do chip com biotina 1 mM em tampão comercial (fornecido pelo fabricante) durante 60 s. </li><li> Injectar dez diluições em série de TCRs solúveis sobre as células de fluxo relevantes a uma alta velocidade de fluxo de 30 mL / min a 25 ° C. </li><li> Calcule a constante de ligação de equilíbrio(K D (E)), usando valores de um ajuste não linear da curva (Y = (P1X) / (P2 + x)) 20. NOTA: As unidades de y = resposta, x = concentração analista, P1 = r max, P2 = K D. </li><li> Realizar análise cinética assumindo um 1: 1 de ligação Langmuir e ajustar os dados usando um algoritmo global de ajuste no pacote de software 2. </li><li> Realizar termodinâmica experiências, repetindo este método com as seguintes temperaturas: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, e 30 ° C 19. </li><li> Use os valores de KD determinado por SPR a diferentes temperaturas para calcular ΔG ° termodinâmico utilizando a equação padrão (ΔG ° = -RTlnK D) 19. NOTA: R = constante de gás, T = temperatura em K, ln = log natural. </li><li> Calcular os parâmetros termodinâmicos de acordo com a equação de Gibbs-Helmholtz (ΔG ° = AH - TΔS °) 19. </li&gt; <li> Traçar as energias de ligação livre, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), contra a temperatura (K), utilizando uma regressão não-linear para ajustar a equação de três parâmetros (y = AH + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (X / 298)) 19. NOTA: Y = temperatura em K, X = ΔG °. </li></ol> 5. Calorimetria isotérmica de titulação (ITC) <ol><li> Realizar experimentos ITC, utilizando um calorímetro de titulação isotérmica. Injectar 30 uM pHLA para dentro da célula de carga de calorímetro e 210 uM de TCR solúveis para dentro da seringa. Use as seguintes condições tampão: 20 mM de HEPES (pH 7,4) contendo NaCl 150 mM. </li><li> Realizar 20 injecções de TCR, cada uma um volume de 2 mL. Calcule AH e K D utilizando o software de análise. </li></ol> 6. A cristalização, Coleta de dados de difração, e Modelo Refinamento <ol><li> Realizar ensaios de cristalização utilizando um robot de cristalização. </li><li> Crescer cristais por vapou de difusão a 18 ° C por meio da técnica da gota sentado numa placa de 96 poços com um reservatório contendo 60 ul de tampão de cristalização (licor mãe) 21. </li><li> Concentra-se a pHLA solúvel a aproximadamente 10 mg / ml (0,2 mM) em tampão de cristal por centrifugação a 3000 xg num peso molecular de 10 kDa concentrador centrífugo de corte. </li><li> Para as estruturas de co-complexo, misturar o TCR e pHLA a uma proporção de 1: 1 molar até se obter uma solução de proteína a cerca de 10 mg / ml (0,1 mM). </li><li> Adicionou-se 200 nL de pHLA sozinho, ou a 1: 1 razão molar de mistura de TCR e pHLA, a 200 nL de cada solução de reservatório a partir do ecrã de cristalização utilizando um robot de cristalização e marcar para cristais ao microscópio após 24 h, 48 h, 72 h, e, em seguida, uma vez por semana. </li><li> monocristais colheita por montá-los manualmente no crio laços sob um microscópio e crio-resfriá-los, submergindo e armazená-los em nitrogênio líquido (100 K). NOTA: Carregando cristais leva um pouco de pracTice, e decidir que os cristais são bons o suficiente para coleta de dados vem com a experiência. Como regra geral, o maior e mais regular do cristal, o melhor. </li><li> Recolha de dados numa corrente de gás de azoto a 100 K. NOTA: Esta informação foi adquirida na Fonte de Luz Diamond (DLS) instalação nacional de ciência síncrotron no Reino Unido. </li><li> Analisar os dados por estimar as intensidades de reflexão com xia2 usando tanto MOSFLM 22 e XDS pacotes 23, e, em seguida, escalar os dados com SCALA ou sem rumo 24 eo pacote CCP4 25. </li><li> Resolver as estruturas com substituição molecular utilizando PHASER 26. </li><li> Ajustar o modelo com GALEIRÃO 27 e refinar o modelo com REFMAC5 28. </li><li> Prepare representações gráficas com PyMOL 29. </li><li> Calcular os contatos usando o &quot;contato&quot;programa do pacote CCP4. Use a 4 um cut-off de van der Waals contatos e 3,4 Å de corte para ligações de hidrogênio e pontes de sal. </li><li> Calcular complementaridade superfície utilizando o programa de &quot;SC&quot; no pacote CCP4. </li><li> Calcular o ângulo de cruzamento do complexo TCR-pHLA, tal como descrito 30. NOTA: Para este estudo, os dados de reflexão e coordenadas finais modelo foram depositados com o banco de dados PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 e A2 PDB -YLE-5A: 5EU5). </li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse ou interesses financeiros conflitantes.

Os protocolos descritos aqui fornecem um quadro para a dissecção molecular e celular de respostas de células T no contexto de qualquer doença humana. Embora o câncer foi o foco principal deste estudo, nós usamos abordagens muito semelhantes para investigar as respostas das células T a vírus 32, 33, 34, 35, 36, 37 e durante autoimunidade 38, 39, 40. Além disso, temos usado essas técnicas de forma mais ampla para compreender os princípios moleculares que governam de células T reconhecimento do antígeno 2, 19, 41, 42. Na verdade, a natureza imprevisível das modificações ao péptido resíduos, mesmo aquelesfora da dos resíduos de contacto de TCR, o reconhecimento de células T impactos tem implicações importantes para a concepção de péptidos heteróclita. Esses achados têm contribuído diretamente para o desenvolvimento de terapias romance de células T, incluindo vacinas peptídicas 6, 43 e TCRs de elevada afinidade artificiais 3, 4, 5, 20, 44, bem como de diagnósticos aprimorados 45, 46, 47. As etapas críticas no âmbito do protocolo A geração de uma proteína altamente puro, funcional é essencial para todos os métodos descritos no presente documento. Modificações e solução de problemas Dificuldades na geração de proteína altamente pura, muitas vezes relacionados com a expressão de altamente-pure, insolúvel BIs a partir do sistema de expressão de E. coli. Geralmente, a modificação do protocolo de expressão (por exemplo, induzindo a diferentes densidades ópticas, utilizando diferentes estirpes de E. coli, ou usando meios de comunicação diferentes formações) resolve estes problemas. Limitações da técnica Estas técnicas utilizam moléculas de proteínas solúveis (TCR) e pHLA que são normalmente expressas na superfície da célula. Assim, é importante para assegurar que o / resultados biofísicos estruturais são consistentes com abordagens celulares para confirmar significado biológico. Significância da técnica em relação a métodos existentes / alternativas Através da utilização de cristalografia de raios-X e biofísica comprovadas através de análise funcional, nós e outros demonstraram que a TCR específico para epitopos de cancro são geralmente caracterizadas por afinidades de ligação de baixo 48. Esta baixa afinidade TCR pode ajudar a explicar por que as células T ARe não naturalmente eficaz em limpar o câncer. estruturas atômicas de alta resolução de complexos entre TCRs anti-câncer e antígenos tumorais cognatos estão começando a revelar a base molecular para esta afinidade fraca. Além disso, esses estudos são úteis para determinar os mecanismos subjacentes às intervenções terapêuticas destinadas a ultrapassar este problema, semear futuras melhorias 16. Neste estudo, foi examinada a primeira estrutura de uma αβTCR de ocorrência natural em complexo com um gp100 HLA-A * 0201-restrito de melanoma epitopo. A estrutura, combinada com uma análise biofísica em profundidade, revelado o modo de ligação geral da interacção. Nós também descobriu um interruptor molecular inesperada, que ocorreu em uma forma mutante do peptídeo, que revogou TCR ligação (avaliada através de ressonância de plasma de superfície) e reconhecimento de células T CD8 + (experimentos funcionais). Só foi possível demonstrar esse novo mecanismo de presentati antígeno HLAsobre o uso dos métodos descritos de alta resolução. As aplicações futuras ou direções Depois de dominar esta técnica Em geral, os nossos resultados demonstram o poder de cristalografia de raios-X e métodos biofísicos quando combinado com análises funcionais robustos. Usando estes métodos, é possível para dissecar os mecanismos moleculares precisos que regulam o reconhecimento do antigénio das células T. De facto, é também possível utilizar esta abordagem para resolver a estrutura de TCR não ligada, demonstrando como as alterações conformacionais podem desempenhar um papel durante antigénio discriminação 49, 50, 51. Uma melhor compreensão da natureza altamente complexo e dinâmico que sustenta interacções TCR-pHLA também tem implicações óbvias para o projeto terapia. Ser capaz de diretamente &quot;ver&quot; as moléculas que estão sendo terapeuticamente alvo, bem como o efeito que as modificações têm em recognitio antígenon, irá melhorar claramente o desenvolvimento destes medicamentos vai para a frente. Neste estudo, mostra-se que até mesmo alterações de um único resíduo de péptido que não está muito envolvida por um TCR pode transmitir de forma imprevisível alterações estruturais a outros resíduos no péptido ligado a HLA, que, por sua vez, altera drasticamente o reconhecimento de células T. Uma compreensão mais completa dos mecanismos moleculares utilizados durante o reconhecimento do antigénio das células T será extremamente benéfica na concepção de terapias futuras para uma ampla gama de doenças humanas.

A cristalografia de raios-X tem sido, e continuam a ser, uma técnica extremamente poderosa para compreender a natureza das interacções ligando-receptor. Ao visualizar essas interações, nos mínimos detalhes, não só é possível divulgar os mecanismos moleculares que regulam muitos processos biológicos, mas também é possível alterar diretamente as interfaces de contacto relativos benefício terapêutico. Juntamente com técnicas tais como ressonância plasmónica de superfície e calorimetria de titulação isotérmica (para citar apenas alguns), tais modificações podem então ser analisados ​​para avaliar o biofísico impacto directo sobre a afinidade de ligação, de interacção cinética e termodinâmica. Finalmente, através da realização de experiências funcionais em tipos de células relevantes, uma imagem detalhada do impacto molecular e funcional de modificações para interacções receptor-ligando pode ser adquirida, fornecendo informações mecanicista muito específico. Em geral, estes tipos de métodos de proporcionar uma imagem de resolução atómica permitindo a dissuadir<html> minação de como os sistemas biológicos funcionam, com implicações concomitantes na avanços diagnósticos e terapêuticos. O nosso laboratório rotineiramente utiliza estas técnicas para estudar os receptores que medeiam a imunidade de células T humanas a agentes patogénicos e cancro, na auto-imunidade, e durante o transplante. Aqui, concentrar-se na resposta de células T humanas CD8 + para o cancro, mediada por uma interacção entre o receptor de células T (TCR) e o antigénio de leucócitos humanos (HLA) péptidos derivados de tumores -restricted (pHLA). Isto é importante porque, embora as células T CD8 + são capazes de direccionar células do cancro, nós e outros mostraram previamente que os TCRs anti-cancro subótimamente ligar ao seu cognato pHLA 1, 2. Assim, muitos laboratórios têm procurado para alterar tanto o TCR 3, 4, 5 ou 6 do ligando peptídico,classe = &quot;refex&quot;&gt; 7, 8, a fim de aumentar a imunogenicidade e a melhores células cancerosas alvo. No entanto, estas abordagens nem sempre são eficazes e podem ter efeitos secundários graves, incluindo fora do alvo toxicidades 4, 9, 10. Mais pesquisas explorar os mecanismos moleculares que governam o reconhecimento de células T de antígenos de câncer será vital para superar essas deficiências. No presente estudo, nós focada nas respostas contra células de melanoma autólogas de células T CD8 + específicos para um fragmento do antigénio de diferenciação de melanócitos glicoproteicas 100 (gp100), gp100 280-288, apresentados por HLA-A * 0201 (o mais comumente -expressed pHLA humana classe I). Este antigénio tem sido um alvo para a imunoterapia amplamente estudado o melanoma e foi desenvolvido como um assim chamado péptido &quot;heteróclita&quot; em que uma alanina substitui a valinana posição de âncora 9 para melhorar a estabilidade pHLA 11. Esta abordagem foi utilizada para aumentar a indução de CTL de melanoma-reactivo in vitro e tem sido utilizado com sucesso em estudos clínicos 12. No entanto, as alterações aos resíduos peptídicos podem ter efeitos imprevisíveis sobre a especificidade das células T, demonstrada pela baixa eficácia da maior parte dos péptidos heterolitic na clínica 6, 13. Na verdade, uma outra forma heteróclita de gp100 280-288, em que resíduo de peptídeo Glu3 foi substituído por Ala, revogou o reconhecimento por uma população policlonal de gp100 280-288 células T especï¿½icos 14, 15. Foi anteriormente demonstrado que mesmo pequenas alterações nos resíduos de âncora péptido pode alterar substancialmente o reconhecimento de células T de maneiras imprevisíveis 6, 16. Assim, o estudo centrou-se na construçãoing uma imagem mais detalhada de como as células T CD8 + reconhecem gp100 e como modificações da interação entre TCRs e pHLA poderia impactar esta função. Aqui, nós geramos formas de elevada pureza, solúveis de dois TCR específicos para gp100 280-288 apresentado por HLA-A * 0201 (A2-YLE), bem como as formas naturais e alterados de pHLA. Estes reagentes foram utilizados para gerar cristais de proteína para resolver a estrutura atómica ternário de um TCR humano em complexo com a forma heteróclita de A2-YLE, bem como dois dos mutantes pHLAs em forma não ligada. Em seguida, usamos uma abordagem de varredura peptídeo para demonstrar o impacto de substituições de peptídeos em TCRs realizando em profundidade experimentos biofísicos. Finalmente, foi gerada uma linha de células T CD8 + geneticamente modificados, re-programadas para expressar um dos TCRs-A2-YLE específica, a fim de proceder a experiências funcionais para testar o impacto biológico das várias modificações peptídicas. Estes dados demonstram que, mesmo modições ao péptido resíduos que estão fora do motivo de ligação de TCR pode ter repercussões sobre resíduos peptídicos adjacentes que anulam de ligação de TCR e reconhecimento de células T imprevisível. Os nossos resultados representam o primeiro exemplo de os mecanismos estruturais subjacentes reconhecimento de células T do presente importante alvo terapêutico para o melanoma.

<table><tbody><tr><td>S.O.C. media</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbi-Safe New Orbit incubadora</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>carbenicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain SafeStain&nbsp;</td><td>Centrífuga Generon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Cloreto de magnésio Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Arcos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Glicerol</td>&nbsp; Fisher<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls HD 2070&nbsp;</td><td>DNA de Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidina&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND1000&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>Peptide Protein Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arginina&nbsp;</td><td>SAFC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cisteamina</td><td>Cistamina Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Tubo de diálise <td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ureia&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metricel 0.45 &mu; m filtro de membrana</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POROS 10/100 HQ&nbsp;</td><td>Biossistemas</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>aplicados&Auml; Sistema FPLC puro KTA&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 4&nbsp;</td><td>Coluna Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td>Tampão de fosfato SALINE <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Oxoid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore buffer HBS&nbsp;</td>Kit de biotinilação <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Avidity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore T200</td> Kit de acoplamento de chip <td>CM5 da GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcal VP-ITC&nbsp;</td><td>GE Healthcare Ciências da Vida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Robô de cristalização Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gryphon</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intelli-plate&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telas e reagentes de cristalização</td><td>Dimensões</td><td></td><td></td>moleculares</tr><tr><td>75 cm2 flask&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filters</td><td>Miller-GP, tubo</td> de ultracentrífuga Ultra-Clear da Millipore<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP com rotor SW28</td> Microesferas <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3/CD28 Dynabeads&nbsp;</td>Microesferas anti-PE <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Meio Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK, PHA</td><td>Alere Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TCRV&beta; mAb&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>dasatinibe&nbsp;</td><td>Axônio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-1&beta; e TNF&alfa; ELISA&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 51Cr&nbsp;</td><td>Contador Microbeta PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1450</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

usando cristalografia de raios x, biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula t mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de câncer antígenos

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Os linfócitos T citotóxicos CD8+ humanos (CTLs) são conhecidos por desempenhar um papel importante no controle do tumor. Para realizar essa função, o receptor de células T (TCR) expresso na superfície celular deve reconhecer funcionalmente os peptídeos derivados de tumor (pHLA) restritos ao antígeno leucocitário humano (HLA). No entanto, nós e outros mostramos que a maioria dos TCRs se liga de forma subótima aos antígenos tumorais. Descobrir os mecanismos moleculares que definem esse reconhecimento deficiente pode ajudar no desenvolvimento de novas terapias direcionadas que circunavegam essas deficiências. De fato, as terapias atuais que carecem dessa compreensão molecular não foram universalmente eficazes. Aqui, descrevemos métodos que comumente empregamos em laboratório para determinar como a natureza da interação entre TCRs e pHLA governa a funcionalidade das células T. Esses métodos incluem a geração de TCRs solúveis e pHLA e o uso desses reagentes para cristalografia de raios-X, análise biofísica e coloração de células T específicas do antígeno com multímeros de pHLA. Usando essas abordagens e guiadas por análises estruturais, é possível modificar a interação entre TCRs e pHLA e, em seguida, testar como essas modificações afetam o reconhecimento do antígeno de células T. Essas descobertas já ajudaram a esclarecer o mecanismo de reconhecimento de células T de vários antígenos de câncer e podem direcionar o desenvolvimento de peptídeos alterados e TCRs modificados para novas terapias contra o câncer.

Aqui, descrevemos métodos que comumente empregamos em laboratório para determinar como a natureza da interação entre o receptor de células T e os antígenos tumorais, apresentada por antígenos leucocitários humanos, governa a funcionalidade das células T; esses métodos incluem produção de proteínas, cristalografia de raios-X, biofísica e experimentos funcionais de células T.

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar proteínas HLA peptídicas e receptoras de células T recumbinadas solúveis de qualidade suficiente para uso em análises biofísicas e estruturais. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da Imunologia de Células T. Como, por exemplo, por que as células T não respondem de forma robusta ao câncer?A principal vantagem dessa técnica é que obtemos dados mecanicistas de altíssima resolução explicando como os receptores de células T reconhecem seus alvos, levando a respostas imunes mediadas por células T. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de praticamente qualquer doença humana porque as células T desempenham um papel fundamental na maioria das respostas imunológicas. Embora esse método possa fornecer informações sobre as respostas imunes das células T, ele também pode ser aplicado a outros sistemas controlados por interações de ligantes de receptores.Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é muito difícil gerar proteínas ativas solúveis de qualidade suficiente para experimentos biofísicos e estruturais. Para iniciar o procedimento de redobramento do peptídeo HLA para seis mililitros de tampão guanidina com ditiotreitol de 10 milômetros, adicione 30 miligramas de corpos de inclusão HLA-A2, 30 miligramas de corpos de inclusão beta 2-M e quatro miligramas do peptídeo desejado de interesse. Incube a mistura por 30 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, dilua a mistura com um litro de tampão HLA refold, pré-resfriado a quatro graus Celsius e mexa a mistura por três horas nessa temperatura. Dialisar a mistura duas vezes contra 20 litros de tris 10 milimolares, pH 8,1, por 24 horas cada. Para iniciar o procedimento de redobramento do TCR, a seis mililitros de tampão guanidina com ditiotreitol 10 milimolar, adicione 30 miligramas de cada TCR Alpha e beta chain IB's.Incube a mistura por 30 minutos a 37 graus Celsius e dilua a mistura em um litro de tampão TCR refold pré-resfriado. Mexa e dialise a mistura TCR refold diluída da mesma forma que a mistura de peptídeo HLA. Filtre ambas as misturas redobradas dialisadas através de um filtro de membrana de 0,45 micrômetro.Em seguida, coloque uma das preparações redobradas filtradas em uma coluna de resina de troca aniônica de 7,9 mililitros e 50 micrômetros, pré-equilibrada com 20 mililitros de tris de 10 milimolares, pH 8,1. Eluir a proteína com um sistema tampão de gradiente de sal a cinco mililitros por minuto. Colete frações de um mililitro e analise as frações com SDS-Page.Combine as frações que contêm a proteína redobrada. Coloque a mistura de proteínas em um concentrador centrífugo de corte de peso molecular de 10 kilodalton. Centrifugue a mistura durante 20 minutos ou o tempo que for necessário, a 4000 vezes g, para concentrar a mistura a 500 microlitros.Descarte o fluxo. Molde a preparação de proteína concentrada em um loop de injeção de dois mililitros e injete a proteína em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho de 24 mililitros, pré-equilibrada com o tampão de ilusão apropriado. Eluir a proteína com um volume de coluna de tampão a 0,5 mililitros por minuto.Colete frações de um mililitro, analise as frações com SDS-Page e combine as frações contendo a proteína de interesse. Preparar 10 diluições seriadas da solução de TCR, numa gama de concentrações compreendida entre 10 vezes mais e 10 vezes menos a DK da interacção HLA do peptídeo TCR específico, se conhecida. Caso contrário, comece com uma concentração de TCR de 200 micromolar.Em seguida, ative um chip sensor revestido com dextrana carboximetilado fluindo uma mistura de um para um de 100 milimolares e N-hidroxisuccinimida e 400 milimolares EDC sobre o chip a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto por 10 minutos, a 25 graus Celsius. Em seguida, carregue 110 microlitros de 200 microgramas por mililitro de estreptavidina e acetato de 10 milimolares pH 4,5 em todas as quatro células de fluxo para funcionalizar a superfície do chip. Desativar os grupos reactivos restantes com 100 microlitros de cloridrato de etanolamida molar.Em seguida, flua uma solução de aproximadamente um peptídeo micromolar HLA no tampão fornecido pelo fabricante do chip sobre a superfície do chip a 10 microlitros por minuto até que a contagem de unidades de resposta tenha um aumento de 500 a 600. Sature a superfície do chip com um milimolar de biotina e tampão fornecido pelo fabricante por 60 segundos. Em seguida, injete as 10 diluições seriadas da solução TCR a 30 microlitros por minuto a 25 graus Celsius.Calcule a constante de ligação de equilíbrio e execute uma análise cinética. Realize uma série de experimentos SPR dessa maneira, variando apenas a temperatura na qual as diluições do TCR são injetadas. Determine a constante de ligação de equilíbrio para cada temperatura e calcule as energias de Gibbs e outros parâmetros termodinâmicos.Conecte as energias de Gibbs contra a temperatura usando um ajuste de regressão não linear. Concentre a solução peptídica HLA a 0,2 milimolar e tampão de cristalização por centrifugação a 3.000 vezes g, em um concentrador centrífugo de corte de peso molecular de 10 kilodaltons. Prepare uma solução 0,1 milimolar de um para um TCR e peptídeo HLA para cristalização cocomplexada.Usando um robô de cristalização e um kit de peneiramento, prepare testes de cristalização usando a técnica de gota sentada em uma placa de 96 poços. Com 60 microlitros de tampão de cristalização em cada reservatório, e cada gota sendo composta por 200 nanolitros de solução proteica e tampão. Cresça os cristais a 18 graus Celsius.Pontuação para cristais ao microscópio após 24 horas, 48 horas, 72 horas e, em seguida, semanalmente. Uma vez que os cristais individuais de qualidade suficiente tenham crescido, colha os cristais individuais com um loop compatível com criogênio e armazene os cristais em nitrogênio líquido. Realize a difração de raios X síncrotron sob uma corrente de gás nitrogênio a 100 kelvin, analise os dados e resolva as estruturas com o software apropriado.Calcule os contatos, a complementaridade da superfície e o ângulo de cruzamento das estruturas resolvidas. Usando esses métodos, as moléculas de TCR e peptídeo HLA foram expressas e redobradas em uma forma solúvel. O peptídeo nas moléculas do peptídeo HLA foi o antígeno gp100.O SPR foi usado para determinar a afinidade de ligação do PMEL17 TCR para o antígeno em várias temperaturas. A SPR e a titulação calorimétrica isotérmica foram então utilizadas para determinar os parâmetros termodinâmicos da interação proteína-proteína. O complexo PMEL17 TCR A2-YLE-9V foi cristalizado e avaliado com difração de raios X síncrotron.As alças TCR CDR e os resíduos peptídicos HLA contatados pela proteína TCR foram identificados e a natureza dos contatos foi estudada. As moléculas do peptídeo HLA com formas mutantes do peptídeo também foram purificadas e cristalizadas dessa maneira. Investigar diferenças estruturais que possam impedir interações de ligação com TCR.Descobriu-se que a mutação do terceiro ou quinto resíduo altera significativamente a posição da prolina quatro, o que interromperia muitos dos contatos com o TCR CDR-3 Alpha Loop. Ao tentar este procedimento, é importante selecionar apenas as proteínas mais puras para análise posterior. Após este procedimento, outros métodos, como a coloração de tetrâmero do peptídeo HLA, podem ser realizados usando as proteínas solúveis para isolar as células T específicas do antígeno do sangue do paciente para diagnóstico e análise posterior.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia de células T explorarem a ligação do peptídeo TCR HLA em detalhes requintados, permitindo o desenvolvimento de novos medicamentos para câncer e outras doenças humanas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar proteínas TCR e peptídeo HLA de qualidade suficiente para realizar análises biofísicas e estruturais.

using-x-ray-crystallography-biophysics-functional-assays-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O ensaio de libertação de crómio, um ensaio comum para a detecção da actividade de células T citotóxicas, tem várias limitações. Usando células T CD8 específicos de antígenos ea linha de tumor de câncer de mama humano, SKBR3, no presente artigo, uma abordagem baseada em impedância foi examinado para a capacidade de detecção de morte celular.

Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Um fluxo de ensaio de ligação celular baseados em citometria é descrito que é usado principalmente como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de um ligante de chemokine CXC fluorescente etiquetada 12 (CXCL12) para o receptor do chemokine CXC 4 (CXCR4).

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4

Este papel utiliza um ensaio de fluxo cytometry-baseado para bibliotecas de tela de inibidores químicos para a identificação de inibidores e os alvos que influenciam a sinalização do receptor de células T. Os métodos descritos aqui também podem ser expandidos para as sessões de alta produtividade.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Aqui, descrevemos um método in vitro co-cultura para recursivamente desafio tumor-alvo as células T, que permite a análise fenotípica e funcional da atividade antitumoral de célula T.

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

O objetivo deste protocolo é mostrar como usar microscopia de folha de luz de rede para visualizar quatro dimensões a dinâmica do receptor de superfície em células vivas. Aqui são mostrados receptores de células T em células CD4+ T primárias.

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a localização in vivo de anticorpos em modelos de xenoenxerto de tumores de camundongos.

Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

Este protocolo descreve a metodologia para rastreamento não invasivamente de células T geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico in vivo com uma plataforma clinicamente disponível.

Imagem dinâmica das células T do receptor de antígeno quimérico com [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Tomografia Computadorizada

Apresentamos aqui um protocolo para radiomarcar células com um radioisótopo de tomografia por emissão de pósitrons (PET), 89 Zr (t1/2 78,4 h), usando um sintetizador de radiomarcação pronto para uso, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). A radiomarcação de células com [89Zr]Zr-DBN permite rastreamento não invasivo e imagens de células radiomarcadas administradas no corpo com PET por até 7 dias após a administração.

Imagem por Tomografia por Emissão de Pósitrons do Tráfico Celular: Um Método de Radiomarcação Celular

Aprenda a gerar proteínas solúveis de receptor de células T e HLA peptídeo para análise biofísica e estrutural usando cristalografia de raios X. Este método revela mecanismos de reconhecimento antigênico para imunoterapia contra câncer.

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos (Vídeo) | JoVE Journal

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

Explorar mais vídeos