Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

O objetivo geral deste procedimento é gerar proteínas HLA peptídicas e receptoras de células T recumbinadas solúveis de qualidade suficiente para uso em análises biofísicas e estruturais. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da Imunologia de Células T. Como, por exemplo, por que as células T não respondem de forma robusta ao câncer?

A principal vantagem dessa técnica é que obtemos dados mecanicistas de altíssima resolução explicando como os receptores de células T reconhecem seus alvos, levando a respostas imunes mediadas por células T. As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de praticamente qualquer doença humana porque as células T desempenham um papel fundamental na maioria das respostas imunológicas. Embora esse método possa fornecer informações sobre as respostas imunes das células T, ele também pode ser aplicado a outros sistemas controlados por interações de ligantes de receptores.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é muito difícil gerar proteínas ativas solúveis de qualidade suficiente para experimentos biofísicos e estruturais. Para iniciar o procedimento de redobramento do peptídeo HLA para seis mililitros de tampão guanidina com ditiotreitol de 10 milômetros, adicione 30 miligramas de corpos de inclusão HLA-A2, 30 miligramas de corpos de inclusão beta 2-M e quatro miligramas do peptídeo desejado de interesse. Incube a mistura por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, dilua a mistura com um litro de tampão HLA refold, pré-resfriado a quatro graus Celsius e mexa a mistura por três horas nessa temperatura. Dialisar a mistura duas vezes contra 20 litros de tris 10 milimolares, pH 8,1, por 24 horas cada. Para iniciar o procedimento de redobramento do TCR, a seis mililitros de tampão guanidina com ditiotreitol 10 milimolar, adicione 30 miligramas de cada TCR Alpha e beta chain IB's.

Incube a mistura por 30 minutos a 37 graus Celsius e dilua a mistura em um litro de tampão TCR refold pré-resfriado. Mexa e dialise a mistura TCR refold diluída da mesma forma que a mistura de peptídeo HLA. Filtre ambas as misturas redobradas dialisadas através de um filtro de membrana de 0,45 micrômetro.

Em seguida, coloque uma das preparações redobradas filtradas em uma coluna de resina de troca aniônica de 7,9 mililitros e 50 micrômetros, pré-equilibrada com 20 mililitros de tris de 10 milimolares, pH 8,1. Eluir a proteína com um sistema tampão de gradiente de sal a cinco mililitros por minuto. Colete frações de um mililitro e analise as frações com SDS-Page.

Combine as frações que contêm a proteína redobrada. Coloque a mistura de proteínas em um concentrador centrífugo de corte de peso molecular de 10 kilodalton. Centrifugue a mistura durante 20 minutos ou o tempo que for necessário, a 4000 vezes g, para concentrar a mistura a 500 microlitros.

Descarte o fluxo. Molde a preparação de proteína concentrada em um loop de injeção de dois mililitros e injete a proteína em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho de 24 mililitros, pré-equilibrada com o tampão de ilusão apropriado. Eluir a proteína com um volume de coluna de tampão a 0,5 mililitros por minuto.

Colete frações de um mililitro, analise as frações com SDS-Page e combine as frações contendo a proteína de interesse. Preparar 10 diluições seriadas da solução de TCR, numa gama de concentrações compreendida entre 10 vezes mais e 10 vezes menos a DK da interacção HLA do peptídeo TCR específico, se conhecida. Caso contrário, comece com uma concentração de TCR de 200 micromolar.

Em seguida, ative um chip sensor revestido com dextrana carboximetilado fluindo uma mistura de um para um de 100 milimolares e N-hidroxisuccinimida e 400 milimolares EDC sobre o chip a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto por 10 minutos, a 25 graus Celsius. Em seguida, carregue 110 microlitros de 200 microgramas por mililitro de estreptavidina e acetato de 10 milimolares pH 4,5 em todas as quatro células de fluxo para funcionalizar a superfície do chip. Desativar os grupos reactivos restantes com 100 microlitros de cloridrato de etanolamida molar.

Em seguida, flua uma solução de aproximadamente um peptídeo micromolar HLA no tampão fornecido pelo fabricante do chip sobre a superfície do chip a 10 microlitros por minuto até que a contagem de unidades de resposta tenha um aumento de 500 a 600. Sature a superfície do chip com um milimolar de biotina e tampão fornecido pelo fabricante por 60 segundos. Em seguida, injete as 10 diluições seriadas da solução TCR a 30 microlitros por minuto a 25 graus Celsius.

Calcule a constante de ligação de equilíbrio e execute uma análise cinética. Realize uma série de experimentos SPR dessa maneira, variando apenas a temperatura na qual as diluições do TCR são injetadas. Determine a constante de ligação de equilíbrio para cada temperatura e calcule as energias de Gibbs e outros parâmetros termodinâmicos.

Conecte as energias de Gibbs contra a temperatura usando um ajuste de regressão não linear. Concentre a solução peptídica HLA a 0,2 milimolar e tampão de cristalização por centrifugação a 3.000 vezes g, em um concentrador centrífugo de corte de peso molecular de 10 kilodaltons. Prepare uma solução 0,1 milimolar de um para um TCR e peptídeo HLA para cristalização cocomplexada.

Usando um robô de cristalização e um kit de peneiramento, prepare testes de cristalização usando a técnica de gota sentada em uma placa de 96 poços. Com 60 microlitros de tampão de cristalização em cada reservatório, e cada gota sendo composta por 200 nanolitros de solução proteica e tampão. Cresça os cristais a 18 graus Celsius.

Pontuação para cristais ao microscópio após 24 horas, 48 horas, 72 horas e, em seguida, semanalmente. Uma vez que os cristais individuais de qualidade suficiente tenham crescido, colha os cristais individuais com um loop compatível com criogênio e armazene os cristais em nitrogênio líquido. Realize a difração de raios X síncrotron sob uma corrente de gás nitrogênio a 100 kelvin, analise os dados e resolva as estruturas com o software apropriado.

Calcule os contatos, a complementaridade da superfície e o ângulo de cruzamento das estruturas resolvidas. Usando esses métodos, as moléculas de TCR e peptídeo HLA foram expressas e redobradas em uma forma solúvel. O peptídeo nas moléculas do peptídeo HLA foi o antígeno gp100.

O SPR foi usado para determinar a afinidade de ligação do PMEL17 TCR para o antígeno em várias temperaturas. A SPR e a titulação calorimétrica isotérmica foram então utilizadas para determinar os parâmetros termodinâmicos da interação proteína-proteína. O complexo PMEL17 TCR A2-YLE-9V foi cristalizado e avaliado com difração de raios X síncrotron.

As alças TCR CDR e os resíduos peptídicos HLA contatados pela proteína TCR foram identificados e a natureza dos contatos foi estudada. As moléculas do peptídeo HLA com formas mutantes do peptídeo também foram purificadas e cristalizadas dessa maneira. Investigar diferenças estruturais que possam impedir interações de ligação com TCR.

Descobriu-se que a mutação do terceiro ou quinto resíduo altera significativamente a posição da prolina quatro, o que interromperia muitos dos contatos com o TCR CDR-3 Alpha Loop. Ao tentar este procedimento, é importante selecionar apenas as proteínas mais puras para análise posterior. Após este procedimento, outros métodos, como a coloração de tetrâmero do peptídeo HLA, podem ser realizados usando as proteínas solúveis para isolar as células T específicas do antígeno do sangue do paciente para diagnóstico e análise posterior.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia de células T explorarem a ligação do peptídeo TCR HLA em detalhes requintados, permitindo o desenvolvimento de novos medicamentos para câncer e outras doenças humanas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar proteínas TCR e peptídeo HLA de qualidade suficiente para realizar análises biofísicas e estruturais.