Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

Estamos aqui no Instituto de Pesquisa em Oncologia Molecular do Tufts New England Medical Center. Meu nome é Christina Lesco e sou pesquisadora pós-doutoranda no laboratório do Dr. Rick Van. Nosso laboratório trabalha no estudo da leucemia mieloide crônica humana, LMC e doenças semelhantes à LMC.

Estamos modelando esta doença humana em camundongos e a maneira como fazemos isso é introduzindo o oncogene humano por meio de um vetor retroviral. Assim, a primeira etapa para introduzir esse oncogene humano nas células de camundongo é produzir o próprio vírus. A próxima etapa será, efetivamente, concentrar o vírus.

Então, esta é a minha placa com células 293T. Vou precisar remover o meio com PBS. As células 293T são aderentes, no entanto, não são altamente aderentes, portanto, todos os movimentos devem ser bastante suaves. Após a lavagem, vamos substituir o PBS por tripsina.

Para desanexar as células da placa, precisamos colocar a placa de volta no incubador por cerca de três minutos. Após esses dois ou três minutos, as células estarão realmente em suspensão. Vamos adicionar alguns mililitros a mais de meio regular.

Isso vai neutralizar a tripsina. Neste momento, estamos pipetando para cima e para baixo para garantir que todas as células estejam bem em suspensão; em seguida, transferimos a suspensão para um tubo de 50 ml, contamos as células na presença de azul de tripano e utilizamos um hemocitômetro para realizar a contagem manualmente. Estou fazendo agora a minha diluição conforme calculado e, em seguida, vou semear três vezes dez à sexta potência de células por placa.

Em meio de quatro ml, certificamo-nos de que as células estão bem semeadas e vamos recolocar as placas no incubador por 16 a 18 horas, o que geralmente corresponde à manhã seguinte. Portanto, estamos agora 48 horas após a infecção pelo vírus GFP. A cloroquina é utilizada para aumentar a captação do DNA que vamos adicionar às células.

Removemos suavemente o meio das células, que agora aderiram suavemente às placas na lateral da placa. Neste momento, vamos recolocar as placas nos incubadores por cerca de uma hora. Enquanto isso, vamos preparar nossa mistura de DNA para aplicar nas células: uma delas expressa um gene resistente à neomicina e a outra expressa GFPI; estou usando DNA XI para controle da transfeção inteira.

Finalmente, estamos adicionando cloreto de cálcio. O uso de cloreto de cálcio aumenta significativamente a eficiência de transfeção. Estamos agora uma hora depois; pegamos as placas com meio contendo cloroquina e vamos adicionar nossa solução de transfeção.

O último passo que precisamos fazer é adicionar efetivamente um ml de HBS estéril 2x enquanto acrescentamos a solução de H2XHBS. Precisamos agitar o tubo ao mesmo tempo e proceder lentamente, gota a gota. Isso evita precipitações; em seguida, distribua imediatamente um ml da solução na placa de interesse, fazendo isso novamente gota a gota.

Neste momento, as células 293T estão bastante sensibilizadas. Devido ao meio com cloroquina em que se encontram, é necessário manter toda a área coberta e mover as placas o mínimo possível. Rotule a placa com o construto que você adicionou e repita o procedimento para o próximo construto.

Neste momento, substitua as placas no incubador por sete a 11 horas. Pelo menos sete, mas não mais que 11, porque as células estão muito sensibilizadas devido à cloroquina, e precisaremos trocar o meio após esse período. Estamos agora cerca de 30 horas após a transfeção.

Esta é a nossa última troca de meio neste momento, as células 2 9 3 C3 T atingiram a confluência. Mais uma vez, precisamos ser muito cuidadosos ao aplicar o novo meio na lateral da placa. Estou usando uma seringa de 10 ml com agulha.

Vou substituir a agulha por um filtro, então estou misturando bem o meio. Neste momento, coletamos nosso vírus e podemos armazená-lo a -80 graus até o uso. A primeira coisa a fazer é realmente concentrar o vírus. Existem várias etapas sensíveis no processo de produção do vírus, e a primeira delas é a concentração adequada das células 293T.

Estamos semeando três vezes 10 elevado a seis células por placa porque, após 18 horas, elas estarão cerca de 80% confluentes. Isso ainda lhes deixa tempo para crescerem mais, de modo que, portanto, 24 horas após a transfeção, estarão 100% confluentes. Já foi demonstrado que isso é bastante importante para um título viral excelente.

O próximo passo é o uso de cloroquina, e o uso de cloroquina na verdade sensibiliza as células 2 9 3, e todas as trocas de meio devem ser feitas com muita delicadeza para que toda a camada de células 2 9 3 T não se desprenda da placa. Por fim, o DNA que você está usando para produzir o vírus precisa ser extremamente puro. Estamos usando DNA C bandado.

Uma vez que temos o nosso vírus, o mantemos a menos 80 graus. Normalmente, fazemos apenas uma passagem por cada fator, o que reduzirá o título do vírus pela metade. Por isso, gostamos de congelar o vírus que preparamos e, em seguida, armazená-lo antes de realizarmos a titulação real do vírus.

Dependendo dos vírus, podemos ter expressão de GFP junto com o vírus para rastrear as células efetivamente infectadas, ou podemos ter resistência à neomicina. E é muito importante conhecer o título do vírus antes de utilizá-lo, a fim de poder comparar entre experimentos ou entre diferentes mutantes.