Name: Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a produzir retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente em células 293T. Este método permite introduzir oncogenes humanos em células murinas para modelar doenças mieloproliferativas.

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<ol><li> A noite antes que as células de transformação, placa 293T em 3-5x10 6 células / 6 cultureplate tecido cm. Nota: Nós usamos células 293T pela sua facilidade de transfecção e células produtoras de vírus efficacyas. Estas células são deficientes em embalagens do vírus, a menos que um ajudante plasmídeo é introduzido. </li><li> A primeira manhã, remova médio e substituir com 4 ml de células 293T med contendo 25 mM cloroquina. Coloque em uma incubadora para hr. Nota: a placa deve ser de cerca de 80% confluentes. </li><li> Enquanto isso, prepare vírus tomada de mistura para 2 placas de cada vez, em 5 tubos de ml: <ol><li> 2 x 10 mg construir plasmídeo retroviral </li><li> 2 x 5 mg embalagem construção (Ecopak), </li><li> 2 x 62 ml CaCl </li><li> completa para 1 ml com 2 O estéril DDH Nota: Enquanto o plasmídeo retroviral codifica o oncogene de interesse e um marcador, Ecopak codifica gag-pol-env. Juntamente com as células 293T, eles produzirão um retrovírus ecotropic (RV) específico para células de ratos, mas não infectantes para células humanas. Ambos cloroquina e CaCl 2 foram mostrados para aumentar a eficiência de transfecção. </li></ol></li><li> Adicionar 1 ml de sterileHBS 2x gota a gota, à mistura, enquanto delicadamente o tubo vortex. </li><li> Imediatamente adicionar esta solução a 2 placas, 1 ml cada, gentilmente, gota a gota. </li><li> Coloque em incubadora para 7-11 horas. </li><li> À noite (7 a 11 hrs. Mais tarde), remova médio, e muito gentilmente substituir com 5 ml meio fresco 293T. Coloque em incubadora até meio-dia, no dia seguinte. Nota: este passo é importante, porque você precisa tirar a cloroquina das células. Se mantido por longos períodos de tempo, a cloroquina é tóxico. A solução nas placas olha fuzzy, devido a uma muito fina, precipitação de pó-like da mistura de transfecção. Nota: É importante fazer todas as alterações de mídia com extrema suavidade, como as células foram sensibilizados pela cloroquina, e pode facilmente retirar do prato. </li><li> No dia seguinte, 18 a 24 hrs. antes de recuperar o vírus (cerca de meio-dia), remova médio, e muito gentilmente substituir com 3 ml 293T meio fresco. Substituir na incubadora S / N. </li><li> A terceira manhã (18 a 24 hrs. Mais tarde), sugar delicadamente o formulário de médio as placas com uma seringa de 10 ml equipado com uma agulha de G 18. Este sobrenadante contém os retrovírus. </li><li> Trocar a agulha a um filtro de seringa de 45 mm, inverter vezes seringa várias para misturar bem a solução, passe o sobrenadante através de filtro, e da alíquota em criotubos Nota: Como alternativa, se você estiver fazendo 3 placas + de vírus, piscina todos os sobrenadantes do mesmo vírus em um tubo de 5 ml 0 cônico. Misture bem, então sobrenadantes alíquota contendo o retrovírus em criotubos de filtragem. </li><li> Os tubos contendo os sobrenadantes vírus completo são mantidos em -80 ° C até sua utilização. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Quatro pontos críticos vai garantir o sucesso de um bom estoque viral: <ol><li> As células 293T produzir têm de ser muito saudável, o que significa que foram divididas em uma programação muito regular, nunca foram cobertas, e são banhados na densidade otimizada de 3,5-5.000.000 por 6 centímetros placa de cultura de tecido, para que atinjam uma densidade de 80% da placa, na manhã da transfecção. </li><li> Além da cloroquina melhora a eficiência de transfecção e titulação do vírus subseqüentes, cerca de 3 - a 5 vezes, através ...

Todos os reagentes utilizados na transfecção deve ser estéril filtrado (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) e mantido estéril.

produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293t

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Nossos estudos de laboratório humano doenças mieloproliferativas induzidas por oncogenes, como Bcr-Abl ou receptor do fator de crescimento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Somos capazes de modelo e estudo de doenças humanas-como em nosso modelo de mouse, através do transplante de células da medula óssea previamente infectadas com um retrovírus expressando o oncogene de interesse. Replicação defeituosa retrovírus codificação de um oncogene humano e um marcador (GFP, RFP, o gene de resistência a antibióticos, etc) é produzido por um protocolo de transfecção transiente usando células 293T, uma linha celular humana renal epiteliais transformadas pelo produto do gene E1A do adenovírus. 293 células têm a propriedade incomum de ser altamente transfectable por fosfato de cálcio (CAPO 4), com até 50-80% de eficiência de transfecção prontamente atingível. Aqui, nós co-transfecção 293 células com um vetor retroviral expressando o oncogene de interesse e um plasmídeo que expressa as funções gag-pol-env embalagens, tais como o genoma de um único embalagem constrói kat ou PCL, neste caso, o Ecopak plasmídeo. A transfecção inicial é melhorada pelo uso da cloroquina. Estoques de vírus ecotropic, coletados como cultura sobrenadante de 48 horas. pós-transfecção, podem ser armazenadas a -80 ° C e utilizado para a infecção de células-lines em vista da transformação e estudos in vitro, ou pilhas como as células da medula óssea do rato, que pode então ser utilizada para transplante em nosso modelo de camundongo .

Esta técnica demonstra uma forma eficiente de preparar replicação defeituosa stocks retroviral codificação de um oncogene humano, e posteriormente utilizado para indução de doença mieloproliferativa no modelo de mouse.

Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

Nosso laboratório estuda doenças mieloproliferativas humanas induzidas por oncogenes como Bcr-Abl ou oncogenes derivados de receptores de fator de crescimento (ZNF198-FGFR1, ...

Estamos aqui no Instituto de Pesquisa em Oncologia Molecular do Tufts New England Medical Center. Meu nome é Christina Lesco e sou pesquisadora pós-doutoranda no laboratório do Dr. Rick Van. Nosso laboratório trabalha no estudo da leucemia mieloide crônica humana, LMC e doenças semelhantes à LMC.Estamos modelando esta doença humana em camundongos e a maneira como fazemos isso é introduzindo o oncogene humano por meio de um vetor retroviral. Assim, a primeira etapa para introduzir esse oncogene humano nas células de camundongo é produzir o próprio vírus. A próxima etapa será, efetivamente, concentrar o vírus.Então, esta é a minha placa com células 293T. Vou precisar remover o meio com PBS. As células 293T são aderentes, no entanto, não são altamente aderentes, portanto, todos os movimentos devem ser bastante suaves. Após a lavagem, vamos substituir o PBS por tripsina.Para desanexar as células da placa, precisamos colocar a placa de volta no incubador por cerca de três minutos. Após esses dois ou três minutos, as células estarão realmente em suspensão. Vamos adicionar alguns mililitros a mais de meio regular.Isso vai neutralizar a tripsina. Neste momento, estamos pipetando para cima

production-replication-defective-retrovirus-transient-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Produção lentivírus

Lentivírus são um valioso instrumento de pesquisa para explorar a função do gene, no entanto, os pesquisadores podem querer evitar a produção de codificação lentivírus pantropic conhecida ou suspeita de oncogenes. Como alternativa, apresentamos um protocolo mais seguro para o uso de lentivírus ecotropic em células humanas modificadas para expressar o receptor mSlc7a1 ecotropic.

Transdução de células humanas com Polymer-complexado Lentivirus Ecotropic para reforço de Biossegurança

Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de...

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

RNA de interferência (RNAi) possui muitas vantagens sobre knockout do gene e tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta em estudos de genes funcionais. A invenção da tecnologia de RNAi DNA vector baseado fez a longo prazo e knockdown induzível gene possível, e também aumentou a viabilidade de silenciamento do...

DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

Aqui, nós utilizamos a transdução retroviral e transfecção concatemeric para criar uma linha celular que possa expressar os componentes de um vector lentiviral (LV) na ausência de tetraciclina. Este LV codifica GFP e é pseudotipado com glicoproteína, SVGmu, que é específico para um receptor em células dendríticas.

Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

Descrevemos um protocolo para amplificar locais de integração retroviral a partir do DNA genômico de células infectadas, sequenciando as junções amplificadas vírus-hospedeiro e, em seguida, mapeando essas sequências para um genoma de referência. Também descrevemos técnicas para quantificar a distribuição de locais de integração em relação a várias anotações genômicas usando BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Delineamos um protocolo de 9 dias para a transdução e expansão de células mononucleares periféricas rhesus macaque que produz células com excelente co-expressão dos genes de interesse em número suficiente para estudos de infusão da eficácia celular.

Transdução e expansão de células T primárias em nove dias com manutenção do fenótipo da memória central

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

Aprenda a produzir retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente em células 293T. Este método permite introduzir oncogenes humanos em células murinas para modelar doenças mieloproliferativas.

Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

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