Name: Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a produzir retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente em células 293T. Este método permite introduzir oncogenes humanos em células murinas para modelar doenças mieloproliferativas.

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<ol><li> A noite antes que as células de transformação, placa 293T em 3-5x10 6 células / 6 cultureplate tecido cm. Nota: Nós usamos células 293T pela sua facilidade de transfecção e células produtoras de vírus efficacyas. Estas células são deficientes em embalagens do vírus, a menos que um ajudante plasmídeo é introduzido. </li><li> A primeira manhã, remova médio e substituir com 4 ml de células 293T med contendo 25 mM cloroquina. Coloque em uma incubadora para hr. Nota: a placa deve ser de cerca de 80% confluentes. </li><li> Enquanto isso, prepare vírus tomada de mistura para 2 placas de cada vez, em 5 tubos de ml: <ol><li> 2 x 10 mg construir plasmídeo retroviral </li><li> 2 x 5 mg embalagem construção (Ecopak), </li><li> 2 x 62 ml CaCl </li><li> completa para 1 ml com 2 O estéril DDH Nota: Enquanto o plasmídeo retroviral codifica o oncogene de interesse e um marcador, Ecopak codifica gag-pol-env. Juntamente com as células 293T, eles produzirão um retrovírus ecotropic (RV) específico para células de ratos, mas não infectantes para células humanas. Ambos cloroquina e CaCl 2 foram mostrados para aumentar a eficiência de transfecção. </li></ol></li><li> Adicionar 1 ml de sterileHBS 2x gota a gota, à mistura, enquanto delicadamente o tubo vortex. </li><li> Imediatamente adicionar esta solução a 2 placas, 1 ml cada, gentilmente, gota a gota. </li><li> Coloque em incubadora para 7-11 horas. </li><li> À noite (7 a 11 hrs. Mais tarde), remova médio, e muito gentilmente substituir com 5 ml meio fresco 293T. Coloque em incubadora até meio-dia, no dia seguinte. Nota: este passo é importante, porque você precisa tirar a cloroquina das células. Se mantido por longos períodos de tempo, a cloroquina é tóxico. A solução nas placas olha fuzzy, devido a uma muito fina, precipitação de pó-like da mistura de transfecção. Nota: É importante fazer todas as alterações de mídia com extrema suavidade, como as células foram sensibilizados pela cloroquina, e pode facilmente retirar do prato. </li><li> No dia seguinte, 18 a 24 hrs. antes de recuperar o vírus (cerca de meio-dia), remova médio, e muito gentilmente substituir com 3 ml 293T meio fresco. Substituir na incubadora S / N. </li><li> A terceira manhã (18 a 24 hrs. Mais tarde), sugar delicadamente o formulário de médio as placas com uma seringa de 10 ml equipado com uma agulha de G 18. Este sobrenadante contém os retrovírus. </li><li> Trocar a agulha a um filtro de seringa de 45 mm, inverter vezes seringa várias para misturar bem a solução, passe o sobrenadante através de filtro, e da alíquota em criotubos Nota: Como alternativa, se você estiver fazendo 3 placas + de vírus, piscina todos os sobrenadantes do mesmo vírus em um tubo de 5 ml 0 cônico. Misture bem, então sobrenadantes alíquota contendo o retrovírus em criotubos de filtragem. </li><li> Os tubos contendo os sobrenadantes vírus completo são mantidos em -80 ° C até sua utilização. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Quatro pontos críticos vai garantir o sucesso de um bom estoque viral: <ol><li> As células 293T produzir têm de ser muito saudável, o que significa que foram divididas em uma programação muito regular, nunca foram cobertas, e são banhados na densidade otimizada de 3,5-5.000.000 por 6 centímetros placa de cultura de tecido, para que atinjam uma densidade de 80% da placa, na manhã da transfecção. </li><li> Além da cloroquina melhora a eficiência de transfecção e titulação do vírus subseqüentes, cerca de 3 - a 5 vezes, através ...

Todos os reagentes utilizados na transfecção deve ser estéril filtrado (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) e mantido estéril.

produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293t

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Nossos estudos de laboratório humano doenças mieloproliferativas induzidas por oncogenes, como Bcr-Abl ou receptor do fator de crescimento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Somos capazes de modelo e estudo de doenças humanas-como em nosso modelo de mouse, através do transplante de células da medula óssea previamente infectadas com um retrovírus expressando o oncogene de interesse. Replicação defeituosa retrovírus codificação de um oncogene humano e um marcador (GFP, RFP, o gene de resistência a antibióticos, etc) é produzido por um protocolo de transfecção transiente usando células 293T, uma linha celular humana renal epiteliais transformadas pelo produto do gene E1A do adenovírus. 293 células têm a propriedade incomum de ser altamente transfectable por fosfato de cálcio (CAPO 4), com até 50-80% de eficiência de transfecção prontamente atingível. Aqui, nós co-transfecção 293 células com um vetor retroviral expressando o oncogene de interesse e um plasmídeo que expressa as funções gag-pol-env embalagens, tais como o genoma de um único embalagem constrói kat ou PCL, neste caso, o Ecopak plasmídeo. A transfecção inicial é melhorada pelo uso da cloroquina. Estoques de vírus ecotropic, coletados como cultura sobrenadante de 48 horas. pós-transfecção, podem ser armazenadas a -80 ° C e utilizado para a infecção de células-lines em vista da transformação e estudos in vitro, ou pilhas como as células da medula óssea do rato, que pode então ser utilizada para transplante em nosso modelo de camundongo .

Esta técnica demonstra uma forma eficiente de preparar replicação defeituosa stocks retroviral codificação de um oncogene humano, e posteriormente utilizado para indução de doença mieloproliferativa no modelo de mouse.

Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

Nosso laboratório estuda doenças mieloproliferativas humanas induzidas por oncogenes como Bcr-Abl ou oncogenes derivados de receptores de fator de crescimento (ZNF198-FGFR1, ...

Estamos aqui no Instituto de Pesquisa em Oncologia Molecular do Tufts New England Medical Center. Meu nome é Christina Lesco e sou pesquisadora pós-doutoranda no laboratório do Dr. Rick Van. Nosso laboratório trabalha no estudo da leucemia mieloide crônica humana, LMC e doenças semelhantes à LMC.Estamos modelando esta doença humana em camundongos e a maneira como fazemos isso é introduzindo o oncogene humano por meio de um vetor retroviral. Assim, a primeira etapa para introduzir esse oncogene humano nas células de camundongo é produzir o próprio vírus. A próxima etapa será, efetivamente, concentrar o vírus.Então, esta é a minha placa com células 293T. Vou precisar remover o meio com PBS. As células 293T são aderentes, no entanto, não são altamente aderentes, portanto, todos os movimentos devem ser bastante suaves. Após a lavagem, vamos substituir o PBS por tripsina.Para desanexar as células da placa, precisamos colocar a placa de volta no incubador por cerca de três minutos. Após esses dois ou três minutos, as células estarão realmente em suspensão. Vamos adicionar alguns mililitros a mais de meio regular.Isso vai neutralizar a tripsina. Neste momento, estamos pipetando para cima e para baixo para garantir que todas as células estejam bem em suspensão; em seguida, transferimos a suspensão para um tubo de 50 ml, contamos as células na presença de azul de tripano e utilizamos um hemocitômetro para realizar a contagem manualmente. Estou fazendo agora a minha diluição conforme calculado e, em seguida, vou semear três vezes dez à sexta potência de células por placa.Em meio de quatro ml, certificamo-nos de que as células estão bem semeadas e vamos recolocar as placas no incubador por 16 a 18 horas, o que geralmente corresponde à manhã seguinte. Portanto, estamos agora 48 horas após a infecção pelo vírus GFP. A cloroquina é utilizada para aumentar a captação do DNA que vamos adicionar às células.Removemos suavemente o meio das células, que agora aderiram suavemente às placas na lateral da placa. Neste momento, vamos recolocar as placas nos incubadores por cerca de uma hora. Enquanto isso, vamos preparar nossa mistura de DNA para aplicar nas células: uma delas expressa um gene resistente à neomicina e a outra expressa GFPI; estou usando DNA XI para controle da transfeção inteira.Finalmente, estamos adicionando cloreto de cálcio. O uso de cloreto de cálcio aumenta significativamente a eficiência de transfeção. Estamos agora uma hora depois; pegamos as placas com meio contendo cloroquina e vamos adicionar nossa solução de transfeção.O último passo que precisamos fazer é adicionar efetivamente um ml de HBS estéril 2x enquanto acrescentamos a solução de H2XHBS. Precisamos agitar o tubo ao mesmo tempo e proceder lentamente, gota a gota. Isso evita precipitações; em seguida, distribua imediatamente um ml da solução na placa de interesse, fazendo isso novamente gota a gota.Neste momento, as células 293T estão bastante sensibilizadas. Devido ao meio com cloroquina em que se encontram, é necessário manter toda a área coberta e mover as placas o mínimo possível. Rotule a placa com o construto que você adicionou e repita o procedimento para o próximo construto.Neste momento, substitua as placas no incubador por sete a 11 horas. Pelo menos sete, mas não mais que 11, porque as células estão muito sensibilizadas devido à cloroquina, e precisaremos trocar o meio após esse período. Estamos agora cerca de 30 horas após a transfeção.Esta é a nossa última troca de meio neste momento, as células 2 9 3 C3 T atingiram a confluência. Mais uma vez, precisamos ser muito cuidadosos ao aplicar o novo meio na lateral da placa. Estou usando uma seringa de 10 ml com agulha.Vou substituir a agulha por um filtro, então estou misturando bem o meio. Neste momento, coletamos nosso vírus e podemos armazená-lo a -80 graus até o uso. A primeira coisa a fazer é realmente concentrar o vírus. Existem várias etapas sensíveis no processo de produção do vírus, e a primeira delas é a concentração adequada das células 293T.Estamos semeando três vezes 10 elevado a seis células por placa porque, após 18 horas, elas estarão cerca de 80% confluentes. Isso ainda lhes deixa tempo para crescerem mais, de modo que, portanto, 24 horas após a transfeção, estarão 100% confluentes. Já foi demonstrado que isso é bastante importante para um título viral excelente.O próximo passo é o uso de cloroquina, e o uso de cloroquina na verdade sensibiliza as células 2 9 3, e todas as trocas de meio devem ser feitas com muita delicadeza para que toda a camada de células 2 9 3 T não se desprenda da placa. Por fim, o DNA que você está usando para produzir o vírus precisa ser extremamente puro. Estamos usando DNA C bandado.Uma vez que temos o nosso vírus, o mantemos a menos 80 graus. Normalmente, fazemos apenas uma passagem por cada fator, o que reduzirá o título do vírus pela metade. Por isso, gostamos de congelar o vírus que preparamos e, em seguida, armazená-lo antes de realizarmos a titulação real do vírus.Dependendo dos vírus, podemos ter expressão de GFP junto com o vírus para rastrear as células efetivamente infectadas, ou podemos ter resistência à neomicina. E é muito importante conhecer o título do vírus antes de utilizá-lo, a fim de poder comparar entre experimentos ou entre diferentes mutantes.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Produção lentivírus

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Aprenda a produzir retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente em células 293T. Este método permite introduzir oncogenes humanos em células murinas para modelar doenças mieloproliferativas.

Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

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