Drosophila Preparação e imagem longitudinal do coração Função In Vivo Usando Optical Coherence Microscopy (OCM)

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens da função cardíaca de Drosophila longitudinalmente in vivo usando uma técnica de microscopia de coerência óptica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento estrutural e funcional cardíaco da Drosophila, fornecendo métricas, como alterações no diâmetro cardíaco, frequência cardíaca e período de atividade cardíaca durante a metamorfose da Drosophila. A principal vantagem dessa técnica é que a microscopia de coerência óptica é capaz de obter imagens de corações de pequenos animais de forma não invasiva com alta resolução espacial e temporal.

Esta técnica pode ajudar a revelar os mecanismos da doença cardíaca humana e a relação com o desenvolvimento cardíaco devido às semelhanças genéticas que existem entre Drosophila e vertebrados. Este método também pode ser aplicado a outros sistemas, como estimulação optogenética para estudar ou tratar a função do marcapasso enfraquecido em modelos animais. Ao produzir as moscas para este experimento, permita que as moscas parentais reprodutivas acasalem e ponham ovos em um frasco fresco por oito horas.

Assim, a ninhada de ovos postos se desenvolverá em moscas de idade semelhante. Para montar uma larva para imagens OCM, primeiro prepare um lado limpo com um pedaço de fita dupla-face. Empurre para fora todas as bolhas de ar presas abaixo da fita.

Em seguida, use uma escova macia para remover uma larva do tamanho certo do frasco. Coloque a larva em um lenço de papel limpo. Remova qualquer alimento grudado nele usando uma escova umedecida e deixe secar.

Agora, sob um microscópio de campo amplo, confirme o estágio de desenvolvimento da larva. Em seguida, posicione a larva com o lado dorsal voltado para cima para montar. Em seguida, abaixe a lâmina adesiva sobre a larva e use pressão moderada para prendê-la à fita.

Coloque a larva montada no estágio ajustável do sistema OCM ao longo da direção transversal em y com o lado dorsal voltado para cima. Um pequeno orifício no estágio mantém a larva fora de contato com o plano do estágio. Um lúmen largo do tubo cardíaco é encontrado dos segmentos A5 a A8. Usando as imagens em tempo real no computador, encontre a região posterior do tubo cardíaco e mova o estágio para frente até que o segmento A7 fique visível.

Agora, defina os parâmetros da aquisição da imagem. Use 100 A-scans por B-scan e use 100 B-scans. Em seguida, defina a tensão do scanner para cobrir cerca de 0,28 milímetros na direção transversal x e defina-a como 0 volts na direção transversal y.

Em seguida, bloqueie o caminho do feixe de amostra com um pano escuro e clique no botão Iniciar no software para adquirir dados de ruído de fundo para subtração de fundo. Para coletar imagens transversais no modo M, ajuste os parâmetros para 128 A-scans por B-scan e use 4.096 B-scans. Em seguida, reajuste a tensão para cobrir 0,28 milímetros na direção x e 0 volts na direção y como antes.

Em seguida, adquira imagens no modo M transversal do segmento A7 do tubo cardíaco da mosca. Durante o processo de economia de dados, bloqueie o feixe de imagem com um pano escuro para minimizar a exposição à luz da amostra amostra. Faça uma imagem do coração cinco vezes para obter uma medição confiável da função cardíaca.

Para coletar imagens tridimensionais, use 400 A-scans por B-scan, 800 B-scans e use tensão para 1,7 milímetros no transversal x e cerca de 4 milímetros no transversal y. Em seguida, mova o estágio do microscópio para observar toda a mosca e ajuste o foco para ver imagens nítidas. Para remover a larva, use uma escova úmida e macia para transferi-la para um novo frasco com alimentos frescos para desenvolvimento contínuo e estudo longitudinal.

O lúmen largo do tubo cardíaco permanece nos segmentos A5 a A8 no estágio de pupa PD1. No PD1, esforce-se para obter imagens do segmento A7, como feito com larvas de estágio L2 e L3. O estágio de pupa PD1 é identificado pelo pupário branco.

Essa janela de tempo é ideal para realizar imagens ópticas da pupa inicial porque a alta transparência leva a uma maior penetração de luz para imagens OCM. Limpe a pupa com a escova se houver comida grudada no corpo. Usando uma escova molhada, monte a pupa em uma pequena lâmina de vidro e mantenha o lado dorsal voltado para cima.

A lâmina deve caber em um tubo de mosca para preservar o desenvolvimento do animal em sua própria câmara. Seque o excesso de água da pupa e, em seguida, coloque-a no palco com a pupa voltada para cima e prossiga para a imagem do segmento A7 como feito com a larva. Após a imagem, transfira a lâmina de vidro com a pupa para o tubo para cultura contínua.

Após o estágio PD1, começando no PD2, uma câmara cônica começa a se desenvolver entre os segmentos A1 e A4. Como a pupa se torna progressivamente mais opaca, a profundidade de penetração do sistema de imagem é reduzida. No PD2, a casca da pupa torna-se amarelada e o corpo é menos transparente que o PD1.

No PD3, a cor da pupa ainda é um pouco mais escura do que a do estágio PD2. No estágio PD4, listras pretas podem ser observadas dentro da concha. Alguns PD4 se desenvolverão em adultos e outros entrarão no estágio PD5.

No estágio PD5, as listras pretas são ainda mais óbvias. Pegue uma pupa PD2 usando uma pinça e monte-a em um slide. No sistema OCM, encontre a extremidade anterior do tubo cardíaco e, em seguida, mova-se cerca de 50 mícrons em direção à parte posterior para encontrar o segmento A1 do tubo cardíaco.

Observe que no estágio PD2, a câmara cônica do coração é muito pequena e pode não estar batendo ainda. Prossiga com a imagem conforme descrito anteriormente. Repita o mesmo procedimento para imagens de Drosophila nos estágios PD3, PD4 e PD5.

Para começar, transfira a mosca adulta para um frasco vazio com um volume de cerca de 45 mililitros. Em seguida, mergulhe um aplicador de algodão na solução anestésica e coloque a varinha no frasco com a ponta de algodão logo abaixo da rolha de algodão. Aguarde três minutos.

A mosca adulta será anestesiada por dois minutos e meio a três minutos e meio, dependendo do seu tamanho. Agora prepare uma lâmina de vidro com um pedaço de fita dupla-face. Em seguida, usando uma escova macia, mova a mosca anestesiada para a lâmina de vidro com o lado dorsal voltado para cima.

Sob um microscópio de campo amplo, separe as asas usando uma pinça e cole-as na fita, expondo assim a região do coração para imagens. Agora, use a técnica de imagem descrita anteriormente para obter imagens do segmento A1 do coração e sacrificar a mosca no final do experimento. A imagem cardíaca longitudinal foi realizada usando moscas com uma cópia do driver 24B-GAL4.

Nos estágios larvais, o tubo cardíaco começa na região abdominal posterior A8 com um lúmen mais amplo e termina no segmento dorsal anterior A1 com um diâmetro mais estreito. No final do PD2, uma câmara cônica começou a se desenvolver no segmento A1 a A4. A frequência cardíaca da mosca foi quantificada a partir das imagens transversais do modo M OCM.

Curiosamente, durante os estágios de pupa, o coração parou de bater ocasionalmente. No geral, o batimento cardíaco diminuiu significativamente do estágio larval para o estágio de pupa e depois aumentou substancialmente da pupa para o adulto. Desde esse desenvolvimento, essa técnica deu aos pesquisadores no campo da cardiologia do desenvolvimento uma nova ferramenta para explorar os efeitos de vários genes no desenvolvimento do coração em modelos de Drosophila.

Ao tentar este procedimento, é importante acompanhar cuidadosamente o desenvolvimento de uma Drosophila para criar imagens em cada estágio de desenvolvimento.