Name: Drosophila Preparação e imagem longitudinal do coração Função In Vivo Usando Optical Coherence Microscopy (OCM) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprenda a preparar Drosophila e realizar imagem longitudinal do coração in vivo usando microscopia de coerência óptica. Este método permite quantificar diâmetro cardíaco, frequência e atividade durante a metamorfose.

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Este trabalho foi apoiado pelo Lehigh University Start-Up Fund, o NIH (R00EB010071 para C.Z., R15EB019704 para C.Z. e A.L., R03AR063271 para A.L., e R01AG014713 e R01MH060009 para R.E.T.), a NSF (1455613 para C.Z. e A.L.), o Cure Alzheimer's Fund (para R.E.T.) e o Massachusetts General Hospital (Prêmio do Comitê Executivo de Pesquisa para A.L.). M.C. e Y.M. foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (Programa 973) sob a concessão nº 2014CB340404.

1. Preparação da OCM do sistema para imagens ópticas de Drosophila 16 <ol><li> Selecione um espectrômetro e uma linha de câmera de varredura de alta velocidade que fornece uma taxa de quadros de pelo menos 80 quadros / seg para que o sistema OCM será capaz de resolver o batimento cardíaco de Drosophila. </li><li> Utilizar uma fonte de luz de banda larga para assegurar a resolução axial de 2 uM para identificar a estrutura de coração de Drosophila. </li><li> Usar uma objectiva 10X para obter uma elevada resolução transversal. </li><li> Usar um espelho de 45 ° haste de modo a reflectir o feixe luminoso de referência e o braço para gerar um feixe de luz braço amostra anelar para estender a profundidade de foco nas amostras. </li><li> Desenvolver um programa de computador personalizado para controlar o sistema OCM e realizar medições. </li></ol> 2. Cultura de Drosophila <ol><li> Fly Preparação Food Standard <ol><li> Coloque ~ 5 ml fórmula Drosophila instantânea para um frasco de poliestirenotubo com a ajuda de uma calha de papel. </li><li> Pour ~ 8 ml de água na fórmula para saturar adequadamente a comida. </li><li> Adicionar diferentes suplementos para a comida mosca padrão para diferentes experimentos. Ao se preparar para todos--retinal (ATR) alimentos trans para a optogenética ritmo experimento 35, utilize uma pipeta para extrair ATR 100 mM e dissolvem-se em ~ 8 ml de água para obter a concentração de ATR de 1 mM em alimentos. Depois de se misturar a solução de modo uniforme, verter a solução para a fórmula e agita-se suficientemente. </li><li> Para preparar um elevado teor de gordura-dieta para estudar a obesidade relacionada com disfunções cardíacas em Drosophila, 10,15 mistura ~ 10 ml fórmula com 15 ml de água num copo e calor durante 30 segundos num forno de microondas. Coloque um pouco de óleo de coco virgem extra biológico em outro copo e aquecê-lo por 90 segundos no forno de microondas. </li><li> Extrair 7,5 ml de óleo de coco e misture com a fórmula preparada suficiente para tornar a relação peso / volume de óleo de coco para alimentos ~ 30/100, e Then ~ 2 ml de extracto de alimentos misturados e colocá-lo para o fundo de um tubo. </li><li> Espere por 1 min até que o meio é completamente saturado. Compactar a comida cuidadosamente com uma superfície plana para otimizar as condições de vida da Drosophila. Adicionar 6 - 8 grãos de fermento para a fórmula preparada, e ligue o tubo com um conjunto de algodão. </li></ol></li><li> Frutas Cruzes voar e Cultura <ol><li> Tome um tubo com alimentos preparados mosca padrão, e remover o algodão conectado. transferir cuidadosamente as moscas adultas (masculino e feminino) ao tubo, e ligue o tubo com algodão imediatamente. Verifique o algodão para se certificar de que não há diferença entre o algodão e a parede do tubo para evitar moscas de escapar do tubo. </li><li> Manter as moscas da fruta na incubadora a 25 ° C durante cruzamento. A maioria dos genes estão activos e as proteínas celulares são sintetizados a 25 ° C 36-39. </li><li> Pegue o tubo para fora da incubadora depois de 8 de mão de transferências de umdult voa para fora do tubo para obter os ovos na mesma idade para o controle experimental. </li><li> Continuar a cultura de ovos na incubadora a 25 ° C, que é a temperatura normal para o desenvolvimento de Drosophila com o período de desenvolvimento de 8,5 dias 40,41. NOTA: Temperatura influencia o período de desenvolvimento (ovo a adulto) e nível de vários genes de expressão. </li></ol></li></ol> 3. Execução de imagens ópticas com OCM <ol><li> Mount Fly Larva for Imaging Optical NOTA: O ovo de portinholas de Drosophila em 22-24 h a 25 ° C a larva de primeiro estágio (L1). A segunda larva instar surge após mais 24 horas. A maior forma larval é a terceira larva instar, que molts após cerca de 24 horas. características estruturais em larvas podem ser usadas para distinguir as suas diferentes fases de desenvolvimento. O tamanho dos aparelhos bucais entre o primeiro estádio e do segundo estádio é diferente. A bocaganchos de larva de primeiro estágio são muito pequenas e se parecem com dois pares de minúsculos pontos negros, enquanto os ganchos na boca da segunda larva instar são maiores e a estrutura é mais clara. Os espiráculos são normalmente usados ​​para identificar o segundo instar e o terceiro instar. A segunda larva instar tem batido espiráculo anterior, enquanto que, para o terceiro instar, os espiráculos anteriores são ramificadas. Um anel de laranja escuro começa a aparecer na ponta dos espiráculos posteriores no terceiro instar de larva. <ol><li> Aplique um pedaço de fita dupla face para uma lâmina de microscópio de vidro limpo. Expulsar as bolhas de ar sob a fita para evitar as reflexões provocadas por bolhas de ar durante o exame. </li><li> Pegue um dos tubos com as moscas cultivadas fora da incubadora na fase larval. </li><li> Identificar a larva na mídia, remova-o da mídia com uma escova macia e coloque sobre um pano limpo. Remova qualquer alimento preso ao larva com uma escova macia molhada e seque-o sobre o tecido. </li><li> Mova o cleaned voar para um tecido sob a lente objetiva de uma vasta microscópio de campo. </li><li> Ajustar a focagem do microscópio, para encontrar uma visão clara da mosca. Identificar o estágio de desenvolvimento da larva direita pelas suas características estruturais, com o microscópio. </li><li> Posicione a mosca usando a escova macia. Garantir que o corpo é linear com o lado dorsal voltada para cima para se preparar para montagem sobre a lâmina de vidro por o lado dorsal. Executar este passo sob o microscópio. </li><li> Garantir a larva está completamente seco antes de montagem na fita. Caso contrário, a larva não irá aderir à fita. </li><li> Cole lado dorsal da mosca posicionada para o lado de fita dupla na lâmina de vidro com uma pressão moderada. Note-se que demasiada pressão pode matar a mosca e muito pouca força vai levar para voar movimento durante o exame. </li></ol></li><li> Imagem óptica de Drosophila na fase larval (L2 e L3) com OCM NOTA: Uma ampla lúmen do tubo cardíaco pode ser found localizada nos segmentos entre A5 a A8 nas fases larvares (Figura 1). As imagens em modo-M OCM transversais (2D + tempo) foram adquiridas no segmento de A7 do tubo de coração para cada larva para facilitar as pressões sistólica e diastólica análise. <ol><li> Coloque a larva montado na fase de amostra ajustável do sistema OCR ao longo da direcção transversal Y-com o lado dorsal voltada para cima por baixo da lente objectiva. Um pequeno orifício na fase de amostra é necessário para a colocação da larva, para evitar o seu contacto com o plano de fase. </li><li> Ajustar a fase de amostra para mover o tubo de coração a mosca da fruta ao plano focal do feixe de imagem. Para encontrar facilmente o segmento A7, encontrar região posterior do tubo de coração com o tempo real Imagens de corte OCM no software de aquisição de imagem. Em seguida, mova o palco para a frente até o segmento A7 é visível. </li><li> Definir parâmetros do software de aquisição de imagem de 100 A-scans por B-scan (frame), 100 B-scans, eo scannetensão r para cobrir ~ 0,28 mm na direcção transversal X, e 0 V na direcção y transversal. Clique no botão &quot;Iniciar&quot; no software para adquirir os dados de ruído de fundo para a subtracção de fundo, bloqueando o caminho do feixe de amostra com um pano escuro. NOTA: 3 dos quadros 100 pode ser utilizado para a subtracção do fundo. </li><li> Definir parâmetros do software de aquisição de dados 128 A-scans por B-scan, 4096 B-scans e a tensão scanner para cobrir ~ 0,28 mm na direcção-x transversal, e 0 V na direção y-transversal. Clique no botão &quot;Iniciar&quot; no software para adquirir as transversais imagens em modo-M em todo o segmento de A7 do tubo coração aérea sobre uma região que abrange 0,28 x 0,57 mm2 por cerca de 30 segundos. </li><li> Bloquear o feixe de imagem com um pano escuro durante o processo de gravação de dados para evitar exposição prolongada do coração voar para a luz de imagem. </li><li> Repetir a medição por 5 vezes para obter medições fiáveis ​​da diversão coraçãocção. </li><li> Definir parâmetros do programa de aquisição de imagem para 400 A-scans por B-scan, 800 B-scans e a tensão scanner para cobrir ~ 1,7 mm na direcção-x transversal, e ~ 4 mm na direcção y-transversal. Mova o estágio em ambas as direções para assegurar toda a mosca da fruta pode ser trabalhada. Clique no botão &quot;Iniciar&quot; no software para adquirir um conjunto de dados para obter imagens da mosca da fruta em 3 dimensões. Nota: A estrutura mosca 3D pode ser processado usando software Amira 3D </li><li> Use uma escova macia molhada para umedecer a mosca medido e gentilmente removê-lo da lâmina de vidro. Movê-lo para um tubo separado para desenvolvimento contínuo. Rotular o tubo para o estudo longitudinal através dos próximos estágios de desenvolvimento. </li></ol></li><li> Imagem Drosophila na pupa Nota: Todas as moscas de fruta foram retirados para a imagem latente de PD1 a PD5. Como se mostra no esquema larva na Figura 1b, uma ampla lúmen permanece em A5 a A8 segmentos de thtubo de coração e até PD1. De PD2, uma câmara cónica começa a desenvolver-se entre A1 a A4 segmentos. Para adquirir imagens consistentes e facilitar a análise do coração, imagens em modo-M transversais foram obtidos a partir do segmento A7 em PD1, e a partir do segmento A1 após PD2, conforme marcado na Figura 1b. <ol><li> Imagem Drosophila em PD1 NOTA: Drosophila terá um pupário branco para uma janela de tempo curto (0-1 horas), durante PD1. Esta janela de tempo é ideal para a realização de imageamento óptico de pupa cedo porque a alta transparência leva a uma maior penetração de luz para a imagem OCM. <ol><li> À medida que as moscas da fruta são encontrados na parede do tubo quando se tornam pupa, remover a pupa de tubos individuais para a imagiologia de PD1 com uma escova macia molhada, e limpar a pupa com a escova se houver comida colada ao corpo. </li><li> Monte a mosca da fruta em uma pequena lâmina de vidro diretamente com o pincel molhado e mantenha o lado dorsal voltada para cima (Figura 1a </strong&gt;). Certifique-se a lâmina de vidro é pequeno o suficiente para caber volta para dentro do tubo, uma vez imaging nesta fase está concluída. </li><li> Remover a água em excesso a partir do lado do corpo da mosca. </li><li> Colocar a lâmina de vidro na fase de amostra do sistema OCR, mantendo a mosca da fruta em cima. Localizar imagem em tempo real clara do segmento A7 do coração mosca utilizando a mesma estratégia descrita na medição larva. </li><li> Definir os mesmos parâmetros do software de aquisição de dados, como na seção 3.2, e a imagem dos batimentos cardíacos no segmento A7 para adquirir M-modo transversal e imagens 3D. </li><li> Após a imagiologia, utilizar uma pinça para colocar a lâmina de vidro com crisálidas de volta para dentro do tubo para cultura contínua. </li></ol></li><li> Imagem de Drosophila em PD2 aos estádios PD5 Observação: Uma vez que a amostra torna-se cada vez mais opaco, durante as fases de pupa, a profundidade de penetração do sistema de imagem será reduzida. <ol><li> Use uma pinça para remover cuidadosamente o s de vidrolide montado com a mosca na PD2 do tubo de imagem. No PD2, a concha amostra torna-se amarelada e o corpo torna-se menos transparente em comparação com PD1 (Figura 1). </li><li> Coloque o slide no palco amostra do sistema OCM. </li><li> Ajuste o estágio da amostra para mover a voar para o plano focal do feixe de imagem do sistema OCM. Localizar a extremidade anterior do tubo de imagem cardíaca OCM transversal em tempo real com. Mover ~ 50 mm para trás na direcção posterior para encontrar o segmento A1 do tubo cardíaco. NOTA: Neste ponto do desenvolvimento do coração (PD2), a câmara cónica será muito pequena e não pode ser bater. </li><li> Recolha transversais conjuntos de dados em modo M do segmento A1, bem como dados 3D usando o mesmo método que estágios de desenvolvimento anteriores. </li><li> Coloque o slide de volta para o tubo com cuidado para a cultura contínua. NOTA: A PD3, a cor da amostra no shell é mais escura do que na fase PD2. Na fase PD4, listras pretas can ser observados no interior do reservatório de os espécimes. Algumas moscas irá desenvolver em adultos a partir desta fase, no dia seguinte, enquanto outros vão evoluir para PD5. Na fase PD5, listras pretas são ainda mais obviamente visto nas moscas da fruta. Estas moscas se tornarão adultos no dia seguinte. </li></ol></li></ol></li><li> Imagem Drosophila na fase adulta NOTA: Na fase adulta, moscas macho e fêmea podem ser distinguidos pelo tamanho do corpo e a cor da parte inferior do abdómen. adultos do sexo feminino têm tamanho maior, enquanto os machos são menores e no abdômen inferior de cor escura. <ol><li> Pegue o tubo para fora da incubadora, quando a mosca da fruta se desenvolve em um adulto, e transferir o adulto voar para a ~ 45 ml frasco vazio. </li><li> Mergulhe a ponta absorvente (~ 1 cm de comprimento, ~ 3 mm de diâmetro) de uma varinha para a anestesia, coloque a varinha para dentro do frasco, e ligue o tubo com um conjunto de algodão para manter a extremidade anestésico logo abaixo do algodão ligado e anesthetize a mosca por 3 min. A duração da anestesia depende do tamanho da mosca, e pode variar entre 2,5 a 3,5 min (por exemplo: masculino durante 2,5 min, para a fêmea 3 ou 3,5 min). </li><li> Prepara-se uma lâmina de vidro com um pedaço de fita adesiva de dupla face. </li><li> Mova a mosca anestesiado sobre a lâmina de vidro com o lado dorsal voltada para cima usando a escova macia. </li><li> Separar as asas, usando uma pinça e cumpri as asas na fita sob um microscópio para corrigir a mosca e expor região do coração para a imagem latente. </li><li> Imagem da mosca do segmento A1 do coração mosca (Figura 1). No final da experiência, a mosca pode ser sacrificado. </li></ol></li></ol> 4. Imagem Análise 16 <ol><li> Desenvolver programas de Matlab para converter os arquivos binários 2D e 3D coletados com o software de aquisição de imagem para arquivos de imagem. </li><li> Use ImageJ para identificar a região do tubo cardíaco nas imagens em modo-M transversais e um algoritmo de varinha mágica que serve para criarmáscara ea da região do coração para cada imagem em modo M transversal. Segmento da região mascarada e usar um algoritmo de busca de pico para identificar os locais sistólica e diastólica. Calcule o tempo muda de diâmetro coração dependentes das imagens em modo-M transversais. </li><li> Com base nos diâmetros cardíacos dependentes do tempo adquiriu, calcular os parâmetros cardíacos, tais como RH, período de atividade cardíaca (PAC), diâmetro diástole final (EDD), diâmetro sístole final (ESD), end área de diástole (EDA), e terminam área sístole ( ESA). Calcule a fração de encurtamento (FS) com <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/55002/55002eq1.jpg" /></li><li> Use ImageJ para analisar as imagens 3D OCM para visualizar o desenvolvimento estrutural do coração mosca. </li></ol>

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Os autores declaram não haver conflitos de interesses relacionados ao presente estudo.

A rápida pulsação de Drosophila, com um FC máxima em torno de 400 bpm em estágios larvais e adultas, requer alta velocidade de imagem para resolver os diástoles cardíacos e sístoles (não inferior a 80 frames / seg com base em experiências). Devido à dimensão da espessura de tamanho pequeno da câmara do coração e da parede do coração mícron (5 - 10 um), uma resolução espacial elevada (superior a 2 mm) é necessária para a resolução de estruturas de tubo coração. Neste estudo, um sistema OCR velocidade ultra-eleva...

Estudo longitudinal do coração em animais pequenos contribui para a compreensão de uma variedade de doenças cardiovasculares relacionados humanos, tais como relacionado com o gene defeitos cardíacos congénita 1,2. Nas últimas décadas, vários modelos animais, tais como 3,4 rato, Xenopus 5,6, peixe-zebra 7,8, aviária 9 e Drosophila 10-16, têm sido usados para conduzir o coração desenvolvimento humano relacionados com a investigação. O modelo do rato tem sido amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento cardíaco normal e anormal e fenótipos defeito cardíaco devido às suas semelhanças com o 3,4 coração humano. O embrião Xenopus é especialmente útil no estudo do desenvolvimento do coração devido ao seu fácil manuseio e 5,6 transparência parcial. A transparência do embrião e larva início do modelo peixe-zebra permite a observação óptica fácil de 7,8 desenvolvimento cardíaco. O modelo aviária é um assunto comum de estudos cardíacos desenvolvimento because o coração pode ser facilmente acessado após a remoção das cascas de ovo e a semelhança morfológica dos corações de aves para os seres humanos 9. O modelo de Drosophila tem algumas características únicas que a tornam ideal para a realização de estudos longitudinais do coração. Em primeiro lugar, o tubo de coração de Drosophila é de ~ 200 um abaixo da superfície dorsal, que fornece a conveniência para o acesso óptico e observação do coração. Além disso, muitos mecanismos moleculares e vias genéticas são conservadas entre Drosophila e vertebrados. Os ortólogos de mais de 75% dos genes humanos da doença foram encontrados em Drosophila, que tornaram amplamente utilizado em estudos transgénicos 11,13. Além disso, ele tem um ciclo de vida curto e baixos custos de manutenção, e tem sido utilizada como um modelo de amostra para investigação em biologia de desenvolvimento 14-16. Relatórios anteriores descritos os protocolos para monitorar funções cardíacas Drosophila como o que eleArtbeat. No entanto, os procedimentos de dissecação foram necessários 17,18. imageamento óptico oferece uma maneira eficaz de visualizar desenvolvimento cardíaco em animais devido à sua natureza não-invasiva. Diferentes modalidades de imagens ópticas têm sido aplicados na realização de estudo cardíaca animal, tais como a microscopia de dois fótons 19, microscopia confocal 20,21, microscopia folha de luz 22 e tomografia de coerência óptica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, outubro é capaz de fornecer grande profundidade de imagem nos corações de pequenos animais sem o uso de agentes de contraste, mantendo uma alta resolução e uma velocidade de imagem ultra, que são importantes para os animais vivos de imagem. Além disso, o baixo custo de desenvolvimento de um sistema outubro popularizou esta técnica de imageamento óptico de espécimes. Outubro foi utilizado com sucesso para o estudo longitudinal de Drosophila. Usando OCT, imagiologia morfológica e funcional cardíaca foi realizada para estudar as estruturas do coração, o funcpapéis adicionais de genes e os mecanismos de defeitos cardiovasculares presentes em modelos mutantes durante o desenvolvimento cardíaco. Por exemplo, o declínio da função cardíaca dependente da idade foi confirmada com gene regulado por baixo de conversão da angiotensina relacionadas com a enzima (ACER) em Drosophila com 27 de outubro. Fenotipagem de cardiomiopatia relacionada gene foi demonstrada em Drosophila usando outubro 28-33. A pesquisa usando outubro também revelou o papel funcional do gene humano SOX5 no coração de Drosophila 34. Em comparação com outubro, a CCE utiliza uma objetiva com uma abertura numérica maior para proporcionar uma melhor transversal resolução. No passado, a disfunção cardíaca causada por silenciar um gene circadiano humano ortólogo dCry / dCLOCK foi estudado utilizando um sistema personalizado 15,16 OCM, bem como o efeito de elevado teor de gordura por dieta em cardiomiopatias em Drosophila compreender obesidade induzida humana doenças cardíacas. 15 Aqui, the protocolo experimental é resumido para o estudo longitudinal das alterações morfológicas e funcionais cardíacas em Drosophila no segundo instar (L2), terceiro estádio (L3), dia pupa 1 (PD1), dia pupa 2 (PD2), pupa dia 3 (PD3) , pupa dia 4 (PD4), pupa dia 5 (PD5), e adulto (Figura 1) através da CCE para facilitar o estudo de doenças cardíacas congénitas humanos relacionados com. Cardíacas parâmetros funcionais, tais como RH e CAP foram analisados ​​quantitativamente em diferentes estágios de desenvolvimento para revelar as características de desenvolvimento cardíacos.

<table><tbody><tr><td>Sistema de imagem OCM personalizado</td><td>Desenvolvido em nosso laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>my Temp Mini Incubadora Digital</td><td>Benchmark</td><td>H2200-HC</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>AmScope</td><td>200PCS</td><td></td></tr><tr><td>Bola de algodão</td><td>RITE AID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórmula instantânea de Drosophila</td><td>Fórmula CAROLINA</td><td>4-24</td><td></td></tr><tr><td>Levedura</td><td>ActiveDry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>SONY</td><td>WILD M420</td><td></td></tr><tr><td>Brush</td><td>Loew-Cornell</td><td>245B</td><td>sendo usado para mover espécimes</td></tr><tr><td>Software Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Wiha</td><td>AA SA</td><td>para fixar a fruta asas de mosca</td></tr><tr><td>FlyNap</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>4,224,898</td><td></td></tr><tr><td>Fita Adesiva Dupla Face Permanente, 3 M</td><td>Pipeta Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>MU18837</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de Coco Extra Orgânico</td><td>Spring Valley</td><td>13183</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Microscópio</td><td>CapitolBrand</td><td>M3504-E</td><td></td></tr><tr><td> Frascos de Drosophila</td><td>SEOH</td><td>8401SS</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>R2500</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila preparação e imagem longitudinal do coração função in vivo usando optical coherence microscopy (ocm)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

O estudo longitudinal dos batimentos cardíacos em pequenos animais contribui para a compreensão das mudanças estruturais e funcionais durante o desenvolvimento cardíaco. A microscopia de coerência óptica (OCM) demonstrou ser capaz de obter imagens de corações de pequenos animais com alta resolução espacial e velocidade de imagem ultra-alta. O alto contraste da imagem e as propriedades não invasivas tornam o OCM ideal para a realização de estudos longitudinais sem a necessidade de dissecções ou colorações de tecidos. Drosophila tem sido amplamente utilizada como organismo modelo em estudos de desenvolvimento cardíaco devido ao seu alto número de genes ortólogos de doenças humanas, sua semelhança de mecanismos moleculares e vias genéticas com vertebrados, seu curto ciclo de vida e seu baixo custo de cultura. Aqui, os protocolos experimentais são descritos para a preparação de Drosophila e imagens ópticas dos batimentos cardíacos com um sistema OCM personalizado durante todo o ciclo de vida da amostra. Seguindo as etapas fornecidas neste relatório, imagens transversais do modo M e 3D OCM podem ser adquiridas para realizar estudos longitudinais da morfologia e função cardíaca da Drosophila. As imagens OCM em face e corte axial e os histogramas da frequência cardíaca (FC) e do período de atividade cardíaca (CAP) também demonstraram analisar as alterações estruturais do coração e quantificar a dinâmica do coração durante a metamorfose da Drosophila, combinadas com os vídeos construídos com imagens do modo M para rastrear a atividade cardíaca intuitivamente. Devido à semelhança genética entre Drosophila e vertebrados, o estudo longitudinal da morfologia e dinâmica do coração em moscas-das-frutas pode ajudar a revelar as origens das doenças cardíacas humanas. O protocolo aqui forneceria um método eficaz para realizar uma ampla gama de estudos para entender os mecanismos das doenças cardíacas em humanos.

A imagem cardíaca longitudinal foi realizada utilizando as moscas da fruta com o 24B-GAL4 / + deformação à temperatura ambiente com OCM. As medições foram realizadas em L2, L3, e a intervalos de 8 hr de PD1 a PD4 e adultos dia 1 (AD1) para controlar o processo de metamorfose (Tabela 1). Larva, pupa cedo, pupa tardia e adultos moscas foram montadas em lâminas de vidro como pode ser visto na Figura 1A. As características segmento do coração para moscas larvares e adultas foram mostradas n...

Aqui, os protocolos experimentais são descritos para preparar Drosophila em diferentes estágios de desenvolvimento e realizar imagens ópticas longitudinais de batimentos cardíacos de Drosophila usando um sistema de microscopia de coerência óptica (OCM) personalizado. As alterações morfológicas e dinâmicas cardíacas podem ser caracterizadas quantitativamente pela análise dos parâmetros estruturais e funcionais do coração a partir de imagens de OCM.

Drosophila Preparação e imagem longitudinal do coração Função In Vivo Usando Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens da função cardíaca de Drosophila longitudinalmente in vivo usando uma técnica de microscopia de coerência óptica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento estrutural e funcional cardíaco da Drosophila, fornecendo métricas, como alterações no diâmetro cardíaco, frequência cardíaca e período de atividade cardíaca durante a metamorfose da Drosophila. A principal vantagem dessa técnica é que a microscopia de coerência óptica é capaz de obter imagens de corações de pequenos animais de forma não invasiva com alta resolução espacial e temporal.Esta técnica pode ajudar a revelar os mecanismos da doença cardíaca humana e a relação com o desenvolvimento cardíaco devido às semelhanças genéticas que existem entre Drosophila e vertebrados. Este método também pode ser aplicado a outros sistemas, como estimulação optogenética para estudar ou tratar a função do marcapasso enfraquecido em modelos animais. Ao produzir as moscas para este experimento, permita que as moscas parentais reprodutivas acasalem e ponham ovos em um frasco fresco por oito horas.Assim, a ninhada de ovos postos se desenvolverá em moscas de idade semelhante. Para montar uma larva para imagens OCM, primeiro prepare um lado limpo com um pedaço de fita dupla-face. Empurre para fora todas as bolhas de ar presas abaixo da fita.Em seguida, use uma escova macia para remover uma larva do tamanho certo do frasco. Coloque a larva em um lenço de papel limpo. Remova qualquer alimento grudado nele usando uma escova umedecida e deixe secar.Agora, sob um microscópio de campo amplo, confirme o estágio de desenvolvimento da larva. Em seguida, posicione a larva com o lado dorsal voltado para cima para montar. Em seguida, abaixe a lâmina adesiva sobre a larva e use pressão moderada para prendê-la à fita.Coloque a larva montada no estágio ajustável do sistema OCM ao longo da direção transversal em y com o lado dorsal voltado para cima. Um pequeno orifício no estágio mantém a larva fora de contato com o plano do estágio. Um lúmen largo do tubo cardíaco é encontrado dos segmentos A5 a A8. Usando as imagens em tempo real no computador, encontre a região posterior do tubo cardíaco e mova o estágio para frente até que o segmento A7 fique visível.Agora, defina os parâmetros da aquisição da imagem. Use 100 A-scans por B-scan e use 100 B-scans. Em seguida, defina a tensão do scanner para cobrir cerca de 0,28 milímetros na direção transversal x e defina-a como 0 volts na direção transversal y.Em seguida, bloqueie o caminho do feixe de amostra com um pano escuro e clique no botão Iniciar no software para adquirir dados de ruído de fundo para subtração de fundo. Para coletar imagens transversais no modo M, ajuste os parâmetros para 128 A-scans por B-scan e use 4.096 B-scans. Em seguida, reajuste a tensão para cobrir 0,28 milímetros na direção x e 0 volts na direção y como antes.Em seguida, adquira imagens no modo M transversal do segmento A7 do tubo cardíaco da mosca. Durante o processo de economia de dados, bloqueie o feixe de imagem com um pano escuro para minimizar a exposição à luz da amostra amostra. Faça uma imagem do coração cinco vezes para obter uma medição confiável da função cardíaca.Para coletar imagens tridimensionais, use 400 A-scans por B-scan, 800 B-scans e use tensão para 1,7 milímetros no transversal x e cerca de 4 milímetros no transversal y. Em seguida, mova o estágio do microscópio para observar toda a mosca e ajuste o foco para ver imagens nítidas. Para remover a larva, use uma escova úmida e macia para transferi-la para um novo frasco com alimentos frescos para desenvolvimento contínuo e estudo longitudinal.O lúmen largo do tubo cardíaco permanece nos segmentos A5 a A8 no estágio de pupa PD1. No PD1, esforce-se para obter imagens do segmento A7, como feito com larvas de estágio L2 e L3. O estágio de pupa PD1 é identificado pelo pupário branco.Essa janela de tempo é ideal para realizar imagens ópticas da pupa inicial porque a alta transparência leva a uma maior penetração de luz para imagens OCM. Limpe a pupa com a escova se houver comida grudada no corpo. Usando uma escova molhada, monte a pupa em uma pequena lâmina de vidro e mantenha o lado dorsal voltado para cima.A lâmina deve caber em um tubo de mosca para preservar o desenvolvimento do animal em sua própria câmara. Seque o excesso de água da pupa e, em seguida, coloque-a no palco com a pupa voltada para cima e prossiga para a imagem do segmento A7 como feito com a larva. Após a imagem, transfira a lâmina de vidro com a pupa para o tubo para cultura contínua.Após o estágio PD1, começando no PD2, uma câmara cônica começa a se desenvolver entre os segmentos A1 e A4. Como a pupa se torna progressivamente mais opaca, a profundidade de penetração do sistema de imagem é reduzida. No PD2, a casca da pupa torna-se amarelada e o corpo é menos transparente que o PD1.No PD3, a cor da pupa ainda é um pouco mais escura do que a do estágio PD2. No estágio PD4, listras pretas podem ser observadas dentro da concha. Alguns PD4 se desenvolverão em adultos e outros entrarão no estágio PD5.No estágio PD5, as listras pretas são ainda mais óbvias. Pegue uma pupa PD2 usando uma pinça e monte-a em um slide. No sistema OCM, encontre a extremidade anterior do tubo cardíaco e, em seguida, mova-se cerca de 50 mícrons em direção à parte posterior para encontrar o segmento A1 do tubo cardíaco.Observe que no estágio PD2, a câmara cônica do coração é muito pequena e pode não estar batendo ainda. Prossiga com a imagem conforme descrito anteriormente. Repita o mesmo procedimento para imagens de Drosophila nos estágios PD3, PD4 e PD5.Para começar, transfira a mosca adulta para um frasco vazio com um volume de cerca de 45 mililitros. Em seguida, mergulhe um aplicador de algodão na solução anestésica e coloque a varinha no frasco com a ponta de algodão logo abaixo da rolha de algodão. Aguarde três minutos.A mosca adulta será anestesiada por dois minutos e meio a três minutos e meio, dependendo do seu tamanho. Agora prepare uma lâmina de vidro com um pedaço de fita dupla-face. Em seguida, usando uma escova macia, mova a mosca anestesiada para a lâmina de vidro com o lado dorsal voltado para cima.Sob um microscópio de campo amplo, separe as asas usando uma pinça e cole-as na fita, expondo assim a região do coração para imagens. Agora, use a técnica de imagem descrita anteriormente para obter imagens do segmento A1 do coração e sacrificar a mosca no final do experimento. A imagem cardíaca longitudinal foi realizada usando moscas com uma cópia do driver 24B-GAL4.Nos estágios larvais, o tubo cardíaco começa na região abdominal posterior A8 com um lúmen mais amplo e termina no segmento dorsal anterior A1 com um diâmetro mais estreito. No final do PD2, uma câmara cônica começou a se desenvolver no segmento A1 a A4. A frequência cardíaca da mosca foi quantificada a partir das imagens transversais do modo M OCM.Curiosamente, durante os estágios de pupa, o coração parou de bater ocasionalmente. No geral, o batimento cardíaco diminuiu significativamente do estágio larval para o estágio de pupa e depois aumentou substancialmente da pupa para o adulto. Desde esse desenvolvimento, essa técnica deu aos pesquisadores no campo da cardiologia do desenvolvimento uma nova ferramenta para explorar os efeitos de vários genes no desenvolvimento do coração em modelos de Drosophila.Ao tentar este procedimento, é importante acompanhar cuidadosamente o desenvolvimento de uma Drosophila para criar imagens em cada estágio de desenvolvimento.

drosophila-preparation-longitudinal-imaging-heart-function-vivo-using

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