Um método eficiente para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes para Utilização em Análise Quantitativa do transcriptoma

O objetivo geral deste procedimento é extrair RNA de alta pureza de sementes de plantas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia de cereais, como a compreensão dos perfis genéticos, contendo os transcritos originais nas sementes. A principal vantagem dessa técnica é que os pesquisadores são capazes de preparar RNA altamente purificado com ligeira modificação no método baseado em coluna de rotação.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a alta quantidade de óleos, proteínas, carboidratos e polifenóis na peneira frontal dificulta o isolamento do RNA altamente purificado; demonstrando o procedimento estará Kazumi Hikino, um técnico do nosso laboratório. Para iniciar o experimento, adicione um por cento de peso por volume de PVP de grau de biologia molecular ao tampão de lise celular para extração de RNA e vortex a mistura vigorosamente. Incube o PVP por 20 minutos a 25 graus Celsius para dissolvê-lo completamente.

Após 20 minutos de incubação, misture o tampão suavemente virando o tubo de cabeça para baixo para evitar a formação de bolhas. Colha os frutos das plantas Arabidopsis thaliana e coloque-os em dois tubos de polipropileno de 1,5 milímetro no gelo, depois coloque os frutos em placas de alumínio mantidas a quatro graus Celsius e isole as sementes dos frutos sob um microscópio estereoscópico. Em seguida, coloque aproximadamente 200 sementes isoladas em tubos de polipropileno de 1,5 mililitro que foram previamente armazenados em uma prateleira de alumínio sobre gelo e coloque imediatamente os tubos em nitrogênio líquido.

Remova os tubos do nitrogênio líquido e coloque-os de volta na prateleira de alumínio no gelo. Adicione 100 microlitros de tampão PVP de um por cento a cada tubo e centrifugue os tubos por um minuto a 1000 vezes G, a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, homogeneizar a amostra com um pilão de aço inoxidável usando um moedor motorizado por 60 segundos, mantendo o tubo no rack de alumínio no gelo; em seguida, adicione 550 microlitros do tampão 100% PVP e vire suavemente o tubo de cabeça para baixo para misturar e incubar o tubo.

Após a incubação, centrifugue a solução e transfira 550 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 milímetro e centrifugue o sobrenadante. Transfira 450 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 milímetro. Use o sobrenadante como lisado celular para extração de RNA usando um kit disponível comercialmente.

Prepare uma prateleira de alumínio no gelo e descongele a mistura total de RNA batendo suavemente e, em seguida, coloque o tubo na prateleira. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume. Em seguida, dilua o RNA total em água livre de RNase.

Descongele o RNA total e os conjuntos de tampão do kit comercial, mantenha as enzimas do kit no gelo após batidas suaves. Prepare tubos de polipropileno de 0,2 mililitro livres de nuclease esterilizados para análise subsequente. No gelo, combine cinco microlitros de RNA total, um microlitro ou 50 micromolares de oligo DT primer e um microlitro, ou 50 micromolares aleatórios de seis mer no tubo de polipropileno de 0,2 mililitro.

Incube a mistura por 15 minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, coloque o tubo no gelo. Ajuste as concentrações de plasmídeo para modelos de DNA para as curvas padrão. Em seguida, dilua as soluções de CDNA de um a 100 com água destilada e, em seguida, adicione dois microlitros das soluções diluídas de CDNA e os plasmídeos previamente preparados para as curvas padrão à mistura principal do kit de PCR quantitativo em tempo real.

Por fim, configure o PCR em tempo real e insira as amostras. O RNA total foi isolado de aproximadamente 1.000 sementes usando concentrações variadas de tampão de lise celular, PVP. As quantidades e a pureza dos RNAs isolados demonstram que 1,0% de PVP é a concentração mais eficaz para isolar grandes quantidades de RNA purificado das sementes.

As concentrações, as razões A260 e A280 e as razões A260 A230 de RNA isolado de 200 sementes mostraram que este método foi melhor para isolar RNA altamente purificado de oito e 12 dias após o florescimento, ou sementes DAF. Embora as quantidades de transcritos enrugados e dependentes de açúcar sejam relativamente baixas em sementes em desenvolvimento, foi possível detectar mudanças de expressão entre sementes em diferentes estágios de desenvolvimento por meio de PCR em tempo real; Este método também é adequado para outras sementes oleaginosas, conforme demonstrado nesta tabela. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de biologia vegetal explorassem perfis de expressão gênica em alta concentração de reservas armazenadas, como sementes e frutos.