Name: Um método eficiente para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes para Utilização em Análise Quantitativa do transcriptoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprenda um método eficiente para isolar ARN altamente purificado a partir de sementes vegetais ricas em óleos, proteínas e polifenóis. Esta técnica modifica o método de coluna de centrifugação para análise de expressão gênica em biologia de cereais.

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Agradecemos à equipe de Genômica Funcional Facility e Espectrografia e BioImaging Facility, Nibb Núcleo Instalações de pesquisa, e para o modelo de pesquisa de plantas, Nibb Bioresource Center.

1. Extracção do ARN total de sementes de plantas <ol><li> Prepare conjuntos de buffer, colunas de spin, 1,5 e 2,0 tubos de polipropileno ml, e tubos de 1,5 mL de polipropileno livre de nuclease. </li><li> Adicionar 1% (w / v) de polivinilpirrolidona de grau de biologia molecular (daqui em diante referida como PVP) para a célula de tampão de lise para extracção de ARN e vortex vigorosamente. Incubar durante 20 min a 25 ° C para dissolver completamente. Após 20 min de incubação, misturam suavemente o tampão, rodando o tubo de cabeça para baixo para evitar a formação de bolhas. Armazenar à temperatura ambiente (15-25 ° C) antes do uso. </li><li> Frutos da colheita de plantas de Arabidopsis thaliana e coloque em 1,5 tubos de polipropileno ml em gelo. Coloque frutas em placas de alumínio mantida a 4 ° C e isolar a partir de sementes de frutos sob um microscópio estéreo. <ol><li> Coloque as sementes isoladas (aproximadamente 200 sementes) em tubos de polipropileno de 1,5 ml, que foram armazenados num bastidor de alumínio em gelo e imediatamente colocar os tubos em N líquidoitrogen. </li></ol></li><li> Retire os tubos do azoto líquido e devolvê-las para a cremalheira de alumínio em gelo. Adicionar 100 ul da solução tampão contendo 1% de PVP e centrifugar durante 1 min a 1000 xg, a 4 ° C. </li><li> Homogeneizar a amostra com um pilão de aço inoxidável usando um motor-moedor durante 60 s ao mesmo tempo manter o tubo no suporte de alumínio em gelo. </li><li> Adicionar 550 ul da solução tampão contendo 1% de PVP, misturar suavemente o tampão, rodando o tubo de cabeça para baixo, e incubar durante 10 min a 25 ° C. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 8000 xg a 25 ° C e transferência de 550 uL do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 mL. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 10.000 xg, a 25 ° C e transferência de 450 uL do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 mL. </li><li> Utilizar o sobrenadante como o lisado de células para extracção de ARN. Daqui por diante, seguir o processo descrito nas instruções do fabricante no kit disponível comercialmente. </li><li> Elui-se oRNA usando um volume mínimo de tampão de eluição para assegurar uma concentração suficientemente elevada de ARN para monitorizar os padrões de transcritos de baixo nível de expressão. Armazenar o ARN num congelador, até ser utilizado. </li></ol> 2. A verificação da RNA Qualidade <ol><li> Descongelar o RNA total, misture agitando ligeiramente, e colocar o tubo em um rack de alumínio no gelo. </li><li> Medir a concentração de ARN, razão A260 / A280 e razão A260 / A230 usando um espectrofotómetro microvolume. </li><li> Dilui-se o ARN total em água isenta de ARNase para uma concentração final de 70 ng / mL. </li></ol> 3. transcrição reversa do ARN total a partir de sementes <ol><li> Descongelar o RNA total e tampão conjuntos do kit comercial. Mantenha as enzimas do kit no gelo depois de toque suave. Prepare tubos de 0,2 mL de polipropileno livre de nuclease. </li><li> Adicionar 5 uL de ARN total, 1 ul de iniciador oligo dT (50 uM), e 1 uM de 6-meros aleatórios (50 uM) ao polypropy 0,2 mltubo de lene no gelo. </li><li> Incubar durante 15 min a 37 ° C e colocar em gelo. </li><li> Daqui por diante, seguir o processo descrito nas instruções do fabricante no kit de transcrição reversa-PCR. </li><li> Coloque os produtos de transcrição reversa em gelo antes do uso. </li></ol> 4. Análise Quantitativa-PCR em tempo real <ol><li> Construção de plasmídeos que albergam as sequências de genes alvo utilizando o protocolo do fabricante. </li><li> Ajustar as concentrações de 100-500,000 cópias / mL para moldes de ADN para as curvas padrão. </li><li> Dilui-se as soluções de cDNA (1: 100) com água destilada. </li><li> Adicionar 2 mL das soluções diluídas de ADNc e os plasmídeos para as curvas padrão para a mistura principal a partir do kit em tempo real quantitativa de PCR. </li><li> Definir-se-PCR em tempo real usando as seguintes condições de ciclo: 95 ° C durante 30 s e depois 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 35 s. </li><li> Analisar os números de cópias de acordo com o homeminstruções do ufacturer para o sistema de PCR em tempo real. </li></ol>

<ol><li>Hills, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+storage-product+synthesis+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of storage-product synthesis in seeds.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl-lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Acyl-lipid metabolism.</a> Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).</li>
<li>Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+pathways+in+seed+oil+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical pathways in seed oil synthesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).</li>
<li>Santos-Mendoza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+gene+regulatory+networks+that+control+seed+development+and+maturation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis.</a> Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).</li>
<li>Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+triacylglycerols+as+feedstocks+for+the+production+of+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plastidic+DEAD-box+RNA+helicase+22%2C+HS3%2C+is+essential+for+plastid+functions+both+in+seed+development+and+in+seedling+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth.</a> Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+oil+biosynthesis+during+the+mid-phase+of+seed+development+enhances+oil+content+in+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds.</a> Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).</li>
<li>Dekkers, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+reference+genes+for+RT-qPCR+expression+analysis+in+Arabidopsis+and+tomato+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds.</a> Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).</li>
<li>Salzman, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).</li>
<li>Vicient, C. M., Delseny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+total+RNA+from+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds.</a> Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).</li>
<li>Wang, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high+quality+RNA+from+cereal+seeds+containing+high+levels+of+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch.</a> Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).</li>
<li>Birtic, S., Kranner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-quality+RNA+from+polyphenol-%2C+polysaccharide-+and+lipid-rich+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds.</a> Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

perfis de expressão gênica contribuir para a nossa compreensão da fisiologia da planta; Assim, os métodos de isolamento de ARN específico foram desenvolvidas de cada amostra condição 9-12. Foram investigados os processos que foram inibidas durante o isolamento de ARN a partir de sementes e descobriram que o RNA se ligar a membranas de sílica foi severamente inibido. Grandes quantidades de óleo, proteínas e polifenóis inibem isolamento do RNA. Nós modificámos o processo de extracção de ARN para remover estes c...

As plantas produzem sementes, que dão origem à próxima geração. Sementes acumular grandes quantidades de reservas de armazenagem, tais como óleos, hidratos de carbono e proteínas, para o crescimento pós-germinativo. Os seres humanos utilizar as reservas de armazenamento de sementes como fontes de alimentos e ração animal, e, portanto, sementes de plantas são um dos principais fornecedores de matéria orgânica comestível em todo o mundo. Aumentar a produção de sementes é um desafio importante na ciência das plantas. Desde reservas de conservação das sementes são fontes de valor comercial de alimentos e materiais industriais, os mecanismos moleculares subjacentes à regulação do metabolismo destas reservas têm sido amplamente investigadas 1-6. Além disso elucidação desses mecanismos será útil para aumentar a produção de sementes de culturas. Sementes se desenvolvem nos ovários de plantas após a fertilização, e eles amadurecem através de uma série de estágios de desenvolvimento 1,6,7. Para compreender melhor o desenvolvimento mecanismo molecular subjacente de sementes requer detalhada, Perfis de expressão de gene precisas de uma série de desenvolvimento de sementes a ser produzido. No entanto, as elevadas quantidades de óleos, proteínas, hidratos de carbono, e polifenóis em sementes de plantas tornar-se difícil de isolar ARN altamente purificada, o que se opõe perfil preciso da expressão do gene. Aqui, nós apresentamos um método eficiente para o isolamento de ARN a partir de sementes oleaginosas que contenham grandes quantidades de óleos, proteínas e polifenóis. Usando este método, os pesquisadores serão capazes de preparar RNA altamente purificada. Tal RNA será útil para monitorar mudanças de transcrição dos genes-chave que controlam a regulação metabólica das reservas de armazenagem de sementes no desenvolvimento e oleaginosas maduras.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plant Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>polivinilpirrolidona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288-100G</td><td></td></tr><tr><td>HOMOGENEIZADOR S-303</td><td>COMO UM</td><td>1-1133-02</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-NDL-US-CAN</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td><td>TAKARA</td><td>RR037A</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Kit de qPCR rápido</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK4601</td><td></td></tr></tbody></table>

um método eficiente para o isolamento de arn altamente purificada a partir de sementes para utilização em análise quantitativa do transcriptoma

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

As sementes das plantas acumulam grandes quantidades de reservas de armazenamento contendo matéria orgânica biodegradável. Os humanos dependem de reservas de armazenamento de sementes para alimentos e materiais industriais. Os perfis de expressão gênica são ferramentas poderosas para investigar a regulação metabólica em células vegetais. Portanto, perfis de expressão gênica detalhados e precisos durante o desenvolvimento da semente são necessários para o melhoramento de culturas. A aquisição de RNA altamente purificado é essencial para a produção desses perfis. Métodos eficientes são necessários para isolar o RNA altamente purificado das sementes. Aqui, descrevemos um método para isolar RNA de sementes contendo grandes quantidades de óleos, proteínas e polifenóis, que têm efeitos inibitórios no isolamento de RNA de alta pureza. Nosso método permite que RNA altamente purificado seja obtido de sementes sem o uso de fenol, clorofórmio ou processos adicionais para purificação de RNA. Este método é aplicável a sementes de Arabidopsis, colza e soja. Nosso método será útil para monitorar os padrões de expressão de transcritos de baixo nível em sementes em desenvolvimento e maduras.

Em primeiro lugar, investigou a melhor concentração de PVP usando Arabidopsis sementes maduras. O ARN total foi isolado a partir de cerca de 1000 sementes de acordo com o protocolo descrito acima, utilizando tampão de lise celular contendo 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% de PVP. Após homogeneização e centrifugação, o sobrenadante foi recolhido, evitando a camada de óleo e detritos de sementes (Figura 1A). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

Conseguimos estabelecer um método para isolamento de RNA de sementes de plantas contendo grandes quantidades de óleos, proteínas e polifenóis, que têm efeitos inibitórios no isolamento de RNA de alta pureza. Nosso método é adequado para monitorar a expressão de genes com transcritos de baixo nível em sementes.

Um método eficiente para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes para Utilização em Análise Quantitativa do transcriptoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

O objetivo geral deste procedimento é extrair RNA de alta pureza de sementes de plantas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia de cereais, como a compreensão dos perfis genéticos, contendo os transcritos originais nas sementes. A principal vantagem dessa técnica é que os pesquisadores são capazes de preparar RNA altamente purificado com ligeira modificação no método baseado em coluna de rotação.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a alta quantidade de óleos, proteínas, carboidratos e polifenóis na peneira frontal dificulta o isolamento do RNA altamente purificado; demonstrando o procedimento estará Kazumi Hikino, um técnico do nosso laboratório. Para iniciar o experimento, adicione um por cento de peso por volume de PVP de grau de biologia molecular ao tampão de lise celular para extração de RNA e vortex a mistura vigorosamente. Incube o PVP por 20 minutos a 25 graus Celsius para dissolvê-lo completamente.Após 20 minutos de incubação, misture o tampão suavemente virando o tubo de cabeça para baixo para evitar a formação de bolhas. Colha os frutos das plantas Arabidopsis thaliana e coloque-os em dois tubos de polipropileno de 1,5 milímetro no gelo, depois coloque os frutos em placas de alumínio mantidas a quatro graus Celsius e isole as sementes dos frutos sob um microscópio estereoscópico. Em seguida, coloque aproximadamente 200 sementes isoladas em tubos de polipropileno de 1,5 mililitro que foram previamente armazenados em uma prateleira de alumínio sobre gelo e coloque imediatamente os tubos em nitrogênio líquido.Remova os tubos do nitrogênio líquido e coloque-os de volta na prateleira de alumínio no gelo. Adicione 100 microlitros de tampão PVP de um por cento a cada tubo e centrifugue os tubos por um minuto a 1000 vezes G, a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, homogeneizar a amostra com um pilão de aço inoxidável usando um moedor motorizado por 60 segundos, mantendo o tubo no rack de alumínio no gelo; em seguida, adicione 550 microlitros do tampão 100% PVP e vire suavemente o tubo de cabeça para baixo para misturar e incubar o tubo.Após a incubação, centrifugue a solução e transfira 550 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 milímetro e centrifugue o sobrenadante. Transfira 450 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de polipropileno de 1,5 milímetro. Use o sobrenadante como lisado celular para extração de RNA usando um kit disponível comercialmente.Prepare uma prateleira de alumínio no gelo e descongele a mistura total de RNA batendo suavemente e, em seguida, coloque o tubo na prateleira. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume. Em seguida, dilua o RNA total em água livre de RNase.Descongele o RNA total e os conjuntos de tampão do kit comercial, mantenha as enzimas do kit no gelo após batidas suaves. Prepare tubos de polipropileno de 0,2 mililitro livres de nuclease esterilizados para análise subsequente. No gelo, combine cinco microlitros de RNA total, um microlitro ou 50 micromolares de oligo DT primer e um microlitro, ou 50 micromolares aleatórios de seis mer no tubo de polipropileno de 0,2 mililitro.Incube a mistura por 15 minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, coloque o tubo no gelo. Ajuste as concentrações de plasmídeo para modelos de DNA para as curvas padrão. Em seguida, dilua as soluções de CDNA de um a 100 com água destilada e, em seguida, adicione dois microlitros das soluções diluídas de CDNA e os plasmídeos previamente preparados para as curvas padrão à mistura principal do kit de PCR quantitativo em tempo real.Por fim, configure o PCR em tempo real e insira as amostras. O RNA total foi isolado de aproximadamente 1.000 sementes usando concentrações variadas de tampão de lise celular, PVP. As quantidades e a pureza dos RNAs isolados demonstram que 1,0% de PVP é a concentração mais eficaz para isolar grandes quantidades de RNA purificado das sementes.As concentrações, as razões A260 e A280 e as razões A260 A230 de RNA isolado de 200 sementes mostraram que este método foi melhor para isolar RNA altamente purificado de oito e 12 dias após o florescimento, ou sementes DAF. Embora as quantidades de transcritos enrugados e dependentes de açúcar sejam relativamente baixas em sementes em desenvolvimento, foi possível detectar mudanças de expressão entre sementes em diferentes estágios de desenvolvimento por meio de PCR em tempo real; Este método também é adequado para outras sementes oleaginosas, conforme demonstrado nesta tabela. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de biologia vegetal explorassem perfis de expressão gênica em alta concentração de reservas armazenadas, como sementes e frutos.

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