Name: Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a isolar matriz extracelular cardíaca e realizar estudos de vasodilatação ex vivo em camundongos tight-skin. Este método permite avaliar os efeitos do peptídeo inibidor de IRF5 na progressão de doenças cardiovasculares.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) e HL-102836 (KAP) e Cimphoni Life Sciences (parte do salário de DW). Os autores agradecem a Meghann Sytsma pela edição do manuscrito.

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<li>Krausgruber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+promotes+inflammatory+macrophage+polarization+and+TH1-TH17+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses.</a> Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).</li>
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<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
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<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O objetivo era projetar um inibidor IRF5 para elucidar o papel do IRF5 sobre a inflamação, fibrose e função vascular nos corações de TSK / + camundongos. As descobertas são que IRF5D não induziu a proliferação ou a apoptose. Além disso, a inflamação foi reduzida e a função vascular melhorada. Estes dados sugerem que IRF5 desempenha um papel mecanicista importante no desenvolvimento de inflamação e fibrose no coração de TSK / + ratinhos e que tem o potencial de servir como um alvo terapêutico. <p class="jove_content"...

<html> Regulação do crescimento celular e as respostas imunitárias de morte celular é central para o papel da famia do factor de transcrição de factores de regulação de interferão. IRF5 é destacada como sendo crucial para a regulação de respostas imunes entre o tipo 1, uma resposta promover inflamatória e tipo 2, uma reparação tecidual resposta imune alvo. IRF5 é chave no cancro 1, autoimunidade e 2, 3, 4, 5. O mouse apertado-pele (Tsk / +) é um modelo para a fibrose do tecido e esclerodermia devido a uma mutação de duplicação no gene fibrilina-1. Esta mutação resulta em uma apertada-pele e um aumento do tecido conjuntivo. Estes ratinhos desenvolvem inflamação do miocárdio, fibrose e insuficiência cardíaca, finalmente, 5, 6, 7,&gt; 8, 9. A esclerodermia é uma doença fibrótica autoimune que afecta cerca de 150.000 pacientes nos Estados Unidos 6. As principais características desta doença são a fibrose dos órgãos internos, incluindo o coração 7, 8, 9, 10, 11. A natureza do estudo exigiram a concepção de um peptídeo inibidor. A abordagem software foi escolhido em detrimento de uma abordagem tradicional usando uma exibição de fagos. A abordagem de software é mais fácil e menos demorado. O banco de dados RCSB é usado para identificar os sítios de ligação apropriados 12. Para estudar a interação do peptídeo recém-projetado com a proteína recombinante e concentrar-se nos parâmetros de ligação, foi usada uma técnica chamada interferometria biolayer. Biolayer interferometria é um biossensor baseado technique que determina a afinidade de ligação, de associação e dissociação usando um biossensor e uma amostra de ligação. O biossensor pode ser fluorescente, luminescently, radiometricamente e colorimetricamente marcado. A medição baseia-se na adição de massa ou assemelha-se a depleção de associação e de dissociação 13, 14. O objetivo deste estudo foi compreender o papel da IRF5 na inflamação do miocárdio e fibrose. O objetivo era ter uma visão sobre o papel da IRF5 no desenvolvimento de fibrose tecidual e esclerodermia.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG anticorpo&nbsp;</td><td>Reagente Bardford Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp;</td></tr><tr><td>Biosensors</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 Substrate</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>diluição 1:1.000 em PBS</td></tr><tr><td>burro anti rato Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>diluição 1:1.000 em PBS</td></tr><tr><td>ECL mais</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Depois de muita tentativa e erro, voltamos a este</td></tr><tr><td>microscópio Eclipse TE 200-U com software de varredura a laser EZ C1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cabra anti coelho Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Diluição 1:1.000 em PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anti-cabra</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:Diluição de 10.000 em TBS</td></tr><tr><td>HRP burro anti-camundongo</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>Diluição 1:10.000 em</td></tr><tr><td>TBS ICAM-1corpo</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>Diluição 1:200 em</td></tr><tr><td>PBS IRF5 anticorpo (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de micro placas Elx800</td><td>Marcador</td> de neutrófilos NIMP da Biotek <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>Diluição 1:200 em</td></tr><tr><td>PBS Octeto RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>ligação à proteína-proteína</td></tr><tr><td>Design de peptídeo&nbsp; Software Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Síntese de proteína IRF5 recombinante</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>expressão de proteínas, serviço de síntese</td></tr><tr><td>dodecil fosfato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Farmácia</td><td></td><td>Cetamina Programação III substância controlada, prescipção necessária&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Microscópio Estéreo Zoom de Dissecção Trinocular com Luzes LED</td><td>Gooseneck Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de Dessalinização Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endotelial Basal Media EBM Bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>contém fontes de crescimento</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo software</td><td>Medit, Palaiseau, França</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do mice tight-pele

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

O fator regulador do interferon 5 (IRF5) é crucial para as células determinarem se respondem de forma pró-inflamatória ou anti-inflamatória. A capacidade do IRF5 de mudar as células de um caminho para outro é altamente atraente como alvo terapêutico. Projetamos um peptídeo chamariz IRF5D com um software de modelagem molecular para projetar pequenas moléculas e peptídeos.
IRF5D inibiu IRF5, reduziu alterações na matriz extracelular e melhorou a vasodilatação endotelial no camundongo de pele apertada (Tsk/+). O Kd de IRF5D para IRF5 recombinante é 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, conforme determinado por experimentos de ligação usando experimentos de interferometria de biocamada. A proliferação e apoptose de células endoteliais (CE) permaneceram inalteradas usando concentrações crescentes de IRF5D (0 a 100 μg / mL, 24 h). Camundongos Tsk/+ foram tratados com IRF5D (1 mg/kg/d por via subcutânea, 21 d). As expressões de IRF5 e ICAM diminuíram após o tratamento com IRF5D. A função endotelial foi melhorada conforme avaliado pela vasodilatação das artérias faciais de camundongos Tsk / + tratados com IRF5D em comparação com camundongos Tsk / + sem tratamento com IRF5D. Como fator de transcrição, o IRF5 trafega do citosol para o núcleo. A translocação foi avaliada por imuno-histoquímica em miócitos cardíacos cultivados nas diferentes matrizes extracelulares cardíacas. O tratamento com IRF5D do camundongo Tsk/+ resultou em um número reduzido de núcleos positivos para IRF5 em comparação com os animais sem tratamento com IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Essas descobertas demonstram o importante papel que o IRF5 desempenha na inflamação e fibrose em camundongos Tsk / +.

Os resultados demonstrados na Figura 1 mostra como criar um peptídeo. A Figura 1, superior esquerdo, mostra a região (entre os 2 setas amarelas, aminoácidos (aa) 425-436) em IRF5 que é fosforilado por um número de quinases. Figura 1, canto superior direito, mostra um oval amarelo onde domínio fosforilada de IRF5 liga. A estrutura dimérica de 3DSH foi rodado para observar uma fenda ou vale para a esquerda da hélice 2 (aa303-312). Isto é, ...

Descrevemos o isolamento da matriz extracelular cardíaca de camundongos controle C57Bl/6J, camundongos de pele apertada e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5. Também descrevemos os estudos de vasodilatação nos vasos isolados de C57Bl / 6J, camundongos de pele firme e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5.

Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

O objetivo geral desses procedimentos para isolamento da matriz extracelular e vasodilatação ex vivo é estudar o tratamento com peptídeo inibitório de IRF5 em roedores. Este método pode ajudar a responder como alterações na matriz extracelular podem potencializar ou atenuar a progressão da doença. A principal vantagem dos estudos de vasodilatação é fornecer uma visão sobre processos in vivo sem a necess游戏副本O isolamento da matriz extracelular cardíaca pode ser aplicado a outros órgãos, como a pata traseira ou o pulmão. Tivemos essa ideia pela primeira vez quando começamos a investigar a duplicação da fibrilina um no camundongo com pele rígida e reconhecemos o impacto da matriz extracelular alterada e do comportamento celular. Após anestesiar o camundongo e prepará-lo para a cirurgia, abra a pele usando uma tesoura.Cortar da região do peito até a lateral do maxilar com cuidado para não perturbar o tecido subjacente na parte frontal da mandíbula. Em seguida, dissecar a artéria fascialis removendo o tecido mole ao seu redor. Durante esse procedimento, tomar cuidado para não danificar a artéria.Mergulhe o tecido exposto em tampão mops para que permaneça saudável. Uma vez que a artéria fascialis tenha sido completamente exposta, segure-a proximal à primeira bifurcação distal ao local onde a artéria será cortada. Em seguida, corte-a da artéria principal e segure a artéria fascialis com a pinça.Corte os dois ramos que saem do fascialis e, em seguida, levante suavemente o vaso, seccionando as conexões com o tecido circundante até alcançar a bifurcação. Na bifurcação, corte ambas as artérias filhas para liberar o vaso e transfira-o para um recipiente com tampão mops, onde permanecerá hidratado até o uso. Para medir a vasodilatação, prepare-se primeiramente para canular os vasos.Carregue pipetas de vidro com diâmetro terminal de 125 a 175 mícrons completamente com tampão mops. Também preencha os reservatórios de solução com mops. Agora canule os vasos isolados.Fixe-os em pipetas de vidro usando sutura oftálmica. Certifique-se de prevenir a formação de bolhas de ar nas pipetas. Em seguida, monte as câmaras de vaso em um microscópio invertido com o acoplamento da câmera de vídeo.Execute o vídeo no sistema de medição com paquímetro de vídeo para obter uma medida na tela dos vasos. Agora, pressurize os vasos utilizando um processo em duas etapas. Primeiro, eleve os reservatórios cheios de mops a uma altura acima do vaso, gerando uma pressão de 20 milímetros de mercúrio.Abra a linha com os mopslines até o vaso. À medida que o vaso for pressurizado, verifique sinais de vazamento ao redor das amarras e ao longo do comprimento do vaso. Caso não sejam encontrados vazamentos, eleve os reservatórios para gerar uma pressão de 60 milímetros de mercúrio.Em seguida, inspecione os vasos quanto a vazamentos novamente. Uma vez que a pressão seja mantida sem vazamentos, equilibre o vaso por 30 minutos nesta pressão. Após o equilíbrio, meça a vasodilatação em resposta a um composto de interesse.Primeiro, constrinja o vaso em metade a três quartos pela adição de U46619. Deixe a solução banhar os vasos por seis minutos para estabilizar. Em seguida, adicione gradualmente o composto em teste à solução do banho, como a acetilcolina.A cada dois minutos, aumente a concentração da solução-teste no banho em 10, começando em 0,00001 molar e progredindo até 0,01 molar. As alterações na vasodilatação levantaram questões sobre sinalização. Mas nosso foco está no coração.Para reduzir o uso de animais, optamos por isolar a matriz extracelular cardíaca para focar nos sinais iniciados a partir do exterior. Comece coletando o coração de um camundongo anestesiado. Transfira-o para um béquer contendo 15 mililitros de dodecilsulfato de sódio a um por cento hipertônico.Mantenha a solução sob agitação suave em um agitador magnético à temperatura ambiente por 18 horas. No dia seguinte, troque a solução por 15 mililitros de Triton X100 a 5% durante 30 minutos, seguido por 15 mililitros de PBS durante 15 minutos. Em seguida, congele rapidamente a MEC em nitrogênio líquido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Uma vez congelado, transfira o tecido para um almofariz e pistilo previamente resfriados e triture-o até obter um pó. Suspenda o pó em PBS com antibiótico adicionado na concentração de 1:100 em uma solução viscosa. Sonique a suspensão por 30 a 60 segundos em banho de gelo, em potência alta de sonicação.A proteína da MEC agora está isolada e deve permanecer fria. Antes de usar a proteína, meça sua concentração utilizando um ensaio de Bradford. O peptídeo IRF5D é um peptídeo inibitório que difere amplamente do IRF5 normal.IRF5D possui apenas 17 aminoácidos e se liga ao sítio de fosforilação de IRF5. Isso impede a fosforilação e a homodimerização, interferindo, portanto, na formação do estado ativo de IRF5. Camundongos heterozigotos com pele apertada foram tratados com IRF5D por via subcutânea durante três semanas.O número de neutrófilos e de CD64 foi reduzido, conforme determinado por imunohistoquímica, com base no número médio de células coradas por campo microscópico. Os tratamentos com IRF5D melhoraram a vasodilatação induzida por acetilcolina em artérias fasciais de camundongos heterozigotos com pele apertada tratados com IRF5D, em comparação com aqueles tratados com tampão fosfato. Em miócitos cultivados derivados do tecido cardíaco de camundongos transgênicos, houve um maior número de células positivas para IRF5 em culturas provenientes de camundongos heterozigotos com pele apertada do que em camundongos controle.O tratamento de qualquer cultura com IRF5D resultou na redução de núcleos positivos para IRF5. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como descelularizar um coração. Uma vez dominada, esta técnica pode ser transposta para muitos órgãos e auxiliar na resposta a diversas questões. E lembre-se de que é importante não superdigerir a matriz.Você também deve ter um bom entendimento de como dissecar e suspender a artéria fascialis. Uma vez dominada, esta técnica deve levar aproximadamente 60 minutos e pode ser utilizada em praticamente qualquer leito vascular. É importante lembrar o quão frágil é o endotélio; prossiga com cautela durante a dissecação.Não é incomum encontrar músculo liso saudável e endotélio danificado.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.

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A janela da câmara de dobras cutâneas dorsal murino apresentado visualiza uma zona de isquemia aguda persistente de um retalho musculocutâneo. Intravital epi-fluorescência licenças de microscopia para avaliação direta e repetitiva da microcirculação e quantificação de hemodinâmica. Morfológica e resultados hemodinâmicos podem ainda ser correlacionados com análises histológicas e moleculares.

Lesão tecido isquêmico na Skinfold Câmara do mouse Dorsal: Um Modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente

O objectivo deste protocolo é demonstrar as técnicas de isolamento e cultivo de células musculares murino primários liso vascular (VSMC) da circulação coronária. Uma vez que as VSMCs foram isolados, eles podem ser usados ​​para várias técnicas de cultura convencionais.

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