Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele
24 de março de 2017
Descrevemos o isolamento da matriz extracelular cardíaca de camundongos controle C57Bl/6J, camundongos de pele apertada e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5. Também descrevemos os estudos de vasodilatação nos vasos isolados de C57Bl / 6J, camundongos de pele firme e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5.
O objetivo geral desses procedimentos para isolamento da matriz extracelular e vasodilatação ex vivo é estudar o tratamento com peptídeos inibitórios de IRF5 em roedores. Este método pode ajudar a responder como as mudanças na matriz extracelular podem aumentar ou atenuar a progressão da doença. A principal vantagem dos estudos de vasodilatação é nos dar uma visão dos processos in vivo sem ter que levar em consideração todos os componentes de sinalização.
O isolamento da matriz extracelular cardíaca pode ser aplicado a outros órgãos, como membros posteriores ou pulmão. Tivemos a ideia pela primeira vez quando começamos a nos concentrar na duplicação da fibrilina um no camundongo de pele apertada e reconhecemos o impacto da matriz extracelular alterada e do comportamento celular. Depois de anestesiar o mouse e prepará-lo para a cirurgia, abra a pele usando uma tesoura.
Corte do tórax para a lateral ao maxilar com cuidado para não perturbar o tecido subjacente em direção à frente da mandíbula. Em seguida, disseque a artéria fascial removendo o tecido mole ao seu redor. Ao fazer isso, tome cuidado para evitar danificar a artéria.
Banhe o tecido exposto em um tampão de esfregão para que permaneçam saudáveis. Uma vez que a artéria fascial tenha sido totalmente exposta, segure a fascial proximal à primeira bifurcação distal ao local onde a artéria será cortada. Em seguida, corte-o da artéria-mãe e segure a artéria fascial com a pinça.
Corte os dois ramos que saem do fascial e, em seguida, levante suavemente o vaso enquanto corta as conexões com o tecido circundante até que a bifurcação seja alcançada. Na bifurcação, corte as duas artérias-filhas para liberar o vaso e transfira-o para um prato de tampão de esfregão, onde permanecerá hidratado até que seja necessário. Para medir a vasodilatação, primeiro prepare-se para canular os vasos.
Carregue pipetas de vidro com um diâmetro terminal de 125 a 175 mícrons cheias de tampão de esfregonas. Encha também os reservatórios de solução com esfregões. Agora canule os vasos isolados.
Amarre-os em pipetas de vidro usando sutura oftálmica. Certifique-se de evitar a formação de bolhas de ar nas pipetas. Em seguida, monte as câmaras dos vasos em um microscópio invertido com o acessório da câmera de vídeo.
Execute o vídeo através do sistema de medição do paquímetro de vídeo para uma medição na tela dos recipientes. Agora pressurize os vasos usando um processo de duas etapas. Primeiro, levante os reservatórios cheios de esfregões a uma altura acima do vaso para 20 milímetros de mercúrio de pressão.
Abra a linha com os esfregões para o recipiente. À medida que o vaso pressuriza, procure sinais de vazamento ao redor dos dormentes e ao longo do comprimento do vaso. Se nenhum vazamento for encontrado, eleve os reservatórios para produzir 60 milímetros de mercúrio de pressão.
Em seguida, inspecione os vasos quanto a vazamentos novamente. Uma vez que a pressão é mantida sem vazamentos, equilibre o vaso por 30 minutos a essa pressão. Depois de equilibrado, meça a vasodilatação em resposta a um composto de interesse.
Primeiro, contraia o navio em metade a três quartos, adicionando U46619. Deixe a solução banhar os recipientes por seis minutos para estabilizar. Em seguida, adicione gradualmente o composto de teste à solução do banho, como acetilcolina.
De dois em dois minutos, aumentar a concentração da solução de ensaio no banho em 10, começando em 000001 molar e progredindo até 001 molar. As mudanças na vasodilatação levantaram questões sobre a sinalização. Mas nosso foco está no coração.
Para reduzir o uso de animais, optamos por isolar a matriz extracelular cardíaca para focar na sinalização iniciada de fora. Comece coletando o coração de um camundongo anestesiado. Transfira-o para um copo carregado com 15 mililitros de dodecil sulfato de sódio hipertônico a um por cento.
Mantenha a solução mexendo suavemente em uma placa de agitação em temperatura ambiente por 18 horas. No dia seguinte, troque a solução para 15 mililitros de 5% de triton X100 por 30 minutos, seguido de 15 mililitros de PBS por 15 minutos. Em seguida, congele o ECM e o nitrogênio líquido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Depois de congelado, transfira o tecido para um almofariz e pilão pré-resfriados e triture-o em pó. Suspenda o pó em PBS com antibiótico adicionado a uma concentração de 1:100 em uma solução viscosa. Sonicar a suspensão durante 30 a 60 segundos num banho de gelo a uma temperatura de alta sonicação.
A proteína ECM agora está isolada e deve permanecer fria. Antes de usar a proteína, meça sua concentração usando um ensaio de Bradford. O peptídeo IRF5D é um peptídeo inibitório que difere muito do IRF5 normal.
O IRF5D tem apenas 17 aminoácidos e se liga ao local de fosforilação do IRF5. Isso evita a fosforilação e a homodimerização, interferindo na formação do estado ativo IRF5. Camundongos heterozigotos de pele apertada foram tratados com IRF5D por via subcutânea por três semanas.
O número de neutrófilos e CD64 foi diminuído conforme determinado por imuno-histoquímica no número médio de células coradas por campo de visão. Os tratamentos com IRF5D melhoraram a vasodilatação induzida por acetilcolina das artérias fasciais em camundongos heterozigotos de pele apertada tratados com IRF5D em comparação com aqueles tratados com tampão fosfato. Em miócitos cultivados derivados do tecido cardíaco dos camundongos transgênicos, havia mais células positivas para IRF5 em culturas de camundongos heterozigotos de pele apertada do que em camundongos controle.
O tratamento de qualquer cultura com IRF5D resultou em uma redução de núcleos positivos para IRF5. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como descelularizar um coração. Uma vez dominada, essa técnica pode ser transposta para muitos órgãos e ajudar a responder a uma variedade de perguntas E lembre-se de que é importante não digerir demais a matriz.
Você também deve ter uma boa compreensão de como dissecar e pendurar a artéria fascial. Uma vez dominada, essa técnica deve levar aproximadamente 60 minutos e pode ser usada em praticamente qualquer leito vascular. É importante lembrar o quão frágil é o endotélio, proceda com cautela durante a dissecção.
Não é incomum ter músculo liso saudável e endotélio danificado.
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Visão Geral
Este artigo descreve o isolamento da matriz extracelular cardíaca de diversos modelos de camundongos e os subsequentes estudos de vasodilatação. O foco está em compreender os efeitos do tratamento com peptídeo inibidor de IRF5 na progressão da doença.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Cardiovascular
- Pesquisa sobre Matriz Extracelular
Antecedentes
- O isolamento da matriz extracelular é fundamental para estudar seu papel nas doenças.
- IRF5 está implicado na progressão de certas doenças.
- Camundongos com pele tensa exibem propriedades alteradas da matriz extracelular.
- Estudos de vasodilatação fornecem insights sobre a função vascular.
Objetivo do Estudo
- Isolar a matriz extracelular cardíaca para análises adicionais.
- Avaliar o impacto do peptídeo inibidor de IRF5 nas respostas vasculares.
- Compreender como as alterações na matriz extracelular afetam a progressão da doença.
Métodos Utilizados
- Isolamento da matriz extracelular cardíaca de modelos de camundongos.
- Estudos de vasodilatação ex vivo em vasos isolados.
- Comparação das respostas entre camundongos controle e tratados.
- Preparo cirúrgico de camundongos para isolamento da matriz.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido da matriz extracelular cardíaca de diferentes linhagens de camundongos.
- As respostas de vasodilatação variaram entre camundongos controle e tratados com o peptídeo IRF5.
- Conhecimentos adquiridos sobre o papel da matriz extracelular na função vascular.
- Aplicações potenciais do método de isolamento para outros órgãos.
Conclusões
- O estudo destaca a importância da matriz extracelular na saúde cardiovascular.
- O tratamento com peptídeo inibidor de IRF5 mostra potencial para modificar respostas vasculares.
- São necessárias pesquisas adicionais para explorar as implicações para o manejo de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a desmistificação mecanicista de IRF5 como alvo terapêutico ao associar o remodelamento da matriz extracelular à disfunção vascular na fibrose inflamatória. O ensaio de vasodilatação ex vivo fornece leituras quantitativas e reproduzíveis da função endotelial, independentes de fatores de confusão sistêmicos, apoiando a validação de alvos em modelos pré-clínicos. O isolamento da matriz extracelular relevante para a doença facilita a triagem fenotípica e a elucidação de vias para a descoberta de fármacos anti-fibróticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia a hipótese terapêutica de que a inibição de IRF5 reduz a sinalização pró-inflamatória e o depósito de matriz extracelular em camundongos com pele apertada.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional do alvo por meio da medição da translocação nuclear de IRF5 e da expressão downstream de ICAM em miócitos cardíacos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólio ao demonstrar a melhora da vasodilatação endotelial como biomarcador funcional do engajamento do alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: A matriz extracelular cardíaca isolada fornece um sistema padronizado e relevante para doenças, para avaliar os efeitos de compostos sobre o comportamento celular e sinalização.
- Saída Quantitativa: Medidas de vasodilatação ex vivo utilizando curvas dose-resposta à acetilcolina permitem avaliação precisa da função endotelial em artérias faciais isoladas.
- Reutilização da Plataforma: O protocolo de isolamento de MEC pode ser adaptado para membros posteriores, pulmão ou outros leitos vasculares, para apoiar a validação cruzada de alvos em diferentes órgãos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para a Doença: Utiliza o modelo de camundongo com pele apertada, que apresenta fibrose e disfunção vascular análogas à esclerodermia humana.
- Continuidade Translacional: Associa a inibição de IRF5 à redução de alterações na matriz extracelular e à melhoria da vasodilatação, apoiando a desmistificação mecanicista para a translação clínica.
- Utilidade do Modelo Pré-clínico: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco, demonstrando melhoria mediada pelo alvo na função vascular após administração subcutânea crônica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação da eficácia pré-clínica, permitindo o design iterativo de compostos moduladores de IRF5 com base em fenótipos vasculares e da matriz.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento da matriz extracelular para estudar a sinalização de fora para dentro que induz a ativação de IRF5 e respostas pró-inflamatórias.
- Triagem: Fornece tecidos vasculares prontos para ensaios com respostas reprodutíveis de vasodilatação para avaliação da potência e seletividade de compostos.
- Análises: Oferece medidas quantitativas de variáveis dependentes (alterações no diâmetro do vaso) e resultados estatísticos (CE50, porcentagem de vasodilatação) para comparar os efeitos de tratamentos entre grupos.
- Pesquisa Translacional: Conecta o engajamento do alvo molecular (redução nuclear de IRF5) a desfechos em nível tecidual (remodelação da matriz extracelular) e melhora funcional (vasodilatação) em um sistema relevante para a doença.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável para estudar interações entre matriz extracelular e vasos sanguíneos em múltiplos sistemas orgânicos e modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar a função vascular de variáveis sistêmicas, aumentando a confiança nas relações entre alvo e doença.
- Valor Operacional: Padroniza os procedimentos de vasodilatação e isolamento da MEC, aprimorando a reprodutibilidade entre laboratórios e permitindo colaboração multifuncional.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao associar a inibição do alvo a desfechos funcionais vasculares, reduzindo o risco biológico em estágios avançados nos programas de fibrose.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapias direcionadas ao IRF5 com base na melhoria demonstrada da função endotelial e da homeostase da matriz.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em dissecação microvascular, miografia de pressão e bioquímica da matriz extracelular.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo sistemas de paquímetro de vídeo, microscópios invertidos e reservatórios de pressão para estudos de vasodilatação.
- Necessita padronização no manuseio de tecidos, composição do tampão (MOPS) e protocolos de contração (pré-constricção com U46619) para garantir comparabilidade dos dados.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o isolamento da MEC em tecidos não cardíacos, incluindo a otimização de reagentes de descelularização (SDS, Triton X-100) e da duração.
- Limitação prática: A fragilidade do endotélio isolado exige técnica meticulosa para evitar danos mecânicos durante a cânulação e pressurização do vaso.
