Name: Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a isolar matriz extracelular cardíaca e realizar estudos de vasodilatação ex vivo em camundongos tight-skin. Este método permite avaliar os efeitos do peptídeo inibidor de IRF5 na progressão de doenças cardiovasculares.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) e HL-102836 (KAP) e Cimphoni Life Sciences (parte do salário de DW). Os autores agradecem a Meghann Sytsma pela edição do manuscrito.

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<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
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<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O objetivo era projetar um inibidor IRF5 para elucidar o papel do IRF5 sobre a inflamação, fibrose e função vascular nos corações de TSK / + camundongos. As descobertas são que IRF5D não induziu a proliferação ou a apoptose. Além disso, a inflamação foi reduzida e a função vascular melhorada. Estes dados sugerem que IRF5 desempenha um papel mecanicista importante no desenvolvimento de inflamação e fibrose no coração de TSK / + ratinhos e que tem o potencial de servir como um alvo terapêutico. <p class="jove_content"...

<html> Regulação do crescimento celular e as respostas imunitárias de morte celular é central para o papel da famia do factor de transcrição de factores de regulação de interferão. IRF5 é destacada como sendo crucial para a regulação de respostas imunes entre o tipo 1, uma resposta promover inflamatória e tipo 2, uma reparação tecidual resposta imune alvo. IRF5 é chave no cancro 1, autoimunidade e 2, 3, 4, 5. O mouse apertado-pele (Tsk / +) é um modelo para a fibrose do tecido e esclerodermia devido a uma mutação de duplicação no gene fibrilina-1. Esta mutação resulta em uma apertada-pele e um aumento do tecido conjuntivo. Estes ratinhos desenvolvem inflamação do miocárdio, fibrose e insuficiência cardíaca, finalmente, 5, 6, 7,&gt; 8, 9. A esclerodermia é uma doença fibrótica autoimune que afecta cerca de 150.000 pacientes nos Estados Unidos 6. As principais características desta doença são a fibrose dos órgãos internos, incluindo o coração 7, 8, 9, 10, 11. A natureza do estudo exigiram a concepção de um peptídeo inibidor. A abordagem software foi escolhido em detrimento de uma abordagem tradicional usando uma exibição de fagos. A abordagem de software é mais fácil e menos demorado. O banco de dados RCSB é usado para identificar os sítios de ligação apropriados 12. Para estudar a interação do peptídeo recém-projetado com a proteína recombinante e concentrar-se nos parâmetros de ligação, foi usada uma técnica chamada interferometria biolayer. Biolayer interferometria é um biossensor baseado technique que determina a afinidade de ligação, de associação e dissociação usando um biossensor e uma amostra de ligação. O biossensor pode ser fluorescente, luminescently, radiometricamente e colorimetricamente marcado. A medição baseia-se na adição de massa ou assemelha-se a depleção de associação e de dissociação 13, 14. O objetivo deste estudo foi compreender o papel da IRF5 na inflamação do miocárdio e fibrose. O objetivo era ter uma visão sobre o papel da IRF5 no desenvolvimento de fibrose tecidual e esclerodermia.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG anticorpo&nbsp;</td><td>Reagente Bardford Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp;</td></tr><tr><td>Biosensors</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 Substrate</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>diluição 1:1.000 em PBS</td></tr><tr><td>burro anti rato Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>diluição 1:1.000 em PBS</td></tr><tr><td>ECL mais</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Depois de muita tentativa e erro, voltamos a este</td></tr><tr><td>microscópio Eclipse TE 200-U com software de varredura a laser EZ C1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cabra anti coelho Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Diluição 1:1.000 em PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anti-cabra</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:Diluição de 10.000 em TBS</td></tr><tr><td>HRP burro anti-camundongo</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>Diluição 1:10.000 em</td></tr><tr><td>TBS ICAM-1corpo</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>Diluição 1:200 em</td></tr><tr><td>PBS IRF5 anticorpo (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de micro placas Elx800</td><td>Marcador</td> de neutrófilos NIMP da Biotek <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>Diluição 1:200 em</td></tr><tr><td>PBS Octeto RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>ligação à proteína-proteína</td></tr><tr><td>Design de peptídeo&nbsp; Software Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Síntese de proteína IRF5 recombinante</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>expressão de proteínas, serviço de síntese</td></tr><tr><td>dodecil fosfato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Farmácia</td><td></td><td>Cetamina Programação III substância controlada, prescipção necessária&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Microscópio Estéreo Zoom de Dissecção Trinocular com Luzes LED</td><td>Gooseneck Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de Dessalinização Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endotelial Basal Media EBM Bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>contém fontes de crescimento</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo software</td><td>Medit, Palaiseau, França</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do mice tight-pele

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

O fator regulador do interferon 5 (IRF5) é crucial para as células determinarem se respondem de forma pró-inflamatória ou anti-inflamatória. A capacidade do IRF5 de mudar as células de um caminho para outro é altamente atraente como alvo terapêutico. Projetamos um peptídeo chamariz IRF5D com um software de modelagem molecular para projetar pequenas moléculas e peptídeos.
IRF5D inibiu IRF5, reduziu alterações na matriz extracelular e melhorou a vasodilatação endotelial no camundongo de pele apertada (Tsk/+). O Kd de IRF5D para IRF5 recombinante é 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, conforme determinado por experimentos de ligação usando experimentos de interferometria de biocamada. A proliferação e apoptose de células endoteliais (CE) permaneceram inalteradas usando concentrações crescentes de IRF5D (0 a 100 μg / mL, 24 h). Camundongos Tsk/+ foram tratados com IRF5D (1 mg/kg/d por via subcutânea, 21 d). As expressões de IRF5 e ICAM diminuíram após o tratamento com IRF5D. A função endotelial foi melhorada conforme avaliado pela vasodilatação das artérias faciais de camundongos Tsk / + tratados com IRF5D em comparação com camundongos Tsk / + sem tratamento com IRF5D. Como fator de transcrição, o IRF5 trafega do citosol para o núcleo. A translocação foi avaliada por imuno-histoquímica em miócitos cardíacos cultivados nas diferentes matrizes extracelulares cardíacas. O tratamento com IRF5D do camundongo Tsk/+ resultou em um número reduzido de núcleos positivos para IRF5 em comparação com os animais sem tratamento com IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Essas descobertas demonstram o importante papel que o IRF5 desempenha na inflamação e fibrose em camundongos Tsk / +.

Os resultados demonstrados na Figura 1 mostra como criar um peptídeo. A Figura 1, superior esquerdo, mostra a região (entre os 2 setas amarelas, aminoácidos (aa) 425-436) em IRF5 que é fosforilado por um número de quinases. Figura 1, canto superior direito, mostra um oval amarelo onde domínio fosforilada de IRF5 liga. A estrutura dimérica de 3DSH foi rodado para observar uma fenda ou vale para a esquerda da hélice 2 (aa303-312). Isto é, ...

Descrevemos o isolamento da matriz extracelular cardíaca de camundongos controle C57Bl/6J, camundongos de pele apertada e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5. Também descrevemos os estudos de vasodilatação nos vasos isolados de C57Bl / 6J, camundongos de pele firme e camundongos de pele apertada tratados com o peptídeo inibitório IRF5.

Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

O objetivo geral desses procedimentos para isolamento da matriz extracelular e vasodilatação ex vivo é estudar o tratamento com peptídeo inibitório de IRF5 em roedores. Este método pode ajudar a responder como alterações na matriz extracelular podem potencializar ou atenuar a progressão da doença. A principal vantagem dos estudos de vasodilatação é fornecer uma visão sobre processos in vivo sem a necess游戏副本O isolamento da matriz extracelular cardíaca pode ser aplicado a outros órgãos, como a pata traseira ou o pulmão. Tivemos essa ideia pela primeira vez quando começamos a investigar a duplicação da fibrilina um no camundongo com pele rígida e reconhecemos o impacto da matriz extracelular alterada e do comportamento celular. Após anestesiar o camundongo e prepará-lo para a cirurgia, abra a pele usando uma tesoura.Cortar da região do peito até a lateral do maxilar com cuidado para não perturbar o tecido subjacente na parte frontal da mandíbula. Em seguida, dissecar a artéria fascialis removendo o tecido mole ao seu redor. Durante esse procedimento, tomar cuidado para não danificar a artéria.Mergulhe o tecido exposto em tampão mops para que permaneça saudável. Uma vez que a artéria f

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós apresentamos uma preparação para a visualização e manipulação de sinalização do cálcio em nativa, endotélio microvascular intacta. Tubos endoteliais recém isolado das artérias de resistência do mouse fornecendo músculo esquelético manter vivo na morfologia e sinalização dinâmica dentro e entre as células vizinhas. Tubos endoteliais pode ser preparado a partir de microvasos de outros tecidos e órgãos.

Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

A janela da câmara de dobras cutâneas dorsal murino apresentado visualiza uma zona de isquemia aguda persistente de um retalho musculocutâneo. Intravital epi-fluorescência licenças de microscopia para avaliação direta e repetitiva da microcirculação e quantificação de hemodinâmica. Morfológica e resultados hemodinâmicos podem ainda ser correlacionados com análises histológicas e moleculares.

Lesão tecido isquêmico na Skinfold Câmara do mouse Dorsal: Um Modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente

O objectivo deste protocolo é demonstrar as técnicas de isolamento e cultivo de células musculares murino primários liso vascular (VSMC) da circulação coronária. Uma vez que as VSMCs foram isolados, eles podem ser usados ​​para várias técnicas de cultura convencionais.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do rato inteiro, intacto, glândulas mamárias para investigar a expressão da matriz extracelular (ECM) e morfologia ductal. Mouse #4 glândulas abdominais foram extraídas dos ratos de 8-10 semanas nulíparas fêmeas, fixados em formalina tamponada neutra, seccionado e manchado usando imuno-histoquímica para proteínas de ECM.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

Aqui, apresentamos um protocolo para medir o vazamento vascular induzido pela administração intradérmica de agentes de promoção de permeabilidade na pele murino. Esta técnica pode ser usada para determinar a capacidade das moléculas de promover ou inibir vazamento vascular ou para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular.

Avaliação de agentes de indução Hyperpermeability vasculares na pele com o ensaio de milhas

Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio in vitro do risco usando fibroblastos preliminares e para um ensaio in vivo da cicatrização da ferida da pele nos ratos. Ambos os ensaios são métodos diretos para avaliar in vitro e in vivo a cicatrização de feridas.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Aprenda a isolar matriz extracelular cardíaca e realizar estudos de vasodilatação ex vivo em camundongos tight-skin. Este método permite avaliar os efeitos do peptídeo inibidor de IRF5 na progressão de doenças cardiovasculares.

Vasodilatação de isolado navios e o isolamento da matriz extracelular do Mice Tight-pele

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