Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

O objetivo geral desta técnica é fabricar uma matriz de nanoaglomerados de proteínas em uma bicamada lipídica suportada, que é compatível com técnicas de microscopia de superfície sensível para aplicações de biologia celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biofísica celular, em particular, como o nanoagrupamento de ligantes influencia a ativação e adesão das células T. A principal vantagem desta técnica é que ela é facilmente reprodutível em laboratório biofísico padrão e é compatível com técnicas avançadas de microscopia sensível à superfície, como TIRF e RICM.

Embora essa técnica seja projetada para fornecer informações sobre imunologia, ela pode ser aplicada a outros tipos de células com aplicações potenciais em biologia celular, oncologia e engenharia de tecidos. Para iniciar este procedimento, limpe as lâminas da tampa de vidro e as câmaras de observação conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, deposite 70 microlitros de suspensão de esferas de sílica a 2% gota a gota em uma corrediça de cobertura mantida em uma inclinação de 15 graus.

Vire o vidro 90 graus a cada 15 segundos por um minuto enquanto as suspensões secam. É fundamental criar uma monocamada de grânulos compacta e evitar a formação de multicamadas e aglomerados de óleo. É por isso que a concentração e o volume da solução de grânulos, bem como a hidrofilicidade da lâmina, precisam ser otimizados.

Depois que o líquido evaporar, coloque a lâmina dentro de um dispositivo de pulverização catódica de magnatron de radiofrequência em uma mesa giratória situada a 105 milímetros de distância de um alvo de silício de alumínio. Depois disso, use uma bomba turbomolecular para diminuir a pressão na câmara de deposição para 2,6 vezes 10 elevado ao quarto pascal negativo. Introduza uma atmosfera de argônio puro com um fluxo de 10 centímetros cúbicos padrão por minuto e uma pressão de 0,8 pascals.

Em seguida, ligue o gerador de energia de radiofrequência. Depois que o plasma estiver estabilizado, pulverize por dois minutos, mantendo o obturador fechado, para remover possíveis impurezas da superfície alvo. Abra o obturador e deixe a pulverização catódica continuar por 60 minutos para depositar uma camada de alumínio de 200 nanômetros de espessura na lâmina.

Em seguida, corte o fluxo de argônio. Feche a válvula gaveta para isolar a bomba turbomolecular da câmara de deposição. Depois disso, ventile a câmara com nitrogênio limpo para atingir a pressão ambiente.

Recupere a lâmina revestida de alumínio da câmara. Mergulhe a lâmina recuperada em água ultrapura à temperatura ambiente e ultra-sonice a 50 watts e 50 hertz por 30 segundos. Em seguida, deposite 0,5 mililitros de APTES no fundo de um dessecador.

Coloque a lâmina de vidro em uma grade de cerâmica. Coloque a grade no dessecador. Conecte o dessecador a uma bomba de membrana.

Em seguida, opere a bomba na potência máxima por 30 minutos para gerar um baixo vácuo. Feche a válvula do dessecador e desligue a bomba. Aqueça a 50 graus Celsius por uma hora.

Depois disso, abra o dessecador e colete a lâmina. Coloque a lâmina coletada em um suporte de PTFE. Deposite 2 mililitros de 25 microgramas por mililitro de biotina dissolvida em PBS.

Deixe a lâmina descansar por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue 10 vezes com PBS. Incubar a lâmina numa solução de hidróxido de sódio e PBS à temperatura ambiente durante a noite.

Depois disso, enxágue a lâmina 10 vezes com água ultrapura. Depois de limpar a calha de Langmuir, coloque as bandejas de PTFE no invólucro de PTFE da calha. Em seguida, encha-o com água ultrapura.

Defina a pressão medida para zero milinewtons por metro. Usando uma seringa de metal de vidro à prova de gás, deposite 30 microlitros de DOPC de 1 miligrama por milímetro e solução de clorofórmio na superfície da água. Feche a barreira de PTFE até que a pressão desejada de 27 milinewtons por metro seja atingida para comprimir a monocamada lipídica.

Em seguida, usando um grampo motorizado, mergulhe a lâmina de vidro preparada no invólucro de PTFE. Segure a corrediça no clamp perpendicular à interface ar-água. Levante o slide através da interface a uma taxa de 15 milímetros por minuto, mantendo uma pressão constante de 27 milinewtons por metro.

Em seguida, coloque a lâmina de vidro horizontalmente na superfície da água acima de uma bandeja de PTFE. Em seguida, usando uma pinça de metal, empurre a lâmina para baixo na bandeja de PTFE, mergulhando-a na água ultrapura. Use a pinça para transferir a bandeja de PTFE contendo a lâmina para um cristalizador cheio de água ultrapura.

Transfira a lâmina revestida debaixo d'água para uma câmara de observação. Depois disso, feche a câmara, certificando-se de que aproximadamente 1 mililitro de água fique preso no interior. Outra etapa delicada é a montagem da câmara de amostra debaixo d'água.

E deve-se evitar absolutamente o contato com o ar das bicamadas depositadas, para garantir isso, use um grande volume de água e garanta que todo o processo de montagem possa ocorrer debaixo d'água. Remova a câmara montada da água, verifique se a câmara está estanque e livre de vazamentos. Adicione 500 microlitros de PBS e, em seguida, remova 500 microlitros de líquido da câmara.

Repita este processo 10 vezes para substituir totalmente o mililitro de água ultrapura na câmara por PBS. Em seguida, introduzir 100 microgramas por mililitro de albumina de soro bovino na câmara de observação. Incube em temperatura ambiente por 30 minutos.

Depois disso, enxágue a bicamada removendo e adicionando 500 microlitros da câmara, 10 vezes. Em seguida, funcionalize com ligantes, deposite células e observe o nanopadrão proteolipídico e a fluidez da SLB, conforme descrito no protocolo de texto. Neste protocolo, uma máscara de esferas é usada para criar uma máscara de metal secundária por deposição controlada de alumínio.

Em seguida, a máscara de contas é removida, deixando uma camada de alumínio com orifícios. Em seguida, uma organo-amino silina, chamada APTES, é depositada na fase de vapor, seguida pela deposição de BSA-Biotina na fase aquosa. Em seguida, o alumínio é removido, revelando manchas de proteínas nanométricas.

Finalmente, o espaço entre pontos é preenchido com uma bicamada lipídica suportada. As imagens de epifluorescência são então tiradas dos nanopontos e da bicamada lipídica suportada. Uma imagem composta mostra perfeita complementaridade com a bicamada lipídica depositada exclusivamente ao redor dos pontos de proteína, mas não neles.

Em uma imagem de epifluorescência de uma bicamada lipídica suportada recém-depositada, os pontos de proteína aparecem como manchas escuras em um mar brilhante de lipídios. No entanto, após fotobranqueamento contínuo por 50 segundos, a imagem mostra um halo dentro da região delimitada pelo diafragma de campo, indicando que os lipídios são móveis. A análise do perfil de intensidade média ao longo da borda do diafragma de campo e o decaimento dessa intensidade ao longo do tempo durante o processo de branqueamento revela que a constante de difusão é de cinco micrômetros quadrados por segundo.

Esta técnica pode ser feita em dois dias se for realizada corretamente. É importante manter condições muito limpas durante a deposição de alumínio e calibrar cuidadosamente a curva de deposição. Seguindo este procedimento, o slide padronizado pode ser ainda mais funcionalizado.

Por exemplo, adicionando outra biomolécula na bicamada. Usamos isso para imitar as células herbívoras do antígeno, a fim de estudar a ativação das células T. Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica deve interessar a diversos públicos.

Por exemplo, os engenheiros de tecidos podem querer usá-lo como andaime para cultivar tecidos artificiais, e os oncologistas podem usar isso como uma plataforma para colocar questões fundamentais sobre a adição de células cancerígenas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar uma área de nanoaglomerados de proteínas em bicamada lipídica suportada, que é compatível com uma técnica avançada de microscopia. Embora usemos isso para estudar células T, acreditamos que esse substrato tem o potencial de se tornar a plataforma de escolha para estudar a interação de qualquer tipo de célula com membrana proteolipídica de padrão controlado.