Name: Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprenda a fabricar nano-aglomerados de proteínas em bicamadas lipídicas suportadas para estudar ativação e adesão de células T. Este método reprodutível é compatível com microscopia TIRF e RICM.

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Agradecemos Laurent Limozin, Pierre Dillard e Astrid Wahl para continuar discussões frutíferas sobre aplicações celulares. Agradecemos também Frederic Bedu de instalação de sala limpa PLANETE por sua ajuda com as observações SEM. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Conselho Europeu de Investigação através da concessão No. 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.

1. A limpeza dos vidros Capa-slides e câmaras de observação <ol><li> Organizar as coberturas de lâminas de vidro sobre um tabuleiro multi-deslizante feito de um material inerte tal como o politetrafluoroetileno (PTFE). </li><li> Mergulha-se o tabuleiro com lâminas e a câmara de observação numa solução de agente tensioactivo (qualquer produto recomendado para a limpeza de cuvetes de quartzo é apropriado). </li><li> Utilizando um banho de ultra-sons, ultra-sonicado na solução de surfactante durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavar 5 vezes com água ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0,059 S / cm). </li><li> Ultra-sonicado em solução surfactante durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavagem de 10 vezes com água ultrapura. </li><li> Repita os passos 1.5 e 1.6, duas vezes. </li><li> Armazenar em água à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C) durante até uma semana. </li></ol> 2. Fabricação de proteína Nano-pontos <ol><li> Deposição de contas <ol><li> deposit a suspensão de contas de sílica (2% v / v, 70 mL) gota a gota em um-corrediça de cobertura (24 x 24 mm, espessura de 170 um), realizada com uma inclinação de 15 graus. </li><li> Deixe a suspensão espalhada durante cerca de 1 min, enquanto que lança o vidro de 90 ° a cada 15 s. </li><li> Permitir que o líquido se evaporar sob condições ambiente. </li><li> Armazenar em um vidro limpo ou câmara de PTFE em condições ambientais durante até 2 dias. </li></ol></li><li> Deposição de alumínio <ol><li> Colocar as lâminas (preparada na secção 2.1) dentro de uma frequência de rádio de pulverização catódica equipamento (RF) magnetrão 8, sobre uma mesa rotativa a uma distância de cerca de 105 mm a partir de uma lata de alumínio (99%): silício (1%) alvo. </li><li> Bombeiam para baixo a câmara de deposição de 2,6 x 10 -4 Pa através de uma bomba turbomolecular. Esta etapa é importante para a remoção de possíveis impurezas gasosas. </li><li> Introduzir puro atmosfera de Árgon (5N, 99,999%) com um fluxo de 10 sccm a uma pressão de 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; NOTA: O fluxo de árgon de entrada é controlado por um controlador de fluxo de massa e a pressão do processo é monitorizado utilizando um medidor de pressão. O fluxo de gás árgon é contínua e é controlado por um equilíbrio entre a entrada e válvulas de abertura de saída. </li><li> Ligue o gerador de energia RF. NOTA: Aqui, foi utilizada uma gama típica de 400-600 W de energia de radiofrequência a 13,56 MHz de frequência. O gerador de RF é utilizada com uma Rede de adaptao de um modo de acoplamento do plasma capacitiva. A energia reflectida é monitorado e minimizado utilizando a adaptação da rede. </li><li> Após o plasma é estabilizado, de descarga eléctrica durante dois minutos, mantendo o obturador fechado para remover possíveis impurezas da superfície do alvo. </li><li> Abrir o obturador e permitir a pulverização continue durante 60 min a depositar alumínio sobre a lâmina de vidro até uma espessura de 200 nm. </li><li> Cortar o fluxo de árgon, fechar a válvula de gaveta para isolar a bomba turbomolecular a partir da câmara de deposição e ventilar a câmara com n limpoitrogen para obter a pressão ambiente. Recuperar as lâminas revestidas com alumínio. Armazenar por até um mês em uma caixa de vidro ou PTFE limpo e hermeticamente fechado em condições ambientais. </li></ol></li><li> de deposição de vapor de organossilano <ol><li> Imergir a lâmina revestida de alumínio preparado no passo 2.2.6 em água ultrapura, à temperatura ambiente e ultra-sonicação durante 30 s num banho de ultra-sons (50 W, 50/60 Hz, entre 20 e 30 ° C). </li><li> Depósito de 0,5 mL de (3-aminopropil) -triethoxysilane (APTES) na parte inferior de um exsicador. CUIDADO: APTES é um organossilano, que evapora facilmente e é tóxico. APTES deve ser manuseado apenas sob um fluxo-capuz e com luvas. </li><li> Coloque as lâminas de vidro (preparadas em 2.3.1) em uma grade de cerâmica e coloque dentro do secador. </li><li> Ligue o exsicador para uma bomba de membrana e na potência máxima durante 30 min para gerar um vácuo baixo. </li><li> Fechar a válvula do exsicador e desligar a bomba. </li><li> Aquecer o secadora cerca de 50 ° C durante 1 h. </li><li> Abra o exsicador e recolher os slides. </li><li> Transferir para outro exsicador limpo para armazenamento de até 48 horas à temperatura ambiente (20 a 30 ° C). </li></ol></li><li> Deposição de primeira camada de proteína - albumina de soro bovino marcada com biotina (BSA-biotina) <ol><li> Coloque uma das lâminas preparadas na seção 2.3 sobre um suporte de PTFE. </li><li> Depósito 1 mL de 25 ug / mL de BSA-biotina dissolvida em tampão fosfato salino (PBS). Deixar durante 30 minutos à temperatura ambiente (20 a 30 ° C). </li><li> Enxaguar 10 vezes com PBS. Armazenar a amostra durante até 24 h a 4 ° C para longe da fonte de luz. </li></ol></li><li> Remoção de máscara de alumínio <ol><li> Incubar as lâminas numa solução de NaOH em PBS (preparado por adição gota a gota de NaOH 1 M a cerca de 100 mL de PBS para se obter pH≈12) durante a noite à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). CUIDADO. NaOH é corrosivo e deve ser manuseado com luvas. </li><li> Rinse10 vezes em água ultrapura. </li></ol></li></ol> 3. A deposição de Compatível Lipid Bilayer (SLB) <ol><li> Limpeza da calha Langmuir <ol><li> Remover a água no compartimento de PTFE da calha de Langmuir utilizando uma bomba. </li><li> Limpo com uma toalha descartável não tecido que não solte fiapos embebido em clorofórmio. CUIDADO. O clorofórmio é tóxico e deve ser manipulada numa área bem ventilada, com uma máscara (ou sob um fluxo-capa) e com luvas apropriadas. </li><li> Limpos 4 vezes com água ultrapura morna (40-50 ° C). </li><li> Limpas pelo menos 6 vezes com água ultrapura frio. </li></ol></li><li> A deposição da primeira camada de lípido <ol><li> Coloque bandejas de PTFE no recinto de PTFE da calha de Langmuir e depois enchê-lo com água ultrapura. </li><li> Usar o software de controlo do aparelho de Langmuir para definir a pressão medida a 0 mN / m. </li><li> Usar uma seringa estanque a gases de vidro / metal a depositar 30 uL de uma solução de lípidos de 1 mg / mL (1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) em clorofórmio) sobre a superfície da água. O clorofórmio e evapora-se as moléculas de lípidos formam espontaneamente uma monocamada. </li><li> Usar o software de controlo para comprimir a monocamada de lípidos, fechando a barreira de PTFE até que a pressão desejada (27 mN / m para DOPC) é alcançado. </li><li> Usar o software de controlo para mergulhar a lâmina de vidro preparado na secção 2.5.2 para dentro do invólucro de PTFE utilizando uma braçadeira motorizado. </li><li> Segurar a corrediça, na braçadeira, perpendicular à interface ar-água. Usar o software de controlo para elevá-lo lentamente (15 mm / min) através da interface, enquanto se mantém uma pressão constante a 27 mN / m. </li><li> Lugar num ambiente seco, quer para uso imediato ou para armazenamento até 24 horas à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li></ol></li><li> A deposição da segunda camada lipídica <ol><li> Manter a pressão de superfície na tina de Langmuir no valor desejado de 27 mN / m. Comprimir usando osoftware do aparelho de Langmuir e / ou controlo de adicionar uma pequena quantidade de lípido para alcançar a pressão desejada. </li><li> Colocar as lâminas de vidro que transportam a monocamada de lípidos, preparada na secção 3.2.6, na horizontal sobre a superfície da água. Assegure-se que cada lâmina está a flutuar por cima de um tabuleiro de PTFE. </li><li> Empurrar as lâminas de vidro para baixo, uma lâmina de cada vez, para a sua bandeja de PTFE correspondente utilizando PTFE ou metal pinça de tal modo que eles são imersos na água. Evite inclinar os slides enquanto empurra. </li><li> Use PTFE ou metal pinças para transferir as bandejas de PTFE contendo os deslizamentos em um cristalizador preenchido com água ultrapura certificando-se de que as lâminas não são expostas ao ar. </li><li> Use PTFE ou metal pinças para transferir, durante o trabalho debaixo de água, uma bicamada revestido lâmina de vidro para uma câmara de observação. NOTA: A câmara de observação é colocado debaixo de água no interior do cristalizador. A câmara de observação é feito sob medida e consiste de um anel de PTFE com um uma junta de borrachainvólucros de aço d, que podem ser montados debaixo de água para fazer uma câmara estanque à água, cuja superfície inferior é feita a partir da lâmina de vidro revestida previamente com a bicamada lipídica. </li><li> Fechar a câmara, continuando a trabalhar com água e assegurando que cerca de 1 mL de água é preso no interior da câmara. </li><li> Levar a câmara montada fora da água. Certifique-se de que ele é livre à prova de água e vazamento. </li><li> Substituir o 1 ml de água ultrapura presente na câmara de observação com PBS por adição e remoção de 500 ul de PBS 10 vezes. Assegurar que a câmara nunca é desprovida de líquido. </li></ol></li><li> etapa de bloqueio SLB <ol><li> Introduzir 100 ug / mL de albumina de soro bovino (BSA) na câmara de observação contendo a corrediça preparada na secção 3.3.6 e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavar a camada dupla por eliminação e adição de 500 ul de PBS 10 vezes. A bicamada pode ser mantido 24 horas a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. A funcionalização com ligantes <ol><li> Adicionar fluorescente ou não fluorescente neutravidina (NAV, uma versão desglicosilada de avidina não carregado a pH 7) a 2 ug / mL para a câmara contendo a corrediça preparada na secção 3.4.2, durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavar por adição e remoção de 500 ul de PBS 10 vezes. </li><li> Adicionar biotinilado anti-CD3 a 2 ug / mL para a câmara que contém a corrediça preparada na secção 3.4.2. Para dupla funcionalização do SLB e os pontos, adicionar Fc-ICAM1 His-tag, a 5 ug / ml (aqui, a bicamada é feita de DOPC + 1% de ácido nitrilotriacético (NTA) lípidos). Deixar durante 30 minutos à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C). </li><li> Lavar por adição e remoção de 500 ul de PBS 10 vezes </li><li> Substituir o PBS com meio celular (PBS + BSA a 0,1%) por adição e remoção de 500 mL do meio de células 10 vezes. </li><li> Deixar 200 uL de meio de células no chamber com a corrediça. </li><li> Coloque a câmara durante 10 minutos a 37 ° C antes da adição de células. </li></ol> 5. Célula de deposição (ver referência 7 para detalhes) <ol><li> depositar cuidadosamente 400 ul da suspensão de células para dentro da câmara. Incubar as culas durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Fixar a célula com 2% de paraformaldeído (PFA) durante 15 min a 37 ° C. Substituir o PFA com PBS por remoção repetida e a adição de 500 uL de PBS. </li></ol> 6. Observação <ol><li> Proteo-lipídico Nano-padrão e SLB fluidez <ol><li> Usar um microscópio de fluorescência para a imagem do padrão de proteínas no modo de epi-fluorescência usando comprimento de onda apropriado iluminação (639 nm) e cubos de filtro (por exemplo, aqui, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688). NOTA: A intensidade do sinal pode ser quantificada para estimar a quantidade de proteína dentro e fora do ponto. Usar um comprimento de onda apropriado iluminação (330 nm) e fcubo ILTER a imagem da bicamada (BP 365/12, FT 395, LP 397), que aparece brilhante com buracos escuros. </li><li> Use foto contínuo de branqueamento (CEC) técnica 13, 15 para medir a constante de difusão de lípidos de traçador na bicamada. Esta observação é, de preferência feito apenas após a deposição SLB. NOTA: De modo a quantificar a constante de difusão, dois parâmetros são medidos durante o processo de CEC: o tempo de branqueamento específica do corante (tenso) e o comprimento de decaimento do perfil fluorescente do halo formado em torno da área branqueada (taud). O primeiro é obtido através da representação gráfica da evolução no tempo da intensidade de fluorescência no centro do campo iluminado durante o processo de CPB. A segunda é obtido por traçado do perfil de intensidade na borda da zona iluminada (média de mais de 12 linhas e 5 depois as imagens em estado estacionário é atingido). As curvas são montados para obter tenso e taud. A constante de difusão é dada por tauD 2 / tenso (D = <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os passos críticos dentro do protocolo descrito acima estão relacionadas com a formação da proteína nano-pontos ou a parte de trás de enchimento do espaço em torno dos pontos por uma bicamada lipídica suportado. O primeiro passo crítico com respeito a proteína nano-pontos é a preparação do grânulo-máscara. A limpeza da tampa a corrediça é crítica. As lâminas têm de ser limpas, quer com uma solução de detergente que é recomendado para a limpeza de cuvetes de quartzo, ou com plasma de oxigénio. Outras técnicas de limpeza ...

<html> A adesão celular tem lugar através de moléculas de adesão de células especializadas (CAMs), proteínas presentes na membrana de células que são capazes de se ligar a sua contraparte na matriz extra celular ou noutra célula. Em culas aderentes, a maioria das moléculas de adesão incluindo a integrina ubíqua e caderina, encontram-se na forma de agregados 1. A interacção dos linfócitos T (células T) com as células apresentadoras de antígenos (APCs) fornece uma ilustração particularmente notável da importância dos aglomerados de receptores formados na interface entre as duas células - muitas vezes chamada uma sinapse imunológica. Após a formação do primeiro contacto com os receptores de células APC, T (TCRs) sobre a superfície dos agregados de escala forma célula micron T que servem de sinalização plataformas 2, 3, 4, e, eventualmente, são centralizados para formar um agrupamento supramolecular central maior (cSMAC )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Recentemente, foi mostrado que no lado do APC, os ligandos de TCR também estão agrupados 8. No contexto de células T-APC interacção, a implementação de sistemas híbridos, onde o APC é mimetizado por uma superfície artificial funcionalizadas com proteínas relevantes, avançou significativamente a nossa compreensão da interface sináptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Neste contexto, é altamente relevante para desenhar superfícies miméticos APC que capturam um ou mais aspectos da célula alvo. Por exemplo, se os ligandos são enxertados em bicamadas lipídicas com suporte, que pode difundir-se no plano da bicamada, mimetizar a situação na superfície da APC e ao mesmo tempo permitir que a formação dacSMAC 6, 7. Da mesma forma, os aglomerados sobre o APC foram imitada através da criação de ilhas de ligandos num mar de polímeros 9, 10, 11, 12, 13, 14. No entanto, estas duas características têm até agora não foram combinados. Aqui, descrevemos uma nova técnica para criar nano-pontos de anti-CD3 (um anticorpo que tem como alvo o complexo TCR) rodeado por uma bicamada lipídica com os lípidos que se difundem. A bicamada é depositada utilizando Langmuir-Blodgett / técnica de Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 e, se desejado, pode ser funcionalizado com uma proteína específica - por exemplo, o ligando da integrina da célula T (chamado ICAM1). Além disso, os anti-CD3 pontos proteína could ser substituído com um outro anticorpo ou CAM. Enquanto nós escolhemos as proteínas para uso futuro como plataforma para estudos de adesão de células T, a estratégia detalhado aqui pode ser adaptado para qualquer proteína e mesmo DNA.

<table><tbody><tr><td>Assistente de lamínulas de vidro</td><td>, Karl Hecht KG&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de observação</td><td>Concentrado</td> de surfactante alcalino caseiro <td></td><td></td></tr><tr><td>(Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicador</td><td>Dessecador Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer&nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Água MQ&nbsp;</td><td>ELGA, Veolia França</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grânulos de sílica</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Seringa Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gastight&nbsp;</td><td>Dominique Dustcher, França</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Balança de filme</td><td>NIMA</td><td>Microscópio Médio</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss, Alemanha</td><td>Sistema TIRF-III Alvo</td><td></td></tr><tr><td>de Alumínio&nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, Sistema</td> de Magnetron de Radiofrequência dos EUA <td></td><td></td></tr><tr><td>sputtering&egrave; eu&nbsp;</td><td>ferramenta SMC 600 modificada pela ALCATEL, França</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

matrizes ligando nano-fragmentação em uma bicamada lipídica compatível

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Actualmente há um grande interesse em criar matrizes ordenadas de ilhas de proteínas adesivas num mar do superficial passivada para estudos de biologia celular. Nos últimos anos, tornou-se cada vez mais claro que as células vivas responder, não só para a natureza bioquímica das moléculas que lhes são apresentados, mas também à maneira como essas moléculas são apresentados. Criando proteína micro-padrões é, portanto, agora um padrão em muitos laboratórios de biologia; nano-padrões também são mais acessíveis. No entanto, no contexto de interacções célula-célula, existe uma necessidade de padrão não só proteínas, mas também bicamadas lipídicas. Tal padronização dupla proteo-lipídica até agora não tem sido facilmente acessível. Oferecemos uma técnica fácil para criar proteínas nano-pontos suportados em vidro e propor um método para aterrar o espaço inter-ponto com uma bicamada lipídica suportado (SLB). A partir de foto-branqueamento de traçador lipídios fluorescentes incluídos no SLB, demonstramos que a bicamada exibe considerável-plfluidez ane. Funcionalização os pontos de proteínas com grupos fluorescentes nos permite imagem los e mostrar que eles são ordenados em uma rede hexagonal regular. O tamanho típico ponto é de cerca de 800 nm e o espaçamento aqui demonstrada é de 2 micra. Estes substratos são esperados para servir como plataformas úteis para a adesão celular, a migração e estudos mecano-sensores.

As imagens de fluorescência foram analisados ​​para medir o espaçamento e o tamanho dos pontos. Espaçamento típico verificou-se ser 1,900 ± 80 nm e dot-tamanho típico foi de 600 ± 100 nm (Figura 1 g). O espaçamento é definido pelo tamanho das contas utilizadas para a máscara. O ponto de tamanho é definido pelo, bem como condições de deposição do grânulo de tamanho. O SLB é depositada unicamente em torno dos pontos de proteína e não sobre elas (Figura 2),...

Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

O objetivo geral desta técnica é fabricar uma matriz de nanoagregados de proteínas em uma bicamada lipídica suportada, que seja compatível com técnicas sensíveis de microscopia de superfície para aplicações em biologia celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biofísica celular, em particular, como o nanoagrupamento de ligantes influencia a ativação e a adesão de linfócitos T. A principal vantagem desta técnica é que ela é facilmente reprodutível em laboratórios padrão de biofísica e é compatível com técnicas avançadas de microscopia sensível à superfície, como TIRF e RICM.Embora esta técnica seja projetada para fornecer insights na imunologia, ela pode ser aplicada a outros tipos celulares com possíveis aplicações em biologia celular, oncologia e engenharia de tecidos. Para iniciar este procedimento, limpe as lamínulas de vidro e as câmaras de observação conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, deposite 70 microlitros de suspensão de microesferas de sílica a 2% gota a gota sobre uma lamínula mantida em uma inclinação de 15 graus.Gire o vidro 90 graus a cada 15 segundos durante um minuto enquanto a suspensão seca. É fundamental criar

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo descreve a técnica de estudo da montagem da proteína septina em microesferas revestidas com bicamadas lipídicas. Essa técnica ajuda a entender os conjuntos de proteínas dependentes da curvatura em superfícies curvas.

Ensaio de Bicamada Lipídica Esférica Suportada: Uma Técnica para Observar a Montagem de Septina em Microesferas

Bicamadas lipídicas suportadas e partículas de membranas naturais são sistemas convenientes que podem aproximar as propriedades das membranas celulares e ser incorporadas em uma variedade de estratégias de análise. Aqui demonstramos um método para a preparação de compostos de microarrays de suporte revestidas de lípidos em bicamada-SiO 2 grânulos, vesículas de fosfolípidos ou partículas de membranas naturais.

Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo

Relatamos uma aplicação inteligente de nanotubos de carbono para estabilização cinética de partículas lipídicas que contêm nanoestruturas automontadas em seus núcleos. A preparação de partículas lipídicas requer concentrações bastante baixas de nanotubos de carbono, permitindo seu uso em aplicações biomédicas, como administração de medicamentos.

Preparação Facile da Internamente auto-montados Lipid partículas estabilizada por nanotubos de carbono

Nós demonstramos um sistema armazenável e transportável de lípidos em bicamada. Uma membrana de bicamada de lípido pode ser formado dentro de 1 hora com uma taxa de sucesso superior a 80% quando um precursor de membrana congelada é levada até à temperatura ambiente. Este sistema irá reduzir os processos laboriosos e conhecimentos associados com canais de íons.

Formação Automated Lipid bicamada da membrana Usando um polidimetilsiloxano Thin Film

Muitas proteínas desempenham sua função quando ligadas às superfícies da membrana. A ligação de proteínas extrínsecas nas membranas dos nanodiscos pode ser indiretamente visualizada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que o empilhamento característico (rouleau) de nanodiscos induzido pela coloração negativa fosfotungstato de sódio é impedido pela ligação de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Este protocolo descreve um processo para a fabricação de redes lipídicas de nanotubos usando motilidade de quinase deslizante em conjunto com vesículas lipídicas unilamellar gigantes.

Fabricando redes nanotubos lipídes de lipídicas multi-componentes usando o ensaio de motilidade de mobilidade de cinévola gliding

Relatamos um protocolo para a produção de uma membrana lipídica híbrida na interface água/ar dopando a bicamada lipídica com moléculas de cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-phthalocyanine (CuPc). A membrana lipídica híbrida resultante tem uma estrutura de sanduíche lipídida/CuPc/lipídio. Este protocolo também pode ser aplicado à formação de outros nanomateriais funcionais.

Auto-montagem de membranas lipídicas híbridas dopadas com moléculas orgânicas hidrofóbicas na interface água/ar

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Monocamadas lipídicas têm sido usadas como base para a formação de cristais proteicos bidimensionais (2D) para estudos estruturais por décadas. Eles são estáveis na interface ar-água e podem servir como um material de suporte fino para imagens eletrônicas. Aqui apresentamos os passos comprovados na preparação de monocamadas lipídicas para estudos biológicos.

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Aqui, um sistema de bicamada lipídica suportado por nanobar é desenvolvido para fornecer uma membrana sintética com uma curvatura definida que permite a caracterização de proteínas com capacidade de detecção de curvatura in vitro.

Um Sistema de Bicamada Lipídica Suportado por Nanobar para o Estudo de Proteínas de Detecção de Curvatura de Membrana in vitro

Aqui, é descrito um protocolo para gerar padrões proteicos regulados por luz e reversíveis com alta precisão espaço-temporal em membranas lipídicas artificiais. O método consiste na fotoativação localizada da proteína iLID (dímero induzível por luz melhorado) imobilizada em membranas modelo que, sob luz azul, se liga à sua proteína parceira Nano (SspB do tipo selvagem).

Padrões dinâmicos de proteínas induzidas por luz em membranas modelo

Aprenda a fabricar nano-aglomerados de proteínas em bicamadas lipídicas suportadas para estudar ativação e adesão de células T. Este método reprodutível é compatível com microscopia TIRF e RICM.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

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