Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

O objetivo geral deste protocolo é desenvolver tecnologias que permitam a transdução gênica bem-sucedida em células matadoras naturais primárias. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imunoterapia, como o efeito da modificação genética em linfócitos efetores, tais como as células matadoras naturais, ou células NK. A principal vantagem desta técnica é a expressão eficiente de um gene de interesse em células NK primárias de camundongo ou humano.

Após preparar e titular vetores lentivirais de acordo com o protocolo descrito, purifique células NK primárias murinas passando suspensões celulares únicas de baço através de colunas de lã de náilon para esgotar as populações aderentes compostas por linfócitos B e macrófagos. Utilize 1.000 unidades por mililitro de Interleucina-2 em meio completo RPMI1640 para cultivar a população não aderente que contém células NK. No quarto dia de cultivo, substitua o meio utilizando 20 mililitros de meio completo RPMI1640 e 1.000 unidades por mililitro de IL-2 para remover as células T e NKT não aderentes.

No sétimo dia, utilize marcadores específicos de células NK para verificar a pureza das células NK murinas por citometria de fluxo, usando preparações com mais de 95% da população negativa para CD3 e positiva para NK1.1. Para isolar os monócitos do sangue periférico, ou PBMCs, sobreponha cuidadosamente 35 mililitros de células semidiluídas sobre um gradiente de densidade de 15 mililitros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue o gradiente em rotor de balde pendular a 400 vezes G e 20 graus Celsius por 30 minutos sem freio.

Após purificar as células NK primárias humanas de acordo com o protocolo descrito, determine a pureza das células adicionando dois microgramas por mililitro de anticorpo anti-CD3 e dois microgramas por mililitro de anticorpo anti-CD56. Incube as células a quatro graus Celsius por 20 minutos. Use PBS para lavar as células duas vezes.

Em seguida, analise as células por citometria de fluxo. A população de células NK será positiva para CD56 na superfície celular e negativa para CD3. Suspenda células NK primárias de camundongo ou humanas nos poços de uma placa de 24 poços a 0,5 vezes 10⁵ por mililitro de meio com sobrenadante de lentivírus GFP, em uma NLV de cinco, 10 e 20.

Em seguida, na presença de polibreno, sulfato de protamina ou dextrana, centrifugue as placas a 1.000 ×g por 60 minutos. Depois, sem decantar o sobrenadante, cultive as células em uma incubadora a 37 °C com 5,2% de dióxido de carbono durante a noite.

Após as células terem sido lavadas com 10 mililitros de PBS, utilize dois mililitros de meio RPMI1640 com IL-2 para re-suspender as células. No dia anterior à coleta das células, revestir placas de 96 poços de poliestireno altamente absorvente com 2,5 microgramas por mililitro de anticorpos monoclonais anti-MKG2D e incubar as placas à temperatura ambiente ou na geladeira durante a noite.

No dia seguinte, use 100 microlitros de PBS para lavar cada poço três vezes. Recolha as células NK transduzidas primeiramente batendo suavemente nas placas, em seguida adicione 100 microlitros das células a cada poço das placas de 96 poços. De 16 a 18 horas após a ativação, use uma pipeta multicanal para coletar os sobrenadantes.

Em seguida, utilizando a citocina recombinante de um kit de ELISA, gere uma curva padrão e quantifique as citocinas, como o Interferon Gama no sobrenadante. Para testar a viabilidade das células NK, quatro dias após a transdução, lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS frio. Depois, recolha as células e use o XM5 7-aminoactinomicina D para corá-las.

Utilize citometria de fluxo para determinar a porcentagem de células necróticas entre as células NK transformadas e analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto. Esta figura mostra que as células NK humanas incubadas com IL-2 recombinante e posteriormente transduzidas com Lentivírus GFP alcançaram maior eficiência de transdução e aumento do título viral quando dextrana foi adicionada ao cultivo, em comparação com a adição de polibreno ou sulfato de protamina. Como visto aqui, resultados semelhantes foram demonstrados em células NK murinas, onde a dextrana aumentou a eficiência de vetores lentivirais, em comparação com polibreno ou sulfato de protamina.

Neste experimento, a capacidade citotóxica de linfócitos NK primários transduzidos foi avaliada por meio de um ensaio de liberação de CR contra K562 e YAC-1 como células-alvo. A transdução de linfócitos NK por dextrana não altera negativamente o potencial de lise das células NK transformadas em comparação com células NK não transduzidas. Neste caso, linfócitos NK primários humanos transduzidos foram co-cultivados com K562 por 24 horas, e os sobrenadantes foram coletados para mensurar a Interferon Gama.

Os resultados indicam que a dextrana não tem impacto na capacidade de células NK transduzidas produzirem citocinas. Além disso, uma validação independente mostrou que células NK tratadas com dextrana e ativadas com anticorpos monoclonais anti-NKG2DA10 ligados à placa ainda foram capazes de produzir a citocina Interferon Gama. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de centrifugar as células transduzidas.

Após este procedimento, outros métodos como a transfeção podem ser fundamentais para responder perguntas adicionais, como aprimorar a entrega de genes. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de Imunologia explorarem a manipulação gênica em células NK. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transduzir células NK.