Name: Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda um método intrabronquial não cirúrgico para estabelecer pneumonia bacteriana robusta em roedores imunocompetentes. Esta técnica permite avaliar a eficácia de tratamentos antibacterianos em um modelo relevante de pneumonia grave.

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JH deseja reconhecer e agradecer mentor, amigo e ex-gerente Valerie Berry para o primeiro nos ensinando este modelo; e Gary Woodnutt, que nos ensinou os fundamentos do e inspirou o nosso compromisso com o campo de PK / PD antibacteriano. Todos os autores gostariam de agradecer David Payne por seu apoio e valorização de nossa ciência. Gostaríamos de reconhecer a nossa ex-nos colegas vivo microbiologia que contribuíram para o corpo de dados gerados através destes métodos, especialmente Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni página e Nerissa Simon. Finalmente, os nossos agradecimentos vão para os nossos in vitro colegas de microbiologia para a sua assistência, especialmente para fornecer todos os MICs nós pedido (Lynn McCloskey, Josh Oeste e Sharon Min); e para a nossa equipe de microbiologia clínica que oferece consultoria especializada e suporte (Linda Miller, Nicole Scangarella-Omã e Deborah Butler).

<ol><li>Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous%27+vs.+%27discontinuous%27+therapy+with+penicillin%3A+the+effect+of+the+interval+between+injections+on+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy.</a> N Engl J Med. 248 (12), 481-488 (1953).</li>
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<li>Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Owens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pharmacodynamics+of+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Clinical pharmacodynamics of quinolones.</a> Infect Dis Clin North Am. 17 (3), 529-543 (2003).</li>
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<li>Miles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cyclohexyl-amides+as+potent+antibacterials+targeting+bacterial+type+IIA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel cyclohexyl-amides as potent antibacterials targeting bacterial type IIA topoisomerases.</a> Bioorg Med Chem Lett. 21 (24), 7483-7488 (2011).</li>
<li>Miles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tricyclics+%28e.g.+GSK945237%29+as+potent+inhibitors+of+bacterial+type+IIA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).</li>
<li>Hoover, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics%2Fpharmacodynamics+of+peptide+deformylase+inhibitor+GSK1322322+against+Streptococcus+pneumoniae%2C+Haemophilus+influenzae%2C+and+Staphylococcus+aureus+in+rodent+models+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), 180-189 (2016).</li>
<li>Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+bacteriological+efficacy+of+pharmacokinetically+enhanced+amoxicillin-clavulanate+against+Streptococcus+pneumoniae+with+elevated+amoxicillin+MICs+and+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).</li>
<li>Czock, D., Markert, C., Hartman, B., Keller, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+antimicrobial+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5 (5), 475-487 (2009).</li>
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<li>Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1270 (2012).</li>
<li>Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1271 (2012).</li>
</ol>

Os autores são todos funcionários da GlaxoSmithKline Pharmaceuticals e acções próprias de estoque pagos dentro da empresa.

Para o sucesso ideal em reproduzir este modelo de infecção, as seguintes sugestões adicionais devem ser considerados. Virulência de novos isolados pode ser melhorada por passagem de 2 - 3 vezes in vivo antes da utilização num estudo. Stocks bacterianas congeladas devem sempre ser preparado a partir de uma primária in vivo fonte -derived com o menor número de passagens quanto possível do original, e recongelar ou reutilização de estoque descongelado é desencorajado. Usando isolados clínicos recentes recuperadas a partir de pacientes com pneumonia e / ou preparação de culturas em fase log de crescimento também pode ajudar a melhorar o estabelecimento da infecção. Uma diluição de cinco vezes no agar (por exemplo, 2 ml de suspensão salina adicionado a 8 ml de agar) pode ser usado em vez de dez vezes para aumentar o inoculo bacteriano, e o volume de inoculo pode ser ajustada com base no tamanho do animal (por exemplo, 200 uL / ​​animal é geralmente inoculado em ratos 250 g). Antes da adição da suspensão bacteriana em soro fisiológico aágar (isto é, no Passo 2.3), a densidade bacteriana pode ser prevista ou estimada por inspecção visual, padrões MacFarland ou medições de densidade óptica. É útil para se familiarizar com as características de crescimento in vitro para cada isolado antes da realização de experimentos in vivo. Consistência no crescimento e manuseamento permite a estimativa mais precisa da densidade bacteriana para qualquer dado isolado. métodos microbiológicos padrão que diferem daqueles descritos, tais como meios de comunicação e homogeneizadores de tecido alternativa, podem ser utilizados como apropriados para a preparação de inóculos e enumeração de bactérias a partir de tecidos infectados. É altamente recomendável para preparar ou derreter o agar do dia antes da experiência, e armazená-la durante a noite num banho de água separada definida para 50 ° C. Isto vai simplificar o processo e ajudar a proteger contra o agar ser demasiado quente no momento da infecção. A temperatura de 41-42 ° C constitui um bom equilíbrio entre a manutenning o agar em estado líquido, sem ser demasiado quente para a sobrevivência bacteriana de curto prazo. Como uma alternativa possível à de agar nutriente, ágar nobre tem sido utilizada com sucesso em algumas experiências. Um tubo de inoculo de ágar é geralmente suficiente para um experimento inteiro (e é recomendado), mas vários tubos podem ser preparados para infectar um grande número de animais (por exemplo, mais de 60) ou quando o processo de infectar demora mais do que 30 - 45 min Se múltiplos tubos de inóculo são necessários, adicionar a suspensão bacteriana solução salina a cada tubo de agar tal como é necessário. Isto reduz o risco de que a sobrevivência e / ou a forma física bacteriana irá ser afectada pela exposição prolongada a uma temperatura elevada antes da inoculação. Deve notar-se que o uso de vários tubos de inoculo pode também requerer procedimentos de randomização animais adicionais. Sempre que possível, infectar todos os animais a partir da mesma preparação de inoculo. Recomenda-se a adaptar o tamanho de experimentos para o nível atual de proficiência com o technique. Um cientista especialista pode intubação e inocular um animal em menos de 30 s, e inocular até 5 - 6 animais por lote (isto é, com uma seringa cheia de inoculo de ágar). Para aqueles que aprender a técnica, a velocidade é importante como o agar vai começar a solidificar; No entanto, a colocação precisa do inoculo é mais importante. Comece com 1 ou 2 animais por lote, e aumentar à medida que a técnica torna-se mais familiar. Os animais continuam a respirar durante a intubação; Assim, a janela de tempo para a inoculação depende da rapidez com que o animal recupera de isoflurano, o que deve ser de aproximadamente 2-3 min. Os animais que despertam durante o processo pode ser re-anestesiados e tentado uma segunda vez, mas isto não é recomendado para o fazer repetidamente. inoculação bem sucedida na primeira tentativa, é esperado em quase 100% dos animais uma vez proficiência é alcançada. Note-se que é mais fácil de aprender a técnica utilizando ratos em primeiro lugar; ratinhos são mais delicados e muito menorls são mais propensas ao bloqueio com agar solidificado se não for manipulado rapidamente. seringas pré-aquecimento, tubos e salinas, bem como manter o dispositivo de intubação em uma superfície quente (não quente), como uma almofada de aquecimento em baixa definição, podem ajudar a prevenir a solidificação do agar. Quando a aprendizagem da técnica, também é útil para a prática de colocação adequada do inoculo utilizando um corante de cor escura (tais como azul de metileno concentrado) em vez da suspensão bacteriana em ágar. Realizar o processo tal como descrito, mas sacrificar o animal imediatamente após a inoculação do corante (não permitindo que o animal recuperar da anestesia e eutanásia). Dissecar a determinar onde o corante foi colocado, e ajustar em conformidade técnica. O endpoint primário neste modelo é CFU dos pulmões infectados. A sobrevivência não é um bom indicador da carga bacteriana e não é um desfecho recomendado. Para os estudos de eficácia, o N sugerida é de 5 - 6 animais por grupo como este é predicted para detectar diferenças de log ≥1 10 CFU entre grupos com pelo menos 90% de energia. Os animais podem ser infectados em grupos de tal forma que permanecem em conjunto companheiros de gaiola, ou um verdadeiro processo de randomização pode ser seguido. Note que se os grupos são designados por gaiola, os grupos deve ser infectado numa sequência aleatória com os controlos de crescimento de fim de estudo última infectadas (para confirmar que a sobrevivência bacteriana / aptidão não foi afectada pelo comprimento de tempo de exposição a uma temperatura elevada no banho de água). Nenhum método de censura dados deve ser necessário, e nenhum é recomendada, com excepção da remoção imediata de qualquer animal que tenha sido obviamente mis-inoculados no início do estudo (antes do início de quaisquer tratamentos). Os animais que são sacrificados antes do final do estudo deve ser amostrada e resultados incluídos no conjunto de dados, a menos que uma razão válida para exclusão prospectivamente foi identificado (isto é, um evento não relacionado com o tratamento ou infecção). carryover droga pode affect algumas amostras e é uma consideração importante em todos os modelos de infecção in vivo. Se um composto é dada frequência, perto da hora da eutanásia ou tem uma semi-vida longa, pode estar presente no homogenato de tecido a uma concentração suficientemente elevada para continuar a matar bactérias ex vivo durante o processo de enumeração de bactérias (diluição e plaqueamento de as amostras ou sobre as placas de agar durante a incubação durante a noite). Para evitar isso, carvão activado e / ou um aditivo que degrada a molécula activa, sem prejudicar as células bacterianas podem ser adicionados à amostra antes da homogeneização. Outros métodos incluem a centrifugação das amostras para remover a maioria do composto activo (o qual deve permanecer no sobrenadante) e empregando diluição diferente e plaqueamento regimes suficientemente para diluir o composto activo a uma concentração não inibidora. Como evidenciado pelos exemplos mostrados na Figura 2, este modelo com sucesso induces infecções pulmonares em roedores com uma ampla gama de organismos incluindo aqueles que não crescem bem em outros modelos (por exemplo, H. influenzae). Estas infecções são consistente e reprodutível, reduzindo a probabilidade de que as experiências terá de ser repetido devido à falha de modelo e / ou pobre desempenho com um dado isolado. Embora os animais são imunocompetentes, eles são incapazes de resolver rapidamente a infecção, se em tudo. Isto permite uma maior flexibilidade na duração do estudo, tal como muitos isolados manter uma infecção viáveis ​​através de pelo menos 96 horas sem a necessidade de injecções repetidas para manter a neutropenia. A vantagem potencial de estudar a eficácia antibacteriana em animais imunocompetentes foi observado anteriormente 20, 21, e há evidências de que, para alguns compostos (por exemplo, oxazolidinonas), os dados a partir de roedores não neutropénicos pode prever com maior precisão alvos de exposição humanos em comparação com aqueles neutropénicos rendeu 5. O utilitário multi-propósito de tEle modelo é demonstrado nas Figuras 3 e 4 e as Tabelas 1 e 2. Estes estudos são parte de uma grande coleção de dados publicados e não publicados que foi gerado com este modelo para apoiar os esforços de otimização de chumbo 16, 17, 22-24, para comparação e confirmação da dosagem humana propostos esquemas 19, 25-29 e para a caracterização de PK / PD 18, 30-32 .enquanto este modelo é inicialmente mais complexo de realizar em comparação com o método de inalação intranasal, existem muitas vantagens descritas acima. Com prática e uso rotineiro, as técnicas devem tornar-se simples de executar. Pode notar-se, em alguns estudos que a carga bacteriana na linha de base era menor do que a normalmente orientada em outros modelos de infecção pulmonar. Isto é devido em grande parte à diluição necessária em agar e o volume desafio pequeno, particularmente em ratos. No entanto, também deve ser notadoque o crescimento bacteriano foi observado em todos os casos, mesmo quando a carga inicial era relativamente baixa. A carga bacteriana de base alvo é 6 a 6,5 log 10 CFU / pulmões (6,8 a 7,3 log 10 UFC / g de tecido em ratinhos baseados em pesos médios do pulmão) que corresponde a densidades estimadas em pacientes humanos com pneumonia grave 33. Uma carga de linha de base superior pode ser alcançado por concentração adicional do inoculo bacteriano ou atrasar o início da administração do composto para permitir o crescimento bacteriano adicional; No entanto, o aumento da carga de desafio em excesso pode levar a doença grave e anormalmente aguda (ou seja, morte em menos de 24 h), que é refractário a todos os tratamentos antibacterianos independentemente de susceptibilidade. Embora o inoculo é inicialmente colocado preferencialmente no pulmão esquerdo do animal, geralmente a infecção se espalha por ambos os pulmões. doença progressiva do pulmão, a disseminação das bactérias a outros órgãos, e eventual morbilidade é muitas vezes observed com S. pneumoniae, K. pneumoniae e P. aeruginosa. De interesse, infecções com H. influenzae e A. baumannii são geralmente mais contido e raramente levar à morte no inóculos bacterianos prescrito. Os resultados de eficácia obtidos com este modelo tem demonstrado boa correlação com in vitro perfis de susceptibilidade, bem como metas PK / PD definidos. Reduções na carga bacteriana são rotineiramente observada para isolados consideradas susceptíveis ao agente a ser testado, enquanto que as consideradas resistentes exibem nenhuma mudança ou crescimento bacteriano acima da linha de base 16, 17, 19, 24-29. Estudos em ratos avaliando dois quinolonas e um macrólido de utilizar este modelo de 32 mostraram que o alvo de PK / PD necessário para um 1-log 10 redução em S. pneumoniae em comparação com os valores basais correlacionada com o alvo determinada em ratinhos neutropénicos e, mais importante ainda, com alvos clínicos para pneum bacteriana adquirida na comunidadeonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, um mecanismo novo antibiótico, foi testada contra vários S. pneumoniae e necessário um alvo PK / PD semelhante para um 1-log 10 redução neste modelo de infecção pulmonar 31 que o exigido para um 1-log 10 redução no modelo da coxa neutropénicos 36 quando a penetração de pulmão foi tida em conta (dados em arquivo). Do mesmo modo, os objectivos de PK / PD para determinados em ratinhos GSK2251052 contra P. aeruginosa foram consistentes para estase, 1- e 2-log em CFU 10 reduções entre este modelo de pulmão 30 e o modelo de infecção coxa neutropénicos quando a penetração pulmonar foi considerada 37, 38 . Correlação com um modelo de infecção pulmonar neutropênica usando inoculação intranasal era pobre; no entanto, GSK2251052 não produzir mais do que uma resposta estática nesse estudo 38. Isto pode ser atribuível ao inoculo bacteriano superior, que foi de 8 log 10 UFC / murganho, em comparação com 6 log <sub&gt; 10 UFC / rato na coxa neutropenia 37 e intratraqueal intubação 30 modelos. Recolha de dados como este é fundamental para a avaliação comparativa, já que permite a comparação directa com os modelos e correlação com dados clínicos existentes para avaliar a capacidade preditiva de translação. utilização mais generalizada do modelo de infecção pulmonar de intubação orotraqueal irá fornecer dados adicionais para estes tipos de análises. Existem várias limitações deste modelo de pneumonia imunocompetentes. Em primeiro lugar, não é bem adequado para avaliar o surgimento de resistência espontânea porque o inoculo bacteriano alta geralmente exigido para tais estudos resulta em uma infecção muito grave. Na sequência de tentativas para conseguir cargas bacterianas de 7 ou 8 log 10 CFU no início do estudo, a morbidade rápida tem sido observado (ou seja, animais tornando-se moribunda em menos de 24 h), apesar de lavagem completa dos inóculos para remover toxinas pré-existentes (dados em arquivo). istopode ser possível superar esse problema usando roedores maiores. Ratos, ratazanas especialmente mais pesados ​​(&gt; 250 g), parecem tolerar melhor inóculos maiores, em comparação com os ratos e pode ser adequado para estes tipos de estudos. Uma segunda limitação é que a utilização de uma infecção de agar como potenciador pode excluir a utilização do modelo para a avaliação de certos hospedeiro: agente patogénico. Acredita-se que o agar fornece um ponto focal protegida até que a infecção está totalmente estabelecida no interior do pulmão. É possível entregar o inóculo em solução salina em vez de agar para ajudar a superar este problema; No entanto, deve notar-se que isto apenas irá produzir infecção com alguns isolados. Em terceiro lugar, há uma curva de aprendizagem necessária para se tornar proficientes na técnica. O procedimento pode ser delicada, especialmente em ratinhos. É fácil colocar erroneamente a cânula de metal para o esôfago e força excessiva poderá causar perfuração, quer do esófago ou da traqueia. colocação cuidadosa do inoculo é igualmenterequerido ou animais podem ou não se recuperar ou não ser adequadamente infectadas. No entanto, com paciência e perseverança, pode tornar-se altamente proficiente e executar a técnica rápida, suave e precisa. Ao eliminar a necessidade de neutropenia, aumentando a robustez e reprodutibilidade, permitindo que os investigadores a estudar mais patógenos e isolados, melhorando a flexibilidade do design experimental e proporcionando uma infecção difícil de caracterizar farmacodinâmica para pneumonia, este modelo infecção pulmonar imunocompetentes agrega valor substancial para a descoberta de antibióticos comunidade. O aumento da utilização deste modelo por investigadores adicionais ajudará a fornecer a avaliação comparativa necessária para que adquiram uma aceitação mais ampla e continuar a fornecer informações de suporte para a interpretação apropriada.

Avaliação da eficácia de potenciais candidatos de drogas em modelos animais de infecção é um componente crítico do processo de descoberta de drogas anti-bacteriano. In vivo os estudos de eficácia fornecer dados importantes para toda a extensão dos esforços de descoberta, de elucidar relações estrutura-actividade (SAR) e otimizar série química chumbo através da determinação farmacocinética-farmacodinâmica (PK / PD) características dos compostos e apoiar a selecção da dose para a tomada de decisão desenvolvimento clínico e aprovação regulamentar. Numerosos modelos de infecção de animais estão descritos na literatura para estes fins. Um dos modelos mais comuns e amplamente utilizados é a infecção do mouse coxa neutropenia, que foi lançada pela Águia 1, 2 e mais tarde expandiu-se Vogelman e Craig 3, 4. Este modelo tem sido inestimável para apoiar a determinação dos limites de susceptibilidade bacteriana e para fornecer metas de PK / PD para orientar a dosagem humana. Existem muitos examepios em que a capacidade preditiva do modelo foi provado 4-7. No entanto, um dos inconvenientes do modelo de infecção coxa é a falta de relevância directa para infecções pulmonares. Existe agora um maior ênfase na correspondência do local da infecção em modelos animais para o local da infecção em seres humanos; e, assim, estudar a compostos para o tratamento de pneumonia, que é ideal para utilizar um modelo de infecção pulmonar em animais. Vários métodos para a indução de infecções pulmonares em animais de laboratório foram descritos e utilizados para estudos de eficácia antibacterianos incluindo a inalação intranasal, a aspiração através da via orofaríngea, exposição ao aerossol, e cirúrgica inoculação intratraqueal 8. Em muitos casos, os animais (ratos) em particular deve primeiro ser tornado neutropenia, a fim de alcançar uma infecção pulmonar robusta. Apesar deste estado gravemente imunocomprometidos, o número de agentes patogénicos bacterianos e as estirpes que produzem infecções viáveis ​​é em roedoreslimitado. Por exemplo, pode ser difícil estabelecer com sucesso Haemophilus influenzae ou Acinetobacter baumannii em modelos pneumonia 9, 10, e patógenos ainda mais virulentos, tais como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, podem representar desafios 11-13. Em 1991, Smith descreveu um modelo de infecção pulmonar em ratos recém-desmamados imunocompetentes em que a infecção foi estabelecida por incutir bactérias directamente para os pulmões por meio de um método não cirúrgico simples intubação intratraqueal 14. Berry et al. posteriormente modificado o método para infectar ratos 15. Usando um inoculo de ágar-base, esta técnica de inoculação induz infecções pulmonares robustas tanto em ratos imunocompetentes e ratinhos com S. pneumoniae, H. influenzae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. É favorável para uma grande variedade de isolados, incluindo aqueles abrigando vários resistirdeterminantes Ance e aquelas que não produzem uma infecção viável por outras vias de inoculação. Ele também permite que a eficácia deve ser determinada em animais imunocompetentes, uma condição que é mais relevante do que o modelo do rato neutropênica tradicional para populações de pacientes que não estão gravemente imunocomprometidos. A consistência e confiabilidade deste modelo em vários patógenos e isolados torna adequado para estudos de eficácia antibacterianos.

<table><tbody><tr><td>Ágar de soja tripticase TSA II com 5% de sangue de ovelha</td><td>Ágar Becton Dickinson and Company</td><td>4321261</td><td></td></tr><tr><td>Chocolate II Ágar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321267</td><td></td></tr><tr><td>BBL Caldo de infusão de coração cerebral modificado</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>299070</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tripticase BBL com 20% de glicerol</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>297808</td><td>mídia de armazenamento para estoque congelado</td></tr><tr><td>Alça de inoculação</td><td>Nunc</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Cloreto de sódio, USP</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>Difco Nutrient Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>213000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga independente de 30 mL com tampa</td><td>EverGreen Scientific</td><td>222-3530-G80</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de 50 mL 30 x 115 mm</td><td>Falcon, um</td> tubo de fundo redondo de polipropileno de 14 mL da marca Corning <td>352070</td><td></td></tr><tr><td>17 x 100 mm</td><td>Falcon, uma ferramenta</td> de guia <td>352059</td><td></td>da marca Corning</tr><tr><td></td><td>Intek Services Ltd</td><td>GT01</td><td>cânula de metal feita sob medida para ratos</td></tr><tr><td>Tubo Portex de 90' Cânula</td> de plástico <td>SAI</td><td>POR-080-100</td><td>para ratos</td></tr><tr><td>Ponta deslizante da seringa TB de 1 mL</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Agulha PrecisionGlide 25 G x 5/8</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de alimentação animal - reta 20 x 3" 2-1/4</td><td>Popper and Sons, Inc</td><td>7903</td><td>usada para criar cânula de metal para camundongos</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno intramédico</td><td>Marca Clay Adams - Becton Dickinson and Company</td><td>427401</td><td>cânula de plástico para mouse&nbsp;</td></tr><tr><td>75 TN 5.0 e micro; L seringa 26s/2"/2</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>seringa de injeção de vidro HPLC</td></tr><tr><td>Tubo de pirex, cultura 25x150 tampa de rosca com revestimento de borracha</td><td>Corning</td><td>9825-25</td><td>para autoclave/armazenar cânulas metálicas</td></tr><tr><td>álcool isopropílico 70%</td><td>Vi-Jon (Swan)</td><td>NDC 0869-0810-43</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-10</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher&nbsp;</td><td>Seward</td><td>Stomacher80</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 sacos clássicos</td><td>Seward</td><td>BA6040</td><td></td></tr><tr><td>Placa de ensaio, 96 poços, fundo redondo</td><td>Costar, Corning Inc</td><td>3795</td><td>opcional, para diluição em série</td></tr> Placas de sangue <tr><td>Omni Hardy</td><td></td><td>#A127</td><td>opcional, placas de sangue retangulares</td></tr></tbody></table>

um modelo pneumonia robusta em imunocompetentes roedores para avaliar antibacteriano eficácia contra<i&gt; s. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; h. influenzae</i&gt;,<i&gt; k. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; p. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; a. baumannii</em

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A eficácia dos tratamentos antibacterianos candidatos deve ser demonstrada em modelos animais de infecção, como parte do processo de descoberta e desenvolvimento, de um modo preferido em modelos que mimetizam a indicação clínica pretendido. Um método para induzir infecções pulmonares robustos em ratos e ratinhos imunocompetentes é descrito que permite a avaliação dos tratamentos em um modelo de pneumonia grave causada por S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae ou A. baumannii. Os animais são anestesiados, e um inoculo de ágar-base é depositado profundamente no pulmão através de intubação intratraqueal não cirúrgico. A infecção resultante é constante e reprodutível, e estável durante pelo menos 48 h e até 96 h para a maioria dos isolados. Estudos com antibacterianos comercializados têm demonstrado boa correlação entre a eficácia in vivo e in vitro susceptibilidade, e concordância entre farmacocinética / farmacodinâmica alvos determinadosneste modelo e alvos clinicamente aceites tem sido observado. Embora não haja um investimento de tempo inicial quando a aprendizagem da técnica, pode ser realizada rápida e eficiente uma vez que a proficiência é alcançada. Benefícios do modelo incluem a eliminação da exigência de neutropenia, o aumento da robustez e reprodutibilidade, capacidade de estudar mais patógenos e isola, maior flexibilidade no desenho do estudo e estabelecimento de uma infecção desafiador em um hospedeiro imunocompetente.

As ferramentas necessárias, a orientação do animal, e a profundidade da intubação são mostrados na Figura 1. Também é mostrado um exemplo representativo de colónias que crescem em uma placa de agar após a diluição em série e placas em triplicado de uma amostra de homogenato de pulmão. Um aumento da carga bacteriana de várias log 10 CFU acima dos controlos de linha de base é normalmente observada em pulmões infectados por isolados mais bacterianas, mesmo a 96 h após a infecção, e a variabilidade entre os animais é baixo (Figura 2). Para alguns H. influenzae, pode haver pouco crescimento; No entanto, a infecção não deve começar a auto-resolver dentro de um período de tempo de 48 ou 96 h (Figura 2B). Este modelo de infecção pulmonar pode ser utilizado durante a optimização da série química chumbo para suportar SAR, como mostrado na Figura 3 para os compostos representativos de duas séries diferentes 16, 17. Ele fornece uma consistente, reproduzível conheceuHod para avaliar PK / PD em animais imunocompetentes e foi utilizado para determinar que a área de fármaco livre sob a curva concentração-tempo, em relação à concentração inibidora mínima (fAUC / MIC) correlacionada com a eficácia de um novo polipéptido deformilase (PDF) inibidor contra S. pneumoniae e H. influenzae (Figura 4). Além disso, os alvos / MIC fAUC para estase, a 1 log 10 redução de CFU dos controles de linha de base foram determinados através de 11 S. pneumoniae e 5 isolados de H. influenzae (Tabela 1) 18. Acoplamento deste modelo de infecção com um sistema de entrega de droga para recriar perfis farmacocinéticos humanos em ratos cria uma ferramenta poderosa para avaliar os regimes de dosagem humanos antes de estudos clínicos. Um exemplo disto é resumido na Tabela 2, o que demonstra que uma formulação de libertação prolongada de amoxicilina-clavulanato foi mais eficaz do que os regimes de dosagem para os organismos existentes com Elevated MIC valores 19. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig1.jpg" /> Figura 1: Nonsurgical intratraqueal intubação. As ferramentas são mostrados para a entubação de rato (A) e o rato (B). Uma vez anestesiados, o animal deve ser posicionado como mostrado na C, com a cabeça para a direita e da cauda à esquerda se o indivíduo que executa a técnica é destro. Coloque o dedo indicador esquerdo gentilmente na garganta para ajudar a apalpar os anéis traqueais para a confirmação da colocação de uma cânula correta. O inoculo deve ser colocado profundamente no pulmão esquerdo, como mostrado na vista ventral de um pulmão de rato (D). As colónias que crescem em agar após diluição em série e plaqueamento de uma amostra deve ser semelhante ao mostrado na E. Figura 1D, Direitos de Autor © Gill Smith [Animais de Laboratório, Volume 25 (1991), G. Smith, Amétodo não-cirúrgico simples da instilação intrabronquial para o estabelecimento de infecções respiratórias em ratos, páginas 46 - 49] 14. Reproduzido com permissão. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig2.jpg" /> Figura 2: Exemplos representativos de crescimento bacteriano nos pulmões de animais infectados. Média ± desvio CFU dados padrão a partir de n = 5 animais / grupo é mostrado para vários isolados de S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) e A. baumannii (E). O primeiro bar de cada par (cinza claro) é a linha de base bactericidafardo rial em 1 ou 2 h após a infecção, enquanto o segundo bar é o controle do crescimento de fim de estudo às 48 h após a infecção (cinza escuro) ou 96 h após a infecção (preto). Nenhum método de censura dados foram aplicadas; Assim, estes resultados incluem os dados de todos os 5 animais por grupo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig3.jpg" /> Figura 3: Avaliar a eficácia de várias séries químicas durante a Otimização do Chumbo. modelos de infecção pulmonar, utilizando as técnicas descritas foram utilizadas para explorar relações estrutura-actividade, como parte do programa de tipo não-bacteriana topoisomerase II. Compostos promissores 7 e 1 foram avaliadas contra quinolonas-suscetível (A) 16 ou resistentes à quinolona(B) 17 isolados de S. pneumoniae, respectivamente. Cada símbolo representa CFU determinada a partir dos pulmões de um rato, com linhas que representam o grupo de média e desvio padrão. Limite inferior de quantificação (LIQ) foi de 1,7 log 10 UFC / pulmões. Os compostos foram pesados ​​(56 ou 112 mg de molécula progenitora livre pura), dissolvido em 9 mL de água estéril, diluiu-se 3 mL em 3 mL de água (1: 1) e administrado por gavagem oral de 1 ml / 125 g de rato duas vezes por dia ( 6 - 7 horas de intervalo), durante 2 dias, a partir de 1 h após a infecção. controlos não tratados (NTC) foram amostrados a 1 h após a infecção para a linha de base ou tratados com solução salina e amostrado no final do estudo (48 h) para os controlos de crescimento. Figura 3A reproduzido a partir Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, ciclo-amidas romance como antibacterianos potentes tipo de segmentação bacteriana IIA topoisomerases, Páginas 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, com a permissão de Elsevier.Figura 3B reproduzido a partir Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, tricíclicos novel (por exemplo GSK945237) como inibidores potentes do tipo bacteriana IIA topoisomerases, Páginas 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, com a permissão de Elsevier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig4.jpg" /> Figura 4: PK / PD Caracterização de um inibidor de PDF Novel. Modelos Emax foram criadas usando doses variando dados de eficácia em camundongos imunocompetentes infectados no pulmão com isolados de S. pneumoniae (A) ou H. influenzae (B) para determinar PK alvos / PD para um novo inibidor PDF 18. círculosrepresentam a carga bacteriana média 4-5 ratinhos / grupo tratados com diferentes doses de composto. As análises foram realizadas para correlacionar com eficácia sem droga 24 h AUC (círculos abertos) ou AUC / MIC (círculos a cheio). Reproduzido com permissão, de Copyright © Sociedade Americana de Microbiologia, [Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, o volume 60, 2016, páginas 180 - 189] 18. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> estase </td><td colspan="2"> 1-log 10 redução </td><td></td></tr><tr><td> Organismo </td><td> microfone (ug / ml) </td><td> R 2 para linha fiT (%) </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> Max assassinato (log 10 redução) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10127 </td><td> 0,25 </td><td> 99,9 </td><td> 2.0 </td><td> 8.1 </td><td> 3.6 </td><td> 14,4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1316009S </td><td> 0,25 </td><td> 96,1 </td><td> 6.5 </td><td> 26,0 </td><td> 15.1 </td><td> 60,3 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> ATCC10813 </td><td> 0,5 </td><td> 100 </td><td> 8.4 </td><td> 16,9 </td><td> 22.2 </td><td> 44,5 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> 1307007S </td><td> 1 </td&gt; <td> 95,8 </td><td> 16,1 </td><td> 16,1 </td><td> 20.1 </td><td> 20.1 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> ATCC6303 </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 19.8 </td><td> 19.8 </td><td> 24,8 </td><td> 24,8 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1629 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 15,8 </td><td> 7.9 </td><td> 21.2 </td><td> 10.6 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> 298443 </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 26,5 </td><td> 13.2 </td><td> 31,0 </td><td> 15,5 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> 336808 </td><td> 2 </td><td> 86 </td><td> 8.2 </td><td> 4.2 </td><td> 19,0 </td><td> 9.5 </td><td> 2.6 </td></tr><tr><td> 338860 </td><td> 2 </td><td> 99,5 </td><td> 2.9 </td><td> 1,5 </td><td> 6,7 </td><td> 3.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> &amp; #160; 340449 </td><td> 2 </td><td> 94,6 </td><td> 8 </td><td> 4.0 </td><td> 14,9 </td><td> 7,4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> L11259 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 7.1 </td><td> 3,5 </td><td> 9 </td><td> 4,5 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Média ± SD </td><td> NA uma </td><td> N / D </td><td> 11,0 ± 7,5 </td><td> 11,0 ± 7,9 </td><td> 17,0 ± 8,2 </td><td> 19,5 ± 17,8 </td><td> 2,3 ± 0,5 </td></tr><tr><td> Mediana </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 8.2 </td><td> 8.1 </td><td> 19,0 </td><td> 14,4 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> H. influenzae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1998-100-126H </td><td> 1 </td><td> 99,7 </td><td> 7.3 </td><td> 7.3 </td><td> 13,4 </td><td> 13,4 </td><td> 2.9 </td></tr><tr><td> 503-008H </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 7.1 </td><td> 7.1 </td><td> 13,9 </td><td> 13,9 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 08003H </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 14,5 </td><td> 7.2 </td><td> 16,7 </td><td> 8.3 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> H128 </td><td> 2 </td><td> 96,6 </td><td> 15,3 </td><td> 7.6 </td><td> 26,0 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 19001H </td><td> 4 </td><td> 91,9 </td><td> 14,8 </td><td> 3.7 </td><td> 37,3 </td><td> 9.3 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> Média ± SD </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 11,8 ± 4,2 </td><td> 6,6 ± 1,6 </td><td> 21,5 ± 10,2 </td><td> 11,6 ± 2,6 </td><td> 2,8 ± 0,1 </td></tr><tr><td> Mediana </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 14,5 </td><td> 7.2 </td><td> 16,7 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> a NA, não aplicável. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1: PK / PD Metas para um inibidor PDF Novel contra S. pneumoniae e H. influenzae isolados. AUC livre de drogas e de AUC / metas MIC para estase e uma 1-log 10 redução no UFC da linha de base foram determinados para 11 S. pneumoniae e 5 H. influenzae em camundongos imunocompetentes infectados no pulmão e tratados com o composto 18. o datum foi utilizado para ajudar a doses humanas selecionadas para desenvolvimento clínico. Este quadro foi adaptado e reproduzido com permissão, de Copyright © Sociedade Americana de Microbiologia, [Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, o volume 60, 2016, páginas 180 - 189] 18. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Grupo Tratamento A </td><td colspan="8"> A média de log 10 S. pneumoniae (CFU / pulmão) b ± SD para a estirpe (AMX / CA MIC): </td></tr><tr><td> 05010S (2 ug / ml) </td><td> 16001S c (4 ug / ml) </td><td> 16001S (4 ug / ml) </td><td> 30005S (4 ug / ml) </td><td> 20009S (4 ug / ml) </td><td> 05003S (8 ug / ml) </td><td> 404053 (8 ug / ml) </td><td> 47003S (8 ug / ml) </td></tr><tr><td> Ao controle </strong&gt; </td><td> 7,3 ± 0,4 </td><td> 7,0 ± 0,8 </td><td> 5,7 ± 1,2 </td><td> 7,1 ± 0,7 </td><td> 7,1 ± 0,4 </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 6,8 ± 0,4 </td><td> 6,0 ± 0,3 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.000 / 125 mg bid (proporção 16: 1) </td><td> ≤ 1,7 ** </td><td> 2,8 ± 1,2 ** </td><td> 2,2 ± 0,8 ** </td><td> 2,3 ± 0,9 ** </td><td> 2,5 ± 0,9 ** </td><td> 2,0 ± 0,9 ** </td><td> 3,8 ± 1,4 ** </td><td> 1,8 ± 0,2 ** </td></tr><tr><td> 1000/125 mg três vezes por dia (proporção 8: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 2,8 ± 0,5 ** </td><td> 2,7 ± 1,3 ** </td><td> 3,3 ± 0,9 ** </td><td> 4,9 ± 0,5 ** </td><td> 6,6 ± 1,3 </td><td> 4,7 ± 0,7 ** </td></tr><tr> &lt;td&gt; 875/125 mg, td (proporção 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 3,0 ± 1,3 * </td><td> 2,1 ± 0,7 ** </td><td> 3,2 ± 0,4 ** </td><td> 5,2 ± 0,9 * </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 4,9 ± 0,4 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (proporção 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,5 ± 1,2 * </td><td> 5,6 ± 1,3 * </td><td> 5,2 ± 0,7 ** </td><td> 6,3 ± 0,7 </td><td> 6,4 ± 0,7 </td><td> 5,5 ± 0,4 </td></tr><tr><td> 500/125 mg, td (proporção 4: 1) </td><td> 3,1 ± 1,3 ** </td><td> 4,5 ± 0,9 ** </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td></tr><tr><td> Azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 5,8 ± 2,0 </td><td> 7,1 ± 0,9 </td><td> 3,1 ± 1,0 ** </td><td> 6,6 ± 0,4 </td><td> 67; 0,6 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,2 ± 0,8 * </td><td> 5,7 ± 0,8 * </td><td> 4,9 ± 0,8 ** </td><td> 3,0 ± 1,3 ** </td><td> 3,5 ± 0,2 ** </td><td> 3,9 ± 0,8 ** </td></tr><tr><td rowspan="2"> Grupo de Tratamento d </td><td colspan="8"> A média de log 10 H. influenzae (CFU / pulmão) ± SD para a estirpe: </td></tr><tr><td colspan="4"> H128 (β-lactamase positiva) </td><td colspan="4"> divã (β-lactamase negativa, resistente à ampicilina) </td></tr><tr><td> Ao controle </td><td colspan="4"> 6,4 ± 0,6 </td><td colspan="4"> 6,7 ± 0,6 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.000 / 125 mg bid (proporção 16: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,7 ** </td><td colspan="4"> 3,1 ± 0,9 ** </td></tr><tr><td> 1000/125 mg três vezes por dia (proporção 8: 1) </td><td colspan="4"> 2,1 ± 1,0 ** </td><td colspan="4"> 3,6 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg, td (proporção 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,8 ± 1,3 ** </td><td colspan="4"> 3,8 ± 1,3 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (proporção 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,8 ** </td><td colspan="4"> 5,1 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> Azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td colspan="4"> 3,2 ± 1,7 * </td><td colspan="4"> 5,8 ± 1,1 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td></tr><tr><td colspan="9"> AMX / CA, amoxicilina-clavulanato; oferta, duas vezes por dia; tid., três vezes ao dia; OD, uma vez por dia. </td></tr><tr><td colspan="9"> b O limite de detecção foi de &lt;1,7; *, Significativamente diferente do controlo (P ≤ 0,05); **, Significativamente diferente do controlo (P ≤ 0,01); NT, Não testado. </td></tr><tr><td colspan="9"> c Strain 16001S foi testado em duas experiências separadas. </td></tr><tr><td colspan="9"> d-amoxicilina clavulanato de 500/125 mg (4: 1), três vezes por dia não foi testado contra as estirpes de H. influenzae. </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Eficácia de perfis de exposição Recreated plasma humano para diferentes Amoxicilina / Clavulanato regimes de dosagem. Os dados gerados em ratos imunocompetentes infectados no pulmão com isolados de S. pneumoniae ou H. influenzae usando este modelo demonstrou que uma formulação melhorada de amoxicilina-clavulanato (2, 000/125 mg duas vezes por dia) foi mais eficaz do que os regimes de dosagem padrão contra isolados com elevada sensibilidade in vitro 19. Este quadro foi adaptado e reproduzido com permissão, de Copyright © Sociedade Americana de Microbiologia, [Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, Volume 49, 2005, páginas 908 - 915] 19.

Um método para estabelecer infecções pulmonares em roedores imunocompetentes é descrito. Com proficiência, este método pode ser realizado de forma rápida e fácil para induzir infecção estável com muitos isolados de S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae e A. baumannii.

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

O objetivo geral deste procedimento de infecção intrabrônquica não cirúrgica é estabelecer uma pneumonia bacteriana robusta em roedores imunocompetentes. Este método agrega valor para a descoberta e desenvolvimento de antibacterianos, permitindo que a eficácia de potenciais tratamentos seja avaliada em um modelo imunocompetente de pneumonia grave. A principal vantagem desta técnica é que ela estabelece uma infecção pulmonar robusta e reprodutível com muitos isolados, incluindo aqueles que normalmente requerem que os animais sejam neutropênicos ou isolados que não produzem uma infecção viável com outros métodos.Geralmente, os indivíduos novos neste procedimento terão dificuldades. A intubação adequada é um procedimento cego que requer aprender a sensação certa para intubar a traqueia em vez do esôfago. A intubação adequada é diferente para cada cientista.O ângulo exato da cânula pode não ser o mesmo para todos. Sentir as cristas da traqueia é a chave. Demonstrando essa técnica, estará Cindy Mininger, cientista do nosso laboratório.Para começar, prepare suspensões bacterianas salinas de culturas de caldo durante a noite, conforme indicado no protocolo de texto, ou de placas de ágar, conforme demonstrado aqui. Colha o crescimento durante a noite das placas de ágar usando um laço estéril para raspar as colônias da superfície. Transfira o material colhido para cinco mililitros de solução salina estéril até obter uma suspensão turva e opaca e subtraia suavemente a cultura até ficar homogênea.Diluir em série e colocar uma alíquota de cada diluição em placas de acordo com o protocolo de texto. Depois de preparar o ágar e montar as ferramentas necessárias para o processo de infecção, de acordo com o protocolo de texto, alíquota nove mililitros de ágar em um tubo estéril e, em seguida, coloque o tubo no banho-maria até que o ágar se equilibre em aproximadamente 42 graus Celsius. Adicione um mililitro da suspensão bacteriana salina previamente preparada no tubo de ágar.Em seguida, inverta o tubo várias vezes para misturar e devolvê-lo à água. Coloque um tapete limpo e descartável na superfície de trabalho perto do banho-maria. Para preparar a superfície de trabalho e o dispositivo de intubação, primeiro esterilize a cânula de metal e o tubo de polietileno de acordo com o protocolo de texto e, em seguida, transfira-o em seu tubo de armazenamento de vidro para a superfície de trabalho.Em seguida, remova a tampa do tubo de armazenamento e deslize a extremidade da alça da cânula até a extremidade aberta do tubo. Usando uma pinça estéril, remova um pedaço de tubo de polietileno do béquer e insira-o no interior da cânula de metal estéril, certificando-se de que ele se mova livremente. Coloque uma marca guia em um local predeterminado com caneta indelével.Em seguida, encaixe uma agulha descartável estéril de calibre 25 na extremidade livre do tubo de polietileno, deslizando a agulha vários milímetros para dentro do tubo. Em seguida, use uma solução salina estéril para encher uma seringa descartável de um mililitro. Conecte a seringa à agulha encaixada no tubo de polietileno e lave todo o volume de solução salina através do tubo.Descarte a seringa usada no recipiente para objetos cortantes. Em seguida, encha uma nova seringa descartável estéril de um mililitro com o inóculo à base de ágar do banho-maria. Recoloque a agulha e o tubo de calibre 25 e lave o ágar através do tubo pressionando o êmbolo apenas até que o tubo esteja completamente cheio de ágar.Após anestesiar o rato de acordo com o protocolo de texto, coloque o animal em decúbito dorsal no tapete descartável com a cabeça voltada para a direita e a cauda voltada para a esquerda. Em seguida, insira a extremidade livre da cânula de metal na boca do animal. Gire a cânula de modo que a extremidade livre fique inclinada para cima e avance-a suavemente para dentro da traqueia, contornando cuidadosamente as estruturas laríngeas com um leve movimento de torção.Confirme a inserção na traqueia, em oposição ao esôfago, deslizando suavemente a cânula levemente para frente e para trás várias vezes enquanto usa o dedo indicador esquerdo para palpar os anéis traqueais. Para garantir a intubação na traqueia, e não no esôfago, mova a cânula ligeiramente para frente e para trás e sinta as cristas. Se a cânula deslizar suavemente pela garganta e os sulcos não puderem ser sentidos, remova o dispositivo e tente novamente.Quando a cânula atingir a bifurcação onde a traqueia se divide nos brônquios esquerdo e direito, faça um leve movimento de torção em direção ao lado esquerdo do animal para garantir que a cânula seja inserida no brônquio esquerdo. Um erro comum é não colocar o inóculo profundo o suficiente no pulmão, o que pode bloquear as vias aéreas e inibir a respiração. Quando a cânula é girada para o ângulo adequado, ela deve deslizar facilmente para o brônquio esquerdo e avançar suavemente até a profundidade apropriada.Avance a cânula de metal até que a extremidade esteja na metade do pulmão esquerdo, usando a marca guia colocada anteriormente para confirmar que a profundidade apropriada foi atingida. Com a cânula de metal no lugar, avance o tubo de polietileno vários milímetros usando a marca guia previamente colocada no tubo para garantir que ele avance apenas o suficiente para sair da extremidade da cânula de metal e não perfurar o pulmão. Com ambas as cânulas no lugar, use a seringa anexada para instilar 100 microlitros de suspensão de ágar profundamente no lobo grande do pulmão esquerdo.Retire vários milímetros da tubulação e remova cuidadosamente o dispositivo de intubação intacto. Coloque-o de volta no tubo de armazenamento de vidro e mova o animal para uma gaiola nova para se recuperar. Prepare a superfície de trabalho e a cânula como acabamos de demonstrar para ratos, usando o equipamento de tamanho apropriado para camundongos.Use uma seringa descartável estéril de 1 mililitro e uma agulha estéril de calibre 25 para encher a seringa de microinjeção de vidro com solução salina estéril. Em seguida, lave a solução salina através do dispositivo remontado. Em seguida, use uma nova seringa descartável estéril de um mililitro e uma agulha estéril de calibre 25 para encher a seringa de microinjeção com o inóculo de ágar.Em seguida, remonte o dispositivo e lave o ágar através do tubo apenas até que o tubo esteja completamente cheio de ágar. Depois de anestesiar o camundongo de acordo com o protocolo de texto, posicione o animal na mesma orientação demonstrada para o rato e use pressão constante, mas suave, para intubar a traqueia de maneira semelhante à do rato. Evite usar força, pois a técnica é mais delicada em camundongos.Certifique-se de que a cânula esteja inserida na traqueia sentindo os anéis traqueais. Gire levemente e avance a cânula para o brônquio esquerdo, inserindo-a profundamente no pulmão usando marcas-guia previamente colocadas. Com a cânula de metal no lugar, avance a tubulação de polietileno vários milímetros e instile 20 microlitros de suspensão de ágar.Aqui é mostrado um exemplo representativo de colônias crescendo em uma placa de ágar após diluição em série e triplicação de uma amostra de homogeneizado pulmonar. Conforme demonstrado neste gráfico com S. pneumoniae, um aumento na carga bacteriana de várias UFC de base logarítmica dez acima dos controles basais é normalmente observado em pulmões infectados para a maioria dos isolados bacterianos, mesmo 96 horas após a infecção, e a variabilidade entre os animais é baixa. Neste experimento, dois compostos foram avaliados contra isolados de S. pneumoniae suscetíveis ou resistentes a quinolonas para ilustrar que este modelo de infecção pulmonar pode ser usado durante a otimização de uma série química de chumbo para apoiar as relações de atividade da estrutura.Cada símbolo representa UFC determinado a partir dos pulmões de um rato. Aqui são mostrados os modelos E max criados usando dados de eficácia de variação de dose em camundongos imunocompetentes infectados no pulmão com isolados de S. pneumoniae ou H. influenzae para determinar alvos farmacocinéticos e farmacodinâmicos para um novo inibidor de polipeptídeo deformilase. Os círculos representam a carga bacteriana média de quatro a cinco camundongos por grupo tratado com doses variadas do composto.Os círculos abertos representam a área livre sob a curva e os círculos preenchidos representam a área sob a curva de tempo de concentração acima da concentração inibitória mínima. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de 30 segundos por animal, com até cinco ou seis animais inoculados por seringa de inóculo de ágar. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar esse método de infecção intrabrônquica não cirúrgica e ser capaz de utilizá-lo para estabelecer infecções pulmonares com muitos isolados bacterianos diferentes.Instrumental Energético

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Lenhard, A. et al. Um modelo camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença agravada pela idade. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um modelo de co-infecção em camundongos no qual o vírus da gripe desencadeia a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno. Ele descreve as etapas envolvidas na colonização bacteriana, infecção viral e progressão da doença.

Um modelo de camundongo para estudar a transição patogênica de Streptococcus pneumoniae após coinfecção viral

Este vídeo demonstra o estabelecimento de infecção pulmonar em um modelo de roedor imunocompetente por meio de intubação e instalação de suspensões bacterianas nos lobos pulmonares. Este modelo permite estudos de eficácia antibacteriana em animais imunocompetentes.

Instilação Intrabrônquica de Streptococcus pneumoniae em Modelos de Roedores Imunocompetentes

Streptococcus pneumoniae é o patógeno principal causador da pneumonia adquirida na comunidade grave e responsável por mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. O impacto dos fatores bacterianos implicados em fitness ou virulência pode ser monitorado em tempo real em uma pneumonia ou bacteremia modelo aguda mouse usando bactérias bioluminescentes.

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

Desenvolvemos um modelo de lesão pulmonar em camundongos por injeção intratraqueal da bactéria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo mimetiza a lesão pulmonar durante a pneumonia e é clinicamente relevante.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Pneumonia infecciosa é entre as infecções mais comuns em humanos. Um modelo apropriado na vivo é fundamental para compreender a patogênese da doença e testar a eficácia da terapêutica de romance. Com este modelo de pneumonia de aspiração orofaríngea murino, um pode examinar a patogênese e novos tratamentos contra essas infecções mortais.

Modelo murino aspiração orofaríngea da Pneumonia bacteriana associada e hospitalares

Aqui, nós apresentamos métodos para melhorar estudos secundários da pneumonia bacteriana fornecendo uma rota não invasora da instilação no intervalo respiratório mais baixo seguido pela recuperação do micróbio patogénico e pela análise do transcrito. Estes procedimentos são reprodutíveis e podem ser executados sem equipamento especializado tal como cânulas, fios de guia, ou cabos da fibra óptica.

Um sistema de entrega e recuperação de patógenos precisos para modelos murinos de pneumonia bacteriana secundária

Este manuscrito descreve o estabelecimento de um modelo infeccioso de pneumonia em camundongos e a respectiva caracterização da resolução da lesão juntamente com métodos de crescimento de bactérias e instilação intratraqueal. Uma nova abordagem usando citometria de fluxo de alta dimensão para avaliar a paisagem imune também é descrita.

Modelo experimental para avaliar a resolução da pneumonia

Este artigo descreve um novo modelo de camundongo para a transição de pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Este modelo pode ser facilmente adaptado para estudar interações polimicrobianas e patógeno-hospedeiro durante as diferentes fases de progressão da doença e em vários hospedeiros.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

Os camundongos são geralmente resistentes a infecções por Mycobacterium abscessus, o que complica a descoberta e o desenvolvimento de antibióticos muito necessários contra infecções pulmonares. Aqui, descrevemos um método de preparação de inóculo e infecção intratraqueal que demonstrou fornecer infecção sustentada em camundongos imunocompetentes.

Preparação de Mycobacterium abscessus embebido em grânulo de ágar para inocular camundongos imunocompetentes por via intratraqueal

Aprenda um método intrabronquial não cirúrgico para estabelecer pneumonia bacteriana robusta em roedores imunocompetentes. Esta técnica permite avaliar a eficácia de tratamentos antibacterianos em um modelo relevante de pneumonia grave.

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii (Vídeo) | JoVE Journal

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