Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii

O objetivo geral deste procedimento de infecção intrabrônquica não cirúrgica é estabelecer uma pneumonia bacteriana robusta em roedores imunocompetentes. Este método agrega valor para a descoberta e desenvolvimento de antibacterianos, permitindo que a eficácia de potenciais tratamentos seja avaliada em um modelo imunocompetente de pneumonia grave. A principal vantagem desta técnica é que ela estabelece uma infecção pulmonar robusta e reprodutível com muitos isolados, incluindo aqueles que normalmente requerem que os animais sejam neutropênicos ou isolados que não produzem uma infecção viável com outros métodos.

Geralmente, os indivíduos novos neste procedimento terão dificuldades. A intubação adequada é um procedimento cego que requer aprender a sensação certa para intubar a traqueia em vez do esôfago. A intubação adequada é diferente para cada cientista.

O ângulo exato da cânula pode não ser o mesmo para todos. Sentir as cristas da traqueia é a chave. Demonstrando essa técnica, estará Cindy Mininger, cientista do nosso laboratório.

Para começar, prepare suspensões bacterianas salinas de culturas de caldo durante a noite, conforme indicado no protocolo de texto, ou de placas de ágar, conforme demonstrado aqui. Colha o crescimento durante a noite das placas de ágar usando um laço estéril para raspar as colônias da superfície. Transfira o material colhido para cinco mililitros de solução salina estéril até obter uma suspensão turva e opaca e subtraia suavemente a cultura até ficar homogênea.

Diluir em série e colocar uma alíquota de cada diluição em placas de acordo com o protocolo de texto. Depois de preparar o ágar e montar as ferramentas necessárias para o processo de infecção, de acordo com o protocolo de texto, alíquota nove mililitros de ágar em um tubo estéril e, em seguida, coloque o tubo no banho-maria até que o ágar se equilibre em aproximadamente 42 graus Celsius. Adicione um mililitro da suspensão bacteriana salina previamente preparada no tubo de ágar.

Em seguida, inverta o tubo várias vezes para misturar e devolvê-lo à água. Coloque um tapete limpo e descartável na superfície de trabalho perto do banho-maria. Para preparar a superfície de trabalho e o dispositivo de intubação, primeiro esterilize a cânula de metal e o tubo de polietileno de acordo com o protocolo de texto e, em seguida, transfira-o em seu tubo de armazenamento de vidro para a superfície de trabalho.

Em seguida, remova a tampa do tubo de armazenamento e deslize a extremidade da alça da cânula até a extremidade aberta do tubo. Usando uma pinça estéril, remova um pedaço de tubo de polietileno do béquer e insira-o no interior da cânula de metal estéril, certificando-se de que ele se mova livremente. Coloque uma marca guia em um local predeterminado com caneta indelével.

Em seguida, encaixe uma agulha descartável estéril de calibre 25 na extremidade livre do tubo de polietileno, deslizando a agulha vários milímetros para dentro do tubo. Em seguida, use uma solução salina estéril para encher uma seringa descartável de um mililitro. Conecte a seringa à agulha encaixada no tubo de polietileno e lave todo o volume de solução salina através do tubo.

Descarte a seringa usada no recipiente para objetos cortantes. Em seguida, encha uma nova seringa descartável estéril de um mililitro com o inóculo à base de ágar do banho-maria. Recoloque a agulha e o tubo de calibre 25 e lave o ágar através do tubo pressionando o êmbolo apenas até que o tubo esteja completamente cheio de ágar.

Após anestesiar o rato de acordo com o protocolo de texto, coloque o animal em decúbito dorsal no tapete descartável com a cabeça voltada para a direita e a cauda voltada para a esquerda. Em seguida, insira a extremidade livre da cânula de metal na boca do animal. Gire a cânula de modo que a extremidade livre fique inclinada para cima e avance-a suavemente para dentro da traqueia, contornando cuidadosamente as estruturas laríngeas com um leve movimento de torção.

Confirme a inserção na traqueia, em oposição ao esôfago, deslizando suavemente a cânula levemente para frente e para trás várias vezes enquanto usa o dedo indicador esquerdo para palpar os anéis traqueais. Para garantir a intubação na traqueia, e não no esôfago, mova a cânula ligeiramente para frente e para trás e sinta as cristas. Se a cânula deslizar suavemente pela garganta e os sulcos não puderem ser sentidos, remova o dispositivo e tente novamente.

Quando a cânula atingir a bifurcação onde a traqueia se divide nos brônquios esquerdo e direito, faça um leve movimento de torção em direção ao lado esquerdo do animal para garantir que a cânula seja inserida no brônquio esquerdo. Um erro comum é não colocar o inóculo profundo o suficiente no pulmão, o que pode bloquear as vias aéreas e inibir a respiração. Quando a cânula é girada para o ângulo adequado, ela deve deslizar facilmente para o brônquio esquerdo e avançar suavemente até a profundidade apropriada.

Avance a cânula de metal até que a extremidade esteja na metade do pulmão esquerdo, usando a marca guia colocada anteriormente para confirmar que a profundidade apropriada foi atingida. Com a cânula de metal no lugar, avance o tubo de polietileno vários milímetros usando a marca guia previamente colocada no tubo para garantir que ele avance apenas o suficiente para sair da extremidade da cânula de metal e não perfurar o pulmão. Com ambas as cânulas no lugar, use a seringa anexada para instilar 100 microlitros de suspensão de ágar profundamente no lobo grande do pulmão esquerdo.

Retire vários milímetros da tubulação e remova cuidadosamente o dispositivo de intubação intacto. Coloque-o de volta no tubo de armazenamento de vidro e mova o animal para uma gaiola nova para se recuperar. Prepare a superfície de trabalho e a cânula como acabamos de demonstrar para ratos, usando o equipamento de tamanho apropriado para camundongos.

Use uma seringa descartável estéril de 1 mililitro e uma agulha estéril de calibre 25 para encher a seringa de microinjeção de vidro com solução salina estéril. Em seguida, lave a solução salina através do dispositivo remontado. Em seguida, use uma nova seringa descartável estéril de um mililitro e uma agulha estéril de calibre 25 para encher a seringa de microinjeção com o inóculo de ágar.

Em seguida, remonte o dispositivo e lave o ágar através do tubo apenas até que o tubo esteja completamente cheio de ágar. Depois de anestesiar o camundongo de acordo com o protocolo de texto, posicione o animal na mesma orientação demonstrada para o rato e use pressão constante, mas suave, para intubar a traqueia de maneira semelhante à do rato. Evite usar força, pois a técnica é mais delicada em camundongos.

Certifique-se de que a cânula esteja inserida na traqueia sentindo os anéis traqueais. Gire levemente e avance a cânula para o brônquio esquerdo, inserindo-a profundamente no pulmão usando marcas-guia previamente colocadas. Com a cânula de metal no lugar, avance a tubulação de polietileno vários milímetros e instile 20 microlitros de suspensão de ágar.

Aqui é mostrado um exemplo representativo de colônias crescendo em uma placa de ágar após diluição em série e triplicação de uma amostra de homogeneizado pulmonar. Conforme demonstrado neste gráfico com S. pneumoniae, um aumento na carga bacteriana de várias UFC de base logarítmica dez acima dos controles basais é normalmente observado em pulmões infectados para a maioria dos isolados bacterianos, mesmo 96 horas após a infecção, e a variabilidade entre os animais é baixa. Neste experimento, dois compostos foram avaliados contra isolados de S. pneumoniae suscetíveis ou resistentes a quinolonas para ilustrar que este modelo de infecção pulmonar pode ser usado durante a otimização de uma série química de chumbo para apoiar as relações de atividade da estrutura.

Cada símbolo representa UFC determinado a partir dos pulmões de um rato. Aqui são mostrados os modelos E max criados usando dados de eficácia de variação de dose em camundongos imunocompetentes infectados no pulmão com isolados de S. pneumoniae ou H. influenzae para determinar alvos farmacocinéticos e farmacodinâmicos para um novo inibidor de polipeptídeo deformilase. Os círculos representam a carga bacteriana média de quatro a cinco camundongos por grupo tratado com doses variadas do composto.

Os círculos abertos representam a área livre sob a curva e os círculos preenchidos representam a área sob a curva de tempo de concentração acima da concentração inibitória mínima. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de 30 segundos por animal, com até cinco ou seis animais inoculados por seringa de inóculo de ágar. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar esse método de infecção intrabrônquica não cirúrgica e ser capaz de utilizá-lo para estabelecer infecções pulmonares com muitos isolados bacterianos diferentes.

Instrumental Energético